Name: 芳香族アミノ酸によって制御される細胞代謝のバイオ直交化学イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T12:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: 学ぼう、重水プローブ刺激ラマン散乱顕微鏡と二光子励起蛍光顕微鏡を組み合わせた無標識イメージング法で、細胞内の芳香族アミノ酸制御代謝活動を可視化する手法です。高い化学特異性とサブ細胞分解能を達成し、がんや加齢に関連する代謝異常の研究に貢献します。

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技術サポートを提供してくださったYajuan Li博士とAnthony Fung博士、そして細胞株を提供してくれたFraleyラボに感謝します。UCSD、NIH U54CA132378、NIH 5R01NS111039、NIH R21NS125395、NIHU54DK134301、NIHU54 HL165443、ヘルマンフェロー賞からのスタートアップ資金に感謝します。

1. 培地調製
<ol><li>50%D2Oを含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)に10mLのコントロールおよび過剰のAAAを調製する。<ol><li>コントロール培地については、15 mLのコニカルチューブで10 mgのDMEM粉末を4.7 mLの二重蒸留水(ddH2O)と測定して混合します。DMEM粉末には、標準濃度のすべてのアミノ酸が含まれています。チューブを完全にボルテックスして反転させ、溶液がよく混合されていることを確認します。4.7 mLのD2O、0.5 mLのウシ胎児血清(5%FBS)、および0.1 mLのペニシリン/ストレプトマイシン(1%)を追加します。チューブを完全にボルテックスして反転させ、溶液がよく混合されていることを確認します。</li>
		<li>15x Phe処理培地の場合、10 mgのDMEM粉末を4.7 mLのddH2O、0.5 mLのFBS(5%)、および0.1 mLのペニシリン/ストレプトマイシン(1%)と15 mLのコニカルチューブで測定および混合します。チューブを完全にボルテックスして反転させ、溶液がよく混合されていることを確認します。924 mg/Lの濃度で過剰なPhe粉末を培地に加えます。チューブを完全にボルテックスして反転させ、溶液がよく混合されていることを確認します。</li>
		<li>15x Tryp処理培地の場合、10 mgのDMEM粉末を4.7 mLのddH2O、0.5 mLのFBS(5%)、および0.1 mLのペニシリン/ストレプトマイシン(1%)と15 mLのコニカルチューブで測定および混合します。チューブを完全にボルテックスして反転させ、溶液がよく混合されていることを確認します。224 mg/Lの濃度で過剰なトリップパウダーを培地に加えます。チューブを完全にボルテックスして反転させ、溶液がよく混合されていることを確認します。</li>
		<li>前のステップのすべての円錐管に、メチオニンとスレオニンをそれぞれ30.0 mg / mLと95.0 mg / mLで追加します。チューブを完全に渦巻いて反転させます。ピルビン酸ナトリウムは、培地に添加する必要はありません。</li>
		<li>0.22 μmポリエーテルスルホンメンブレンフィルターを備えた25 mmシリンジフィルターでコントロールおよび処理媒体をろ過します。</li>
		<li>すべてのメディアを含むコニカルチューブをパラフィルムで密封し、4°Cで最大3週間保管します。細胞を培地で処理する前に、すべての培地を37°Cに温めます。 注意: 粉末試薬と液体試薬は、処理媒体と対照媒体の総量に基づいて測定および組み合わせる必要があります。</li>
	</ol></li>
</ol>2. 細胞サンプルの調製
<ol><li>子宮頸がん(HeLa)細胞を培養フラスコ(T10、T25など)で維持し、10%FBSと1%ペニシリン/ストレプトマイシンを添加した標準DMEMを37°Cで、5%二酸化炭素(CO2)で維持します。</li>
	<li>HeLa細胞を1:10の分割比で、80%以上の細胞生存率に達するまで継代培養します。</li>
	<li>細胞が80%以上のコンフルエント性に達したら、0.5%FBSおよび1%ペニシリン/ストレプトマイシンを添加したDMEMを使用して、ウェルあたり2 x 105 細胞を24ウェルプレートに播種します。<ol><li>細胞播種の前に、滅菌済みのポリ-d-リジン、ラミニンコーティングされた直径12 mmの丸いカバースリップを含む24ウェルプレートを準備します。カバーガラスを70%エタノールに浸し、糸くずの出ないワイプを使用して穏やかに乾かします。きれいなカバーガラスをプレートの適切なウェルに置きます。</li>
		<li>ステップ2.2で細胞が80%のコンフルエントに達したら、マグネシウムイオンとカルシウムイオンを含まない1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を1回洗浄します。</li>
		<li>0.25%トリプシンを加えて接着細胞をフラスコから解離させ、37°Cおよび5%CO2 で3分間インキュベートします。</li>
		<li>10%FBSおよび1%ペニシリン/ストレプトマイシンを添加したDMEMを添加し、上下に穏やかにピペットで移動させ、室温(RT)で300 x g で3分間遠心分離して細胞を回収します。</li>
		<li>0.5%FBSおよび1%ペニシリン/ストレプトマイシンを添加したDMEMに細胞を再懸濁します。</li>
		<li>血球計算盤、光学顕微鏡、およびトリパンブルーを使用して細胞をカウントし、24ウェルプレートのウェルあたり2 x 105 細胞の密度を播種します。あるいは、自動セルカウンターを使用して細胞をカウントすることもできます。</li>
		<li>細胞を37°Cおよび5%CO2のインキュベーターに戻し、プレートを静かに振って細胞を均等に分配する。</li>
	</ol></li>
	<li>8時間後、古い培地を50%D2O/過剰Pheまたは50%D2O/過剰のトリップ培地と交換します。細胞を37°C、5%CO2 のインキュベーターに36時間戻す。</li>
	<li>36時間後、細胞を顕微鏡スライドに固定します。<ol><li>固定する前に、直径9 mmのイメージングスペーサーを備えた顕微鏡スライドを準備し、カルシウムイオンとマグネシウムイオンを添加した1x PBSを15 μL置きます。</li>
		<li>カルシウムイオンとマグネシウムイオンを添加した1x PBSで細胞をすすぎます。</li>
		<li>0.5 mLの4%メタノールフリーパラホルムアルデヒド(PFA)溶液を加え、プレートをバイオセーフティフードの下に約15分間放置します。</li>
		<li>PFA溶液を吸引し、カルシウムイオンとマグネシウムイオンを2回添加した1x PBSですすいでください。</li>
		<li>カルシウムイオンとマグネシウムイオンを添加した1.5 mLの1x PBSを各ウェルに追加します。</li>
		<li>滅菌ピンセットを使用して、各ウェルからカバーガラスをそっとつかみます。カバーガラスの細胞含有側を反転させてイメージングスペーサーに配置し、手順2.5.1で準備したPBSに接触させます。セルを含まない側が空気にさらされていることを確認してください。</li>
		<li>透明なマニキュアを使用して、カバーガラスの外層をイメージングスペーサーでシールします。</li>
	</ol></li>
	<li>顕微鏡スライドは、イメージングしないときは4°Cで保管してください。</li>
</ol>3. 自発ラマン分光測定(図2)
<ol><li>共焦点ラマン顕微鏡を使用して、自発ラマンスペクトルを取得します(図2A)。</li>
	<li>キーを オン の位置に回して、レーザーをオンにします。</li>
	<li>LabSpec6ソフトウェアアイコンをダブルクリックして、集録ソフトウェアを開きます。</li>
	<li>生体試料を対物レンズの真下のサンプルホルダーに装填します。</li>
	<li>ソフトウェアで、 をクリックします カメラ アイコン をクリックしてビデオカメラをオンにします。</li>
	<li>フォーカス面を調整して、50倍の対物レンズで関心領域を識別します。ジョイスティックを動かしてXYステージの平面移動を制御し、ジョイスティックを回転させて焦点深度を変更します。</li>
	<li>測定位置を選択したら、40mWの励起電力を備えた100倍の対物レンズに切り替えます。赤い [停止 ] アイコンをクリックして、ビデオ カメラの電源を切ります。</li>
	<li>1800ライン/mmのグレーティングを選択し、取得範囲を400 cm-1から3,150 cm-1に設定します。</li>
	<li>アクイジション時間を90秒、累積時間を3秒、ビニングを4に設定すると、ノイズが最も少なく、スペクトラムの精度が最も高くなります。 注:これらのイメージングパラメータは、実験に合わせて最適化できます。</li>
	<li>矢印アイコンをクリックして、リアルタイム表示をオンにします。</li>
	<li>ラマンシフト(cm-1)を選択した値に調整して、フォーカス面を微調整します。 注:この実験では、ラマンレーザーを、高濃度のCH2結合を含む脂肪滴に集束させた。そこで、CH2結合の延伸モードに合致した2,850cm-1のラマンシフトを目的に選定した。</li>
	<li>ジョイスティックでフォーカスプレーンを調整して、最適な信号対雑音比を最適化します。</li>
	<li>フォーカス面を選択したら、赤い 停止 アイコンをクリックしてリアルタイム表示します。</li>
	<li>円アイコンを選択して、スペクトル取得を開始します。</li>
	<li>細胞領域を撮影したら、同じフォーカス面を使用してPBSで背景を測定します。Originなどの個別のコンピュータソフトウェアアプリケーションを使用して、各サブセルラーターゲットスペクトルからバックグラウンドスペクトルを差し引きます(図1B)。</li>
</ol>4. 2PEFとSRSを用いたイメージング実験
注:SRSレーザーアライメントの詳細な説明は、以前のレポート28に記載されています。このプロトコルは、マルチモーダルSRSおよび2PEFイメージングシステムの動作に焦点を当てています(図2C、D)。
<ol><li>クリック 開始 レーザーをウォームアップします。</li>
	<li>指示に従って、コントロールユニットとモニターのメインスイッチをオンにします:1)コントロールボックスIX3-CBHのメインスイッチをオンに押し、2)タッチパネルコントローラーのメインスイッチをオンにし、3)メインレーザーコンバイナーFV31-SCOMBに接続されたLDOBIS 6レーザーリモートの電源のACアダプターのメインスイッチをオンにします、4)サブレーザーコンバイナーFV31-COMBに接続されているLD OBIS 6レーザーリモートの電源のACアダプターのメインスイッチをONにします。</li>
	<li>Siフォトダイオード検出器とロックインアンプのメインスイッチを押します amp。</li>
	<li>ストークスビームを1,031nm、パルス幅を6ps、繰り返し周波数を80MHzに設定します。</li>
	<li>顕微鏡に結合して、波長720〜990nm、パルス幅5〜6ps、繰り返し速度80MHzの同期ポンプビームが供給されるピコエメラルドシステムを設定します。ポンプとストークスの両方の平均励起電力は450mWです。励起パワーを最適化して、サンプルの光損傷を最小限に抑えます。</li>
	<li>高開口数(NA)オイルコンデンサー(つまり、1.4 NA)を使用して、コンデンサーに数滴を放出することにより、サンプルが取り付けられているストークスとポンプビームを収集します。</li>
	<li>サンプルをオイルにマウントし、サンプルが固定されている顕微鏡スライドの上に大きな水滴を置きます。水浸対物レンズ用です。</li>
	<li>ロックインアンプを20MHzに設定し、超解像ソフトウェアモジュールを使用して画像を処理します。</li>
	<li>滞留時間には512ピクセルx512ピクセルと80μs/ピクセルを選択します。</li>
	<li>目的の細胞領域が適切に焦点を合わせられたら、画像を取得します。顕微鏡の取得ソフトウェアを使用して、画像をオリンパスの.oirグラフィックファイルとして保存します。</li>
	<li>1,900 cm-1 の背景画像を取得し、すべてのセルラー画像から減算します。</li>
	<li>2PEFイメージングを行うには、同じチューナブルピコ秒レーザーを使用し、フラビンとNADHのラベルフリー自家蛍光をそれぞれ800 nmと780 nmに設定します。</li>
	<li>460 nm/515 nmのフィルターキューブを使用して、フラビンおよびNADHの自家蛍光後方散乱放射を収集します。</li>
	<li>滞留時間を 8 μs/ピクセルに、ピクセル サイズを 512 ピクセル x 512 ピクセルに調整します。レーザーシャッター出力パラメータを150mWに設定します。</li>
	<li>3D画像再構成の場合は、誘導ラマン損失を2,850 cm-1 (797 nm)に調整します。</li>
	<li>目的の単一細胞が特定されたら、レーザーを登録して上焦点面からスキャンし、それらの細胞の最上層と最下層を検出します。 注: 3D モデルが生成され、.oir ファイルとして保存されます。</li>
</ol>5. スペクトルと画像解析
<ol><li>スペクトル解析<ol><li>Originソフトウェアまたはその他の関連アプリケーションを使用して、すべての細胞内ターゲットスペクトルからバックグラウンドスペクトルを差し引きます。</li>
		<li>MATLABの数学的モデリング操作を使用して、ソフトウェアの組み込み関数でラマンスペクトルを処理します。Pythonはスペクトル処理にも使用できます。<ol><li>スペクトルの前処理は、ファイルを配列に変換することから始まります。スペクトルは、すべての逆センチメートルで補間されます。</li>
			<li>検証のために、生データをグラフ化します。MATLAB の組み込み関数 msbackadj を使用して、生のスペクトルのベースライン補正を実行します。簡単に言うと、組み込み関数は、ユーザーが識別した分離単位値でベースラインポイントを推定し、隣接するウィンドウ間の距離を返します。ベースラインポイントから、回帰直線を推定して描画します。 スムージング を適用して回帰直線を平滑化し、個々の生スペクトルからベースラインを減算します。</li>
			<li>2,930 cm-1におけるタンパク質のラマン強度を各ラマンシフトの強度で割ることにより、min-max 正規化を実行します。2,930 cm-1 の信号は、通常、ラマンスペクトル上で最も高い強度です。この正規化では、最大値は 1 に変換され、最小値は 0 に変換されます。他のすべての値は、0 から 1 までの 10 進数に変換されます。</li>
			<li>同じ条件の個々のスペクトルを単一のスペクトルに平均化して、ノイズを低減します。</li>
		</ol></li>
		<li>処理が完了したら、Originなどのアプリケーションを使用して、すべてのスペクトルを同時に表示します。スペクトルに表示されるピークは、特定の化学結合または官能基を表します。</li>
	</ol></li>
	<li>脂肪滴の3D画像解析<ol><li>FIJI-ImageJソフトウェアを使用してすべての3D画像を処理する</li>
		<li>3D画像スタックの バンドパスフィルター と スムージング の機能を実行します。</li>
		<li>3D画像解析では、各脂肪滴を、その重心から表面までの距離を測定することによって計算された球面スコアに割り当てます。各球面スコアを、同じユークリッド平面上の完全な球面の球面スコアと比較します。球状スコアの低い脂肪滴を廃棄し、残りの脂肪滴の量と数を評価します。</li>
		<li>適切な統計ソフトウェアアプリケーションで統計的有意性を得るために、異なる処理間の脂肪滴の量と数を分析します。ここでは、グラフパッドプリズムを使用しました。</li>
	</ol></li>
	<li>2Dハイパースペクトル画像解析<ol><li>FIJI-ImageJソフトウェアを使用して、すべての2Dハイパースペクトル画像を処理します。</li>
		<li>2,930 cm-1 チャンネルを選択して、0 と 1 の値を含むマスク画像を作成します。背景を 0 に、セルラー領域を 1 に割り当てます。</li>
		<li>重水素標識タンパク質チャネル(2,175 cm-1)をバックグラウンドチャネル(1,900 cm-1)に減算して、蛍光効果を除去します。</li>
		<li>得られた重水素標識タンパク質チャネルをタンパク質チャネル(2,930 cm-1)で除し、タンパク質代謝回転率レシオメトリック画像を取得します。</li>
		<li>次に、手順5.3.2で作成したマスク画像にレシオメトリック画像を掛けて、残っているバックグラウンドノイズを取り除きます。その結果、各レシオメトリック画像に暗い背景が生成されます。</li>
		<li>FIJI-ImageJの フリーハンド選択 ツールを使用して、単一セルに表示されるピクセル強度を手動でセグメント化して計算します。ピクセル強度は、視覚化されている化学結合の濃度に対応します。</li>
		<li>適切な統計ソフトウェアアプリケーションで統計的有意性のピクセル強度を分析します。ここでは、グラフパッドプリズムを使用しました。残りのレシオメトリック分析でこの分析を繰り返します。</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Chang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+monitoring+of+cell+metabolism+and+lipid+production+in+3D+engineered+human+adipose+tissues+using+label-free+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Non-invasive monitoring of cell metabolism and lipid production in 3D engineered human adipose tissues using label-free multiphoton microscopy.</a> Biomaterials. 34 (34), 8607-8616 (2013).</li>
<li>Leica TCS SP8 CARS CARS Microscope - Label Free Imaging. Leica Microsystems. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-cars/downloads/">https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-cars/downloads/</a> (2023).</li>
</ol>

著者には、競合する金銭的利益またはその他の利益相反はありません。

DO-SRSおよび2PEFイメージングは、ショウジョウバエおよびヒト組織を含む様々なex vivoモデルにおける代謝動態を調べるために適用されている21,22,23,24,26,27,33。この研究で使用されたイメージングモダリティは、DO-SRSと2PEF顕微鏡を統合しており、分子抽出や細胞毒性試薬による標識の必要性を排除し、最小限のサンプル調製で済むため、他の分子特異的イメージング法を凌駕することができます。具体的には、DO-SRS顕微鏡は、動物や細胞におけるde novo脂質生成とタンパク質合成を調べ、その場でそれらの...

必須の芳香族アミノ酸(AAA)であるフェニルアラニン(Phe)とトリプトファン(Tryp)は、人体に吸収されて、正常な生物学的機能を維持するための新しい分子を合成することができます1。Pheはタンパク質、メラニン、チロシンの合成に必要であり、Trypはメラトニン、セロトニン、ナイアシンの合成に必要です2,3。しかし、これらのAAAの過剰摂取は、ラパマイシン(mTOR)経路の哺乳類標的をアップレギュレートし、AMP活性化プロテインキナーゼを阻害し、ミトコンドリア代謝を妨害し、高分子生合成を集合的に変化させ、健康な細胞における活性酸素種(ROS)などの悪性前駆体の産生につながる可能性があります4,5,6.過剰なAAA調節下での変化した代謝動態の直接的な可視化は、がんの発生と健康な細胞の成長を促進するAAAの役割を理解するために不可欠です7,8,9。
従来のAAA研究は、ガスクロマトグラフィー(GC)10に依存しています。磁気共鳴画像法(MRI)などの他の方法は、空間分解能が制限されており、生物学的試料の細胞および細胞内分析を行うことを困難にしている11。最近、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化(MALDI)が開発され、非侵襲的バイオマーカーを用いて癌増殖における脂質およびタンパク質合成におけるAAAの役割を解明しました12,13,14。ただし、この手法では、イメージング深度が浅く、空間分解能が低く、サンプル調製が不十分です。細胞レベルでは、窒素15や炭素13などの無毒の安定同位体をマルチ同位体イメージングとナノスケールの二次イオン質量分析で追跡し、高分子への取り込みを理解することができます。しかしながら、これらの方法は、生きた生物学的試料に対して破壊的である15、16。原子間力顕微鏡(AFM)は、代謝動態を視覚化できるもう17つの強力な技術です。一方、AFMイメージング中のスキャン速度が遅いと、熱ドリフトによる結果の画像歪みが発生する可能性があります。
我々は、酸化重水素(D2O)プローブ誘導ラマン散乱(DO-SRS)顕微鏡とラベルフリー2光子励起蛍光顕微鏡(2PEF)を組み合わせることにより、非侵襲的な双直交イメージングモダリティを開発しました。このモダリティは、生物学的試料を画像化する際に高い空間分解能および化学的特異性を達成する18、19、20、21、22、23、24。このプロトコルでは、がんの進行に伴う脂質、タンパク質、および酸化還元比の変化の代謝動態を調べるためのDO-SRSおよび2PEFのアプリケーションを紹介します。D2Oは水の安定同位体形態であり、細胞内の全身水分との迅速な補償により、細胞生体分子は重水素(D)で標識され、酵素交換を介して炭素-重水素(C-D)結合を形成することができる21。脂質、タンパク質、DNA/RNA、炭水化物など、新たに合成された高分子のC-D結合は、ラマンスペクトル20,21,22,25,26,27の細胞サイレント領域で検出できます。2つの同期レーザーパルスにより、新たに合成された脂質とタンパク質のC-D結合を、細胞毒性物質で抽出または標識することなく、ハイパースペクトルイメージング(HSI)を介して単一細胞上に表示できます。加えて、SRS顕微鏡は、一組の断面画像を捕捉して組み合わせることによって、生物学的試料中の選択された関心領域の3次元(3D)モデルを構築する能力を有する22、26。ハイパースペクトルおよび3D体積イメージングにより、DO-SRSは、AAA規制22の下で癌の成長を促進するプロセスを促進する細胞小器官のタイプとともに、単一細胞で新しく合成された高分子の空間分布を取得できます。さらに、2PEFを使用すると、生体サンプル中のフラビンおよびニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)の自己蛍光シグナルを、高分解能、深い浸透深さ、および低レベルの損傷で取得できます21、23、24。フラビンおよびNADHの自己蛍光シグナルは、癌細胞における酸化還元恒常性および脂質過酸化を特徴付けるために使用されています22,26。このように、DO-SRSと2PEFのカップリングは、高い空間分布、化学的特異性情報、および最小限のサンプル調製で、癌細胞におけるAAA調節代謝動態の細胞内分析を提供するだけでなく、内因性分子を毒性試薬で抽出または標識する必要性も低減します。このプロトコールでは、まずD2Oおよびアミノ酸調製、ならびに癌細胞培養の手順を提示する。次に、DO-SRSイメージングと2PEFイメージングのプロトコルを示します。最後に、AAA制御による脂質やタンパク質の代謝変化、がん細胞の酸化還元比変化などを示すSRSと2PEFイメージングの代表的な結果を紹介します。このプロセスの詳細な図を図 1 に示します。

<table><tbody><tr><td>10 mLの血清学的ピペット&nbsp;</td><td>Avantor (VWR製)</td><td>75816-100</td><td>https://us.vwr.com/store/product?keyword=75816-100</td></tr><tr><td>15 mL 円錐形遠心分離管</td><td>VWR</td><td>89039-664</td><td>https://mms.mckesson.com/product/1001859/VWR-International-89039-664</td></tr><tr><td>16% ホルムアルデヒド、メタノールフリー</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>28906</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/28906</td></tr><tr><td>24 ウェルプレート</td><td>Fisherbrand</td><td>FB0112929</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/24-well-tc-multidish-100-cs/FB012929#?keyword=FB012929</td></tr><tr><td>25 mm シリンジ フィルター、2 &mu;m PES</td><td>Foxx Life Sciences</td><td>381-2216-OEM</td><td></td></tr><tr><td>https://www.foxxlifesciences.com/collections/pes-syringe-filters/products/381-2216-oem?variant=16274336003 460 nm フィルターキューブ</td><td>オリンパス</td><td></td><td>OCT-ET460/50M32</td></tr><tr><td>AC アダプター LD OBIS 6 レーザー リモート</td><td>オリンパス</td><td></td><td>レーザー</td></tr><tr><td>バンドパス フィルター</td><td>KR エレクトロニクス</td><td>KR2724</td><td>8 MHz への電源供給</td></tr><tr><td>BNC 50 Ω ターミネーター&nbsp;</td><td>小型回路</td><td>STRM-50</td><td></td></tr><tr><td>BNCケーブル</td><td>Thorlabs</td><td>2249-C</td><td>同軸ケーブル、BNCオス/オス</td></tr><tr><td>広帯域誘電体</td><td>ミラーThorlabs</td><td>BB1-E03</td><td>750 - 1100 nm</td></tr><tr><td>遠心分離</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>機コンデンサー</td><td>オリンパス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>カバーガラス</td><td>コーニング</td><td>2850-25</td><td>https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2b/NL/en/Glassware/Cover-Glass/Corning%C2%AE-Square-%231%C2%BD-Cover-Glass/p/2850-25</td></tr><tr><td>DC電源</td><td>TopWard</td><td>6302D</td><td></td></tr><tr><td>Dichroic Mount</td><td>Thorlabs</td><td>KM100CL</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide Cell Culture Reagent</td><td>mpbio&nbsp;</td><td>196055</td><td></td></tr><tr><td>https://www.mpbio.com/0219605525-dimethyl-sulfoxide-cf ダルベッコのモディファイド イーグル」メチオニン、スレオニン、ピルビン酸ナトリウムを含まないミディア</td>ムミリ<td>ポアSigma</td><td>38210000</td><td>https://www.usbio.net/media/D9800-22/dulbeccorsquos-mem-dmem-wsodium-bicarbonate-wo-methionine-threonine-sodium-pyruvate-powder 重炭酸ナトリウムを含み、メチオニン、スレオニン、ピルビン酸ナトリウムを含まない&nbsp;</td></tr><tr><td>ダルベッコのモディファイドイーグル」s Medium</td><td>Corning</td><td>MT10027CV</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/dmem-dulbecco-s-modified-eagle-s-medium-4/MT10027CV#:~:text=Dulbecco's%20Modified%20Eagle's%20Medium%20</td></tr><tr><td>FIJI ImageJ</td><td>ImageJ</td><td>Version 1.53t 2022年8月24</td>日 <td>https://imagej.net/software/fiji/downloads</td></tr><tr><td>重水(酸化重水素)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories, Inc.</td><td>7732-18-5</td><td>https://shop.isotope.com/productdetails.aspx?itemno=DLM-4-1L</td></tr><tr><td>Hela Cells</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td>https://www.atcc.org/products/ccl-2</td></tr><tr><td>Hemocymeter</td><td>MilliporeSigma</td><td>Z359629-1EA</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/z359629?gclid=Cj0KCQiA37KbBhDgARIsAI zce15A5FIy0WS7I6ec2KVk QPXVMEqlAnYis_bKB6P6lr SIZ-wAXOyAELIaAhhEEAL w_wcB&gclsrc=aw.ds</td></tr><tr><td>高外径バンドパスフィルター</td><td>クロマテクノロジー</td><td>ET890/220m</td><td>ストークスビームをフィルターし、ポンプビームを送信</td></tr><tr><td>HyClone Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Cytiva&nbsp;</td><td>SH300880340</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/hyclone-fetal-bovine-serum-u-s-standard-4/SH300880340</td></tr><tr><td>HyClone Trypsin 0.25% (1x) Solution</td><td>Cytiva</td><td>SH30042.02</td><td>https://www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/cell-culture-and-fermentation/reagents-and-supplements/cell-disassociation-reagents/hyclone-trypsin-protease-p-00445</td></tr><tr><td>Integrated SRS Laser System</td><td>応用物理学 &エレクトロニクス株式会社</td><td>picoEMERALD</td><td>picoEMERALDは、1031nmのパルス幅6ps、繰り返し周波数80MHzの出力パルスを提供し、これがストークスビームとして機能します。&nbsp;532 nm の周波数倍増ビームを使用して、ピコ秒光パラメトリック発振器 (OPO) を同期的にシードし、パルス幅が 5~6 ps のモードロック パルス列を生成します (OPO のアイドラー ビームは干渉フィルターでブロックされます)。OPOの出力波長は720°dashから調整可能です。950nm、これはポンプビームとして機能します。1031 nmのストークスビームの強度は、8 MHzの内蔵EOMによって正弦波に変調され、変調深度は90%を超えます。ポンプビームは、ピコエメラルド内部のダイクロイックミラーを使用して、ストークスビームと空間的に重なっています。ポンプパルスとストークスパルスの時間的オーバーラップは、内蔵の遅延ステージで達成され、顕微鏡での純粋なD2OのSRS信号によって最適化されます。</td></tr><tr><td>倒立型レーザー走査型顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>FV1200MPE</td><td></td></tr><tr><td>IX3-CBH コントロールボックス</td><td>オリンパス</td><td></td><td>レーザー走査型顕微鏡を制御</td></tr><tr><td>キネマティックミラーマウント</td><td>Thorlabs</td><td>POLARIS-K1-2AH</td><td>2 ロープロファイル六角アジャスター</td></tr><tr><td>L-フェナリナイン</td><td>シグマ</td><td>P5482-25G</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p5482</td></tr><tr><td>L-トリプトファン</td><td>Σ</td><td>T8941-25G</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/t8941</td></tr><tr><td>LabSpec 6</td><td>堀場製作所 XploRA</td><td>該当なし</td><td></td></tr> <tr><td>https://www.horiba.com/gbr/scientific/products/detail/action/show/Product/labspec-6-spectroscopy-suite-software-1843/ ロックインアンプ</td><td>チューリッヒインスツルメン</td>ツ <td>該当なし</td><td>https://www.zhinst.com/americas/en/products/shfli-lock-in-amplifier</td></tr><tr><td>ロングパス ダイクロイック ビーム スプリッター</td><td>Semrock</td><td>Di02-R980-25x36</td><td>980 nm レーザー BrightLine シングルエッジ レーザーフラット ダイクロイック ビームスプリッター</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>バージョン: R2022b</td><td>https://www.mathworks.com/products/new_products/latest_features.html</td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>フィッシャーブランド</td><td>12-550-003</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-selectfrost-microscope-slides-9/12550003#?keyword=12-550-003</td></tr><tr><td>顕微鏡イメージングソフトウェア</td><td>Olympus</td><td>FluoView</td><td></td></tr><tr><td>MPLN 100x, Olympus</td><td></td><td>Olympus MPLAPON</td><td>https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11364</td></tr><tr><td>MPLN 50x, Olympus</td><td>Olympus</td><td>MPLAPON&nbsp;</td><td>https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[フォーカス]=cmsContent11363</td></tr><tr><td>NAオイルコンデンサー</td><td>オリンパス&nbsp;</td><td>6-U130</td><td>https://www.hitechinstruments.com/Product-Details/olympus-achromatic-aplanatic-high-na-condneser</td></tr><tr><td>ネイルポリッシュ</td><td>ウェット アンド ワイルド</td><td>B01EO2G5O4</td><td>https://www.amazon.com/dp/B01EO2G5O4/ref=cm_sw_r_api_i_E609VVDWW HHQP38FXXDC_0</td></tr><tr><td>OriginLab</td><td></td><td>Origin 2022b (9.95)</td><td>https://www.originlab.com/index.aspx?go=PRODUCTS/Origin</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>S37440</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/p-2379782</td></tr><tr><td>PBS 1x (ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水)</td><td>サーモフィッシャー - Gibco</td><td>14040117</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040117?SID=srch-hj-14040117</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>サーモフィッシャー - Gibco</td><td>15140122</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122</td></tr><tr><td>ペリスコープ アセンブリ</td><td>Thorlabs</td><td>RS99</td><td>上部と下部のユニット、&Oslash が含まれています。1インチのポスト、およびクランプフォーク。</td></tr><tr><td>picoEmerald System</td><td>A.P.E</td><td>N/A</td><td></td></tr> https://www.ape-berlin.de/en/cars-srs/ <tr><td>シールドボックス BNCコネクタ付き</td><td>Pomona Electronics</td><td>2902</td><td>アルミボックス カバー付き、BNC メス/メス</td></tr><tr><td>Si フォトダイオード検出器</td><td>ホームビルト</td><td>N/A</td><td>DYIシリーズ</td></tr><tr><td>シリコンウェーハ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>スペーサー</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>654008</td><td></td></tr><tr><td>https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654008/ 自発的ラマン分光</td>法 <td>Horiba XploRA</td><td>N/A</td><td></td></tr> <tr><td>https://www.horiba.com/int/products/detail/action/show/Product/xploratm-plus-1528/ 誘導ラマン散乱顕微鏡</td><td>自作</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>タッチ&nbsp;パネルコントローラー</td><td>オリンパス</td><td></td><td>レーザー走査型顕微鏡トリパンブルーのX-Y方向を制御</td></tr><tr><td>0.4% (0.85% NaCl)&nbsp;</td><td>ロンザ</td><td>17-942E</td><td>https://bioscience.lonza.com/lonza_bs/US/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000181876/Trypan-Blue%2C-0-4%25-Solution"</td></tr><tr><td>ピンセット</td><td>Kaverme - アマゾン</td><td>B07RNVXXV1</td><td>https://www.amazon.com/Precision-Anti-Static-Electronics-Laboratory-Jewelry-Making/dp/B07RNVXXV1"</td></tr><tr><td>2光子励起蛍光顕微鏡</td><td>ホームビルド</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>計量ペーパー&nbsp;</td><td>VWR</td><td>12578-165</td><td></td></tr><tr><td>https://us.vwr.com/store/product/4597617/vwr-weighing-paper Zurich LabOneQ ソフトウェア</td><td>チューリッヒ機器</td><td></td><td>はチューリッヒのロックインアンプを制御します</td></tr></tbody></table>

芳香族アミノ酸によって制御される細胞代謝のバイオ直交化学イメージング

Bioorthogonal Chemical Imaging of Cell Metabolism Regulated by Aromatic Amino Acids

必須芳香族アミノ酸(AAA)は、細胞内で新しいバイオマスを合成し、正常な生物学的機能を維持するための構成要素です。例えば、AAAの豊富な供給は、癌細胞が急速な成長と分裂を維持するために重要です。これに伴い、細胞がその 場での代謝のためにAAAをどのように利用しているかを直接視覚化するために、最小限のサンプル調製で高度に特異的で非侵襲的なイメージングアプローチに対する需要が高まっています。ここでは、酸化重水素(D2O)プロービングと誘導ラマン散乱(DO-SRS)を組み合わせた光学イメージングプラットフォームを開発し、DO-SRSと2光子励起蛍光(2PEF)を1つの顕微鏡に統合して、AAA制御下でのHeLa細胞の代謝活動を直接可視化します。DO-SRSプラットフォームは、単一のHeLa細胞ユニットで新たに合成されたタンパク質と脂質の高い空間分解能と特異性を提供します。さらに、2PEFモダリティは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)およびフラビンの自己蛍光シグナルをラベルフリーで検出できます。ここで説明するイメージングシステムは、in vitro モデルと in vivo モデルの両方に対応しており、さまざまな実験に柔軟に対応します。このプロトコルの一般的なワークフローには、細胞培養、培地調製、細胞同期、細胞固定、およびDO-SRSおよび2PEFモダリティによるサンプルイメージングが含まれます。

50%D2O含有細胞培養培地に15倍の濃度で過剰のAAAを添加すると、HeLa細胞において新たに合成された脂質およびタンパク質の明確なC-Dラマンバンドが生じた(図2B)。以前の実験は、2倍や5倍などの異なる濃度レベルで行われ、データは提示されていませんが、15倍の濃度は、新しく合成された脂質とタンパク質の最も明確なC-Dラマンバンドを生成しました。具体的には、脂肪滴(LD)を調べることにより、15x Pheと15x Trypの両方が、それぞれ2,143 cm-1 と2,172 cm-1で新しく合成された脂質とタンパク質シグナルを誘導することを発見しました。その後、DO-SRSを使用して、単一細胞上のC-Dシグナルの空間分布を視覚化しました(図3)。ImageJを使用して、 図3Aの白い点線の境界線で示されているように、個々のセルのピクセル強度を手動でセグメント化して計算しました。コントロール細...

2光子励起蛍光顕微鏡(2PEF)と統合された酸化重水素(重水D2O)プローブ誘導ラマン散乱(DO-SRS)顕微鏡を使用して、アミノ酸によって制御される細胞の代謝活動を直接視覚化するプロトコルを提示します。

Essential aromatic amino acids (AAAs) are building blocks for synthesizing new biomasses in cells and sustaining normal biological functions. For example, ...

ラベルフリー機能、高い化学的特異性、および細胞内分解能を備えた新しいイメージング技術を紹介します。私たちの方法論は、老化や癌などの疾患における代謝機能障害に関する質問に答えることができます ラマンイメージングは、2光子蛍光と第2高調波発生と組み合わせて、最小限のサンプル調製で済み、細胞サンプルに損傷を与えることなく高い細胞内分解能を達成する非破壊でラベルフリーのイメージング技術を提供します。いくつかのイメージングモダリティは、当社のプラットフォームの一部として運用されています。個人は、私たちのシステムが自家製であることに注意して、可能な限り私たちのプロトコルに従う必要があります。その過程で、彼らは成功を確実にするために彼ら自身の実践を開発するべきです。2つの別々のチューブで、15 mLのコニカルチューブ内で10ミリグラムのDMEM粉末と4.7ミリリットルの二重蒸留水を測定して混合することから始めます。チューブを完全にボルテックスして反転させ、溶液がよく混合されていることを確認します。両方のチューブに、チューブをボルテックスして反転させる前に、4.7 mLの酸化重水素、0.5 mLのFBS、および0.1 mLのペニシリンとストレプトマイシンを追加します。次に、1つのチューブに過剰なフェニルアラニンを追加し、2番目のチューブに過剰なトリプトファン粉末を加えて、再度混合します。メチオニンとスレオニンをそれぞれ30 mg/mLと95 mgで両方のチューブに加え、続いてチューブをボルテックスして反転させます。その後、調製した培地を0.22マイクロメートルのフィルターを備えた25ミリメートルのシリンジフィルターでろ過します。円錐管を含むすべてのメディアをパラフィルムで密封します。準備した培地は摂氏4度で保管してください。10%FBS、1%ペニシリンおよびストレプトマイシンを添加した標準DMEMを使用して、培養フラスコ内でヒーラー細胞を維持します。80%以上の細胞生存率に達するまで、1対10の分割比でヒーラー細胞を継代培養します。細胞を播種する前に、滅菌したポリ-D-リジン、ラミニンコーティングされた直径12 mmの丸いカバースリップを70%エタノールに浸しました。糸くずの出ないワイプを使用してカバースリップを乾かし、きれいなカバースリップをプレートの適切なウェルに入れます。マグネシウムイオンとカルシウムイオンを含まないPBSで細胞を一度洗浄します。0.25%トリプシンを加えて接着細胞をフラスコから解離させ、摂氏37度、5%二酸化炭素で3分間インキュベートします。次に、10%FBS、1%ペニシリン、およびストレプトマイシンを添加したDMEMを細胞に追加します。ゆっくりと上下にピペットで動かします。室温で3分間300Gで遠心分離することにより細胞を収集します。次に、0.5%FBSおよび1%ペニシリンおよびストレプトマイシンを添加したDMEMに細胞を再懸濁する。光学顕微鏡下で血球計算盤を用いてトリパンブルー染色細胞を計数し、24穴プレートのウェルあたり5番目の細胞に10倍の2倍の密度で播種した。プレートを軽く振って細胞を均等に分配します。摂氏37度と5%二酸化炭素でインキュベートします。8時間後、古い培地を50%の酸化重水素と過剰のフェニルアラニンまたは50%の酸化重水素と過剰なトリプトファン培地と交換します。細胞を摂氏37度、5%二酸化炭素で36時間インキュベーターに戻します。次に、直径9mmのイメージングスペースを備えた顕微鏡スライドを準備します。カルシウムイオンとマグネシウムイオンを補給した15マイクロリットルのPBSを入れ、同じ溶液で細胞をすすぎます。4%メタノールフリーのパラホルムアルデヒド溶液を0.5 mL加え、プレートをバイオセーフティフードの下に15分間放置します。パラホルムアルデヒド溶液を吸引し、カルシウムとマグネシウム鉄を2回補給したPBSですすいでください。カルシウムイオンとマグネシウムイオンを添加した1mLのPBSを各ウェルに加えます。滅菌ピンセットを使用して、各ウェルからカバースリップを慎重に取り外します。それらを反転させ、PBSと接触しているイメージングスペースにセル含有側を配置します。透明なマニキュアを使用して、イメージングスペーサーでカバースリップの外層をシールします。生体試料を対物レンズの真下のサンプルホルダーに装填します。次に、ソフトウェアのカメラアイコンをクリックしてビデオカメラの電源を入れ、フォーカス面を調整して50倍対物レンズで関心領域を識別します。100倍の対物レンズに切り替えます。停止アイコンをクリックして、ビデオカメラの電源を切ります。次に、1 mm あたり 1 , 800 行の格子を選択し、取得範囲を 400 から 3, 150 センチメートルの逆に設定します。最後に、アクイジション時間を90秒、累積時間を3秒、ビニングを4秒に設定して、ノイズを最小限に抑え、スペクトルを最も正確にします。開始をクリックしてレーザーをウォームアップします。コントロールボックスIX3CBHのメインスイッチをオンにしてから、タッチパネルコントローラーのメインスイッチを押すことから始めます。次に、メインレーザーコンバイナーFV31Sコームに接続されたレーザーリモコンの電源LDOBIS6 ACアダプターのメインスイッチをオンにします。また、サブレーザーコンバイナーFV31Sコームに接続されているLDOBIS6レーザーリモート電源のACアダプターをオンにします。その後、SIフォトダイオード検出器のメインスイッチとロックインアンプをオンにします。レーザーIRを1031ナノメートルに設定します ピコエメラルドシステムを720〜990nmの調整可能な波長に設定します。サンプルをオイルにマウントし、サンプルが固定されている顕微鏡スライドに大きな水滴を置きます。[スキャン サイズ] を [512 x 512 ピクセル] として選択します。画像を取得してオリンパスとして保存します。OIR グラフィック ファイル。信号を862.0に設定した後、背景画像を取得して保存します。滞留時間をピクセルあたり 8 マイクロ秒に、ピクセル サイズを 512 x 512 ピクセルに調整します。レーザーシャッター出力パラメータを150ミリワットに設定します 3D画像再構成の場合は、誘導ラマン損失を2, 850 cm反転に調整します。目的の単一細胞が特定されたら、レーザーを登録して上焦点面からスキャンし、それらの細胞の最上層と最下層を検出します。酸化重水素、プローブ、誘導ラマン散乱を使用して、単一細胞上のCDシグナルの空間分布を視覚化しました。対照細胞は、中程度のCD、脂質およびタンパク質バンドを示した。ただし、15 x vおよび15 xトリップでは、CD脂質とタンパク質の禁止が強くなりました。定量分析は、過剰な芳香族アミノ酸が脂質合成を10〜17%アップレギュレートする可能性があることを示しましたが、タンパク質合成を10%ダウンレギュレートする比率芳香族アミノ酸処理細胞のメトリック分析は、フラビンをフラビンとNADHで割ったフラビンが50%増加し、不飽和脂質が飽和脂質で割った値が10%増加したことを示しました。制御下および過剰芳香族アミノ酸条件下での治療細胞における刺激ラマン3D脂肪滴体積投影が示されている。3D脂肪滴の定量分析では、カウントの増加が示されましたが、芳香族アミノ酸処理細胞では対照と比較してサイズが小さくなりました。ラマンおよび2光子蛍光イメージングのイメージングパラメータは、最高のイメージング品質を確保するために、1つのサンプルから次のサンプルに最適化する必要があります。私たちのシステムを第2高調波発生と組み合わせることで、コラーゲン構造を研究し、老化や病気の初期の代謝変化を解明し、神経変性や癌の進行を理解することができます。私たちの技術は、生体系における脂質とタンパク質の合成を高い細胞内分解能で可視化するこの種の最初の技術です。この技術は、非侵襲的な疾患検出のためのクリニックにも変換できます。

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Research

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Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

13 C -同位体標識は、微生物の様々なタイプの細胞の中央代謝を決定するための便利なテクニックです。細胞が特異的な標識基質で培養された後、GC -...

スルー代謝経路の確認と発見 13</supタンパク質構成アミノ酸の> C標識

安易な蛍光アッセイであるアミノ アミノアシル tRNA-合成酵素/tRNA ペア哺乳類細胞で発現したタンパク質に非正規のアミノ酸 (ncAAs) を組み込むことの効率を評価する. します。サイトと bioorthogonal GPCR の生きているセルのラベルを連結する光橋マッピングを含む ncAAs の G タンパク質共役受容体 (Gpcr)...

光橋マッピングおよび生きている哺乳類細胞における Bioorthogonal 化学の Gpcr にプローブを化学物質の遺伝的結合の最適化

ここでは、無細胞タンパク質合成反応において中枢炭素およびエネルギー代謝に関与する40種類の化合物を定量するための堅牢なプロトコルを提示する。無細胞合成混合物は、逆相液体クロマトグラフィーを用いて効果的な分離のためにアニリンで誘導体化され、同位体標識内部標準を用いて質量分析法によって定量される。...

逆相液体クロマトグラフィー-質量分析法による無細胞タンパク質合成代謝の絶対定量

このプロトコルは、放射性標識アミノ酸取り込みアッセイを提示し、初代細胞または単離された骨のいずれかにおけるアミノ酸消費を評価するのに役立ちます。...

培養骨細胞および単離骨軸におけるアミノ酸消費の評価

リアルタイム細胞代謝フラックスアッセイは、pHおよび酸素センサを使用して、ミトコンドリアおよび解糖系アデノシン三リン酸産生に対応する酸素消費速度および細胞外酸性化速度を測定する。原稿では、骨芽細胞のエネルギー状態と細胞の生体エネルギー状態の特徴付けと解釈を理解するための方法を説明しています。...

リアルタイム細胞代謝フラックス分析装置を使用して骨芽細胞生体エネルギーをモニタリング

このプロトコルは、内因性代謝補酵素、還元型ニコチンアミドアデニン(リン酸)ジヌクレオチド(NAD(P)H)、および酸化フラビンアデニンジヌクレオチド(FAD)の蛍光イメージングおよび分析について記載しています。NAD(P)HおよびFADの自己蛍光イメージングは、細胞代謝を評価するための標識フリーの非破壊的方法を提供します。...

細胞代謝を評価するための自己蛍光イメージング

ここでは、光学的光熱赤外蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(OPTIR-FISH)、別名中赤外光熱魚(MIP-FISH)を使用して、個々の細胞を特定し、その代謝を理解するためのプロトコルを紹介します。この方法論は、単一細胞分解能による細胞代謝のマッピングなど、さまざまなアプリケーションに幅広く適用できます。...

光学的光熱赤外蛍光In Situハイブリダイゼーション(OPTIR-FISH)

ラベルフリーの光学イメージングモダリティを組み合わせたマルチモーダルプラットフォームを利用して、細胞のダイナミクスと代謝を視覚化および定量化するためのプロトコルを開発しました。多光子蛍光、第2高調波発生、および誘導ラマン散乱顕微鏡によるイメージングを通じて、細胞および分子環境の全体像を生成することができます。...

細胞代謝研究のためのマルチモーダル光学イメージングプラットフォーム

このプロトコルは、カスタムメイドのバイオリアクターシステムと過分極¹³C...

過分極 13C NMRを用いた生細胞のリアルタイム代謝検出

非破壊ボリュームの可視化は、最も効率的ではX線マイクロコンピュータ断層撮影（CT）となっている断層の技術によって達成することができます。...

の高分解能3次元イメージング生体外</emマイクロCTによる>生物試料

学ぼう、重水プローブ刺激ラマン散乱顕微鏡と二光子励起蛍光顕微鏡を組み合わせた無標識イメージング法で、細胞内の芳香族アミノ酸制御代謝活動を可視化する手法です。高い化学特異性とサブ細胞分解能を達成し、がんや加齢に関連する代謝異常の研究に貢献します。

芳香族アミノ酸によって制御される細胞代謝のバイオ直交化学イメージング

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