Name: ヒト伏在静脈内皮細胞の単離と制御されたレベルのせん断応力および伸張への曝露 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-21T14:35:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: 学ぶヒト伏在静脈内皮細胞の単離と培養法。せん断応力と伸張刺激を制御下で与え、機械的ストレス応答を解析する手法を解説。血管移植片不全の予防に向けた治療戦略開発への応用が期待されます。

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</ol>

著者は、開示すべき利益相反はありません。

伏在静脈セグメントは、hSVECを正常に分離するために少なくとも2 cmである必要があります。小さなセグメントは、細胞を単離するためのコラゲナーゼ溶液を維持するために、取り扱いや血管の端を結ぶのが困難です。管腔表面積の減少は、培養を拡大するのに十分な細胞を生じさせない。非ECによる汚染のリスクを最小限に抑えるために、伏在静脈セグメントの操作は、手順全体を通して非常に穏やかである必要があります。血液を除去するためにピペットチップを管腔表面に導入するとき、およびコラゲナーゼ溶液を導入するときは注意が必要です。酵素溶液への曝露は、非ECによる培養物の汚染を減らすために、非常によく制御されるべきである(1時間以内)。成長因子カクテルを添加した特定のEC培地の使用は、hSVEC培養の成長にとって非常に重要です。培養の最初の数日間の追加のヘパリンは、静脈セグメントからの残留赤血球を減らし、平滑筋細胞の増殖を阻害するために重要です15。実験または培養の維持のために細胞を通過させる場合は、必ず40%を超えるコンフルエンスで細胞をプレートしてください。ECは、良好な増殖と生存を確保するために最小限の接触を必...

内皮細胞(EC)機能不全は、伏在静脈グラフト不全の重要なプレーヤーです1,2,3,4。せん断応力と周期的伸展の持続的な増加は、ヒト伏在静脈内皮細胞(hSVEC)の炎症誘発性表現型を誘導します3,4,5,6。基礎となる分子経路はまだ完全には理解されておらず、in vitro研究のための標準化されたプロトコルは、この分野における新しい洞察のための努力を活用する可能性があります。ここでは、hSVECを単離、特性評価、拡張するための簡単なプロトコルと、静脈および動脈の血行動態状態を模倣して、hSVECをさまざまなレベルのせん断応力と周期的伸展にさらす方法について説明します。
hSVECはコラゲナーゼインキュベーションによって単離され、継代8まで使用することができます。このプロトコルは、平滑筋細胞および線維芽細胞による汚染を減少させる他の利用可能なプロトコル7と比較して、血管の操作が少なくて済む。一方、効率的なEC抽出を行うには、少なくとも2cmのより大きな血管セグメントが必要です。文献では、大型容器からのECは機械的除去によっても得られることが報告されています7,8。物理的アプローチは効果的であるが、EC収率が低く、線維芽細胞汚染が高いという欠点がある。純度を上げるには、磁気ビーズまたは細胞ソーティングを使用した追加のステップが必要であり、ビーズと抗体の取得によりプロトコルのコストが増加します7,8。酵素法は、ECの純度と生存率に関してより速く、より良い結果をもたらします7,8。
内皮機能障害の研究に最も頻繁に使用されるECは、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)です。EC表現型は血管床によって変化することが知られており、調査中の血管を表す方法を開発することが不可欠である9,10。この点で、hSVECを単離し、機械的ストレス下で培養するためのプロトコルの確立は、静脈移植疾患におけるhSVEC機能障害の寄与を理解するための貴重なツールです。

<table><tbody><tr><td>0.25% トリプシン-0.02% EDTA溶液</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>15 & micro; slide I 0.4 Luer&nbsp;</td><td>同上</td><td>80176</td><td></td></tr><tr><td>4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、二乳酸 (DAPI)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>25 mm&nbsp;</td><td>フレックスセルインターナショナルコーポレーション</td><td>LS-3000B25。取り外し可能なウェル付きVJW</td><td></td></tr><tr><td>8ウェルチャンバースライド</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>154453</td><td></td></tr><tr><td>酢酸(氷)</td><td>ミリポア</td><td>100063</td><td></td></tr><tr><td>アクリルシート 厚さ1cm</td><td>、プレキシガラス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗CD31抗体</td><td>Abcam</td><td>ab24590</td><td></td></tr><tr><td>抗CD31、FITC抗体</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>MHCD3101</td><td></td></tr><tr><td>抗VE-カドヘリン抗体</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>2500</td><td></td></tr><tr><td>バイオフレックスプレート コラーゲン I</td><td>Flexcell International Corporation</td><td>BF3001C</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8412</td><td></td></tr><tr><td>綿縫合 EP 3.5 15 x 45 cm</td><td>ブラシュート</td><td>AP524</td><td></td></tr><tr><td>サイクロフィリンフォワードプライマー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>カスタム設計</td><td></td></tr><tr><td>サイクロフィリン逆プライマー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>カスタム設計</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド(DMSO)</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>D4540</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2 基礎培地</td><td>ロンザ</td><td>CC3156</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 シングルクォーツ サプリメント</td><td>ロンザ</td><td>CC4176</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>2657-029</td><td></td></tr><tr><td>Flexcell FX-5000 テンションシステム</td><td>Flexcell International Corporation</td><td>FX-5000T</td><td></td></tr><tr><td>フルオロマウント水性封入剤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4680</td><td></td></tr><tr><td>豚皮ゼラチン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2500</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウスIgG Alexa Fluor 488</td><td>サーモフィッシャーScientific</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギIgG Alexa Fluor 488</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>豚腸粘膜からのヘパリンナトリウム 5000 IU/mL</td><td>Blau Farmac&ecirc;utica</td><td>SKU 68027</td><td></td></tr><tr><td>同上ポンプシステム(ポンプ+流体ユニット)</td><td>同上</td><td>10902</td><td></td></tr><tr><td>KLF2フォワードプライマー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>カスタム設計</td><td></td></tr><tr><td>のKLF2リバースプライマー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>カスタム設計</td><td></td></tr>の<tr><td>KLF4フォワードプライマー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>カスタム設計</td><td></td></tr><tr><td>のKLF4リバースプライマー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>カスタム設計</td><td></td>の</tr><tr><td>NOA 280一酸化窒素分析装置</td><td>シーバース・インスツルメンツ</td><td>NOA-280i-1</td><td></td></tr><tr><td>NOS3 フォワードプライマー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>カスタム設計</td><td></td></tr>の <tr><td>NOS3 リバースプライマー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>カスタム設計</td><td></td></tr><tr><td>のパラホルムアルデヒド(PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>灌流セット 15 cm、内径 1.6 mm、赤、10 mL リザーバー</td><td>同上</td><td>10962</td><td></td></tr><tr><td>ファロイジン - Alexa Fluor 488</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>ファロイジン - Alexa Fluor 568</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>A12380</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、pH 7.4</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>ヨウ化カリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221945</td><td></td></tr><tr><td>QuanTitec SYBR グリーン PCR キット</td><td>Qiagen</td><td>204143</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 12K flex platform&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>4471087</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy マイクロキット&nbsp;</td><td>Quiagen</td><td>74004</td><td></td></tr><tr><td>スライドガラス (24 mm x 60 mm)</td><td>ニットガラス</td><td>VD12460Y1D.01</td><td></td></tr><tr><td>亜硝酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31443</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript IV ファーストストランド合成システム</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>18091200</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルーステイン 0.4%</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr>Clostridium histolyticum <td>Sigma-Aldrich</td><td>C6885</td><td></td><td>由来のII型コラゲナーゼ</td></tr></tbody></table>

ヒト伏在静脈内皮細胞の単離と制御されたレベルのせん断応力および伸張への曝露

Human Saphenous Vein Endothelial Cell Isolation and Exposure to Controlled Levels of Shear Stress and Stretch

冠動脈バイパスグラフト(CABG)手術は、虚血性心筋を血行再建する手順です。伏在静脈は、動脈導管と比較して長期的な開存性が低下しているにもかかわらず、CABG導管として使用され続けています。移植片動脈化に関連する血行動態ストレスの急激な増加は、伏在静脈移植片(SVG)の低い開存性に影響を与える可能性のある血管損傷、特に内皮をもたらします。ここでは、ヒト伏在静脈内皮細胞(hSVEC)の単離、特性評価、および増殖について説明します。コラゲナーゼ消化によって単離された細胞は、典型的な石畳の形態を示し、内皮細胞マーカーCD31およびVE-cadherinを発現します。機械的ストレスの影響を評価するために、この研究ではプロトコルを使用して、動脈化されたSVGに対する2つの主要な物理的刺激であるせん断応力と伸張を調査しました。 hSVECは、平行プレートフローチャンバーで培養されてせん断応力を生成し、流れの方向に整列し、KLF2、KLF4、およびNOS3の発現が増加しました。hSVECは、静脈(低)および動脈(高)の伸展を模倣した細胞伸長を制御できるシリコン膜で培養することもできます。内皮細胞のF-アクチンパターンと一酸化窒素(NO)分泌は、動脈の伸展によってそれに応じて調節されます。要約すると、内皮表現型に対する血行力学的機械的ストレスの影響を研究するために、hSVECを単離するための詳細な方法を提示します。

典型的には、付着ECは抽出後3〜4日で観察することができる。hSVECは、最初は細胞のクラスターを形成し、典型的な「石畳」の形態を示します(図1B)。それらはECマーカーCD31(図1C、D)およびVE-カドヘリン(図1D)を発現する。hSVECは、コーティングされていない処理済み細胞培養皿上で容易に増殖することができ、培養中の内皮表現型を最大8継代まで保持します。
hSVECは、剪断応力下で培養すると、流れの方向に整列する(図2A)。72時間にわたる20dyn/cm2のせん断応力は、典型的な機械感受性遺伝子であるKLF2、KLF4、およびNOS3の発現を誘導し、hSVECにおけるせん断刺激の有効性を示しています(図2B)12、<s...

ヒト伏在静脈内皮細胞(hSVEC)を単離および培養するためのプロトコルについて述べる。また、hSVECの機械的応力を研究するために、せん断応力と伸張を生成するための詳細な方法も提供しています。

Coronary artery bypass graft (CABG) surgery is a procedure to revascularize ischemic myocardium. Saphenous vein remains used as a CABG conduit despite the ...

伏在静脈は、冠状動脈バイパス手術後に突然動脈状態にさらされます。機械的ストレスに対するその適応応答を理解することは、静脈移植不全を予防するための治療ツールの設計に役立つ可能性があります。この内皮細胞単離プロトコルは非常にシンプルで、コラゲナーゼとのインキュベーションのみが必要です。最小限の血管操作で、平滑筋細胞や線維芽細胞による汚染が減少します。ヒトSVECを単離し、せん断応力および周期的伸展下で培養するためのプロトコルは、伏在静脈移植不全に関連する内皮細胞機能障害における機械力の寄与を理解するために不可欠です。以前の内皮細胞培養は、細胞培地の補充に関して非常に要求が厳しい。培養物であるヒトSVECをうまく分離するには、成長因子を追加することが必須です。初代ヒト伏在静脈内皮細胞またはヒトSVECを単離するために、少なくとも2〜3センチメートルの長さの伏在静脈セグメントを収集します。滅菌層流フードの下で作業し、静脈セグメントを予熱したPBSで満たされたペトリ皿に移します。内腔の内側からすべての血液を取り除くには、ピペットに取り付けられ、PBSで満たされたピペットチップを静脈の一端に挿入し、静かに洗い流します。洗浄の流れが完全に透明になるまで洗い流します。次に、滅菌綿縫合糸で静脈の一端を閉じます。容器に1ミリリットルあたり1ミリグラムのコラゲナーゼ2型溶液を慎重に満たし、容器のもう一方の端を綿縫合糸で閉じます。容器をコラゲナーゼ溶液とともに、5%二酸化炭素、摂氏37度の加湿雰囲気中で1時間インキュベートします。次に、15ミリリットルのチューブで容器の一方の端を切断し、もう一方の端を切断する前にコラゲナーゼ溶液を収集します。管腔表面を1〜2ミリリットルのPBSで洗い流し、チューブ内の剥離した内皮細胞をすべてコラゲナーゼで収集します。チューブを室温で400Gで5分間遠心分離します。上清を除去した後、追加のヘパリン溶液を含む3〜4ミリリットルの完全内皮細胞培地に細胞ペレットを再懸濁する。体積あたり3%重量ゼラチンでプレコートされた60mmの細胞培養皿に細胞をプレートします。培地を変更せずに加湿雰囲気中で4日間細胞をインキュベートします。その後、ヘパリンの補給を加えずに一日おきに培地を交換してください。顕微鏡でプレートを調べて、赤血球が除去されたことを確認します。抽出後1〜4日後、静脈セグメントのサイズと直径に応じて、位相差顕微鏡でヒトSVECを視覚化し、合流の程度とその玉石の形態を評価します。細胞が70%から80%のコンフルエントに達するまで、2日ごとに培地を交換し続けます。フローチャンバースライドを体積あたり0.1%重量ゼラチンでコーティングし、摂氏37度で少なくとも30分間インキュベートします。10ミリメートルリザーバを有する流体ユニットと滅菌灌流セットとを平衡化するために、それらを加湿雰囲気中で一晩インキュベートする。せん断応力実験のために、100マイクロリットルの培養液に懸濁した200, 000個の内皮細胞をゼラチンコートフローチャンバースライドに播種した。細胞を培養表面に付着させるには、細胞を4時間インキュベートします。灌流セットを流体ユニットに配置します。リザーバーおよび灌流セットに、約12ミリリットルの予め温めた完全内皮細胞培地を充填する。灌流セットから気泡を取り除き、両方のリザーバーのレベルを5ミリリットルで平衡化します。インキュベーター内のチャンバースライドなしで、取り付けられた灌流セットに流体ユニットを置き、その電気ケーブルをコンピューター制御ポンプに接続します。ポンプ制御ソフトウェアで事前定義されたプロトコルを実行して、リザーバーと灌流セットからすべての気泡を取り除きます。灌流を層流フードにセットした流体ユニットを取り、コンフルエンスセル単層を有するスライドを取り付けます。スライド付きのユニット全体をインキュベーターに入れた後、その電気ケーブルをポンプに接続します。ポンプ制御ソフトウェアで、スライドの種類を選択し、媒体の粘度を設定して、流体ユニットのセットアップを調整します。[流れパラメータ]で、せん断応力値を入力し、サイクル期間と流れタイプを設定します。次に、再生ボタンをクリックして実験を開始します。静的コントロールとして流れにさらされることなく、同じ培地で処理された細胞でスライドを維持することを忘れないでください。シリコーンベースの潤滑剤を25ミリメートルの6ウェル等二軸ローディングステーションの上部と側面に塗布します。種子400, 000細胞をコラーゲン1でコーティングした6ウェルフレキシブルボトム培養プレートの各ウェルに3ミリリットルで懸濁した。細胞が100%コンフルエントに達するまで加湿空気中でインキュベートします。ストレッチプロトコルを開始する前に、予め温めたPBSで細胞を1回洗浄し、ウェルあたり3ミリリットルの新鮮な培地を加えます。すべての潤滑ローディングステーションを備えたベースプレートをインキュベーターに挿入し、チューブをテンションセルストレッチバイオリアクターシステムのコントローラー機器に適切に接続します。各培養プレートをバイオリアクターシステムが提供する1つの赤いガスケットに取り付けます。それからそれらをインキュベーターのベースプレートに入れます。4つの培養プレートすべてをベースプレートに配置して、適切な真空と伸張荷重を実現します。コントローラ機器とコンピュータシステムの電源を入れます。FlexCell制御ソフトウェアを開き、伸び率、波形形状、周波数、時間など、目的のレジメンを設定します。レジメンを保存します。真空システムの電源を入れ、レジメンを選択し、コンピューター画面で[開始]をクリックしてストレッチを実行します。シリコーン膜が細胞を動かして伸ばしていることを確認します。接着した内皮細胞は抽出後4〜10日目に観察できた。それらは最初に典型的な石畳の形態を示す細胞クラスターを形成します。ECマーカーCD31およびVEカドヘリンを発現させた。剪断応力下で培養した場合のhSVECsは流れの方向に整列した。20ダイン/平方センチメートルのせん断応力を72時間行うことで、代表的な機械感受性遺伝子であるKLF2、KLF4、NOS3の発現が誘導され、せん断刺激の有効性が示唆された。周期的伸展の結果は、ヒトSVECに加えられた強度に依存した。低伸長下の細胞は、静的細胞と同様の皮質F-アクチンパターンを示した。最大72時間一酸化窒素放出の変化なしに、私たちの動脈レベルのストレッチは24時間後にアクチン細胞骨格を再構築し、72時間後にNO放出を減少させました。機械的ストレスの研究に加えて、研究者は単離された細胞を使用して、内皮細胞の機能と機能障害に関する知識を拡大するためのさまざまな方法を実行できます。実証されたプロトコルに従って、せん断応力および伸張下で他のタイプの内皮細胞を研究することが可能です。

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Research

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オンチップ·血管内皮の炎症性表現型

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人間の伏在静脈のための手順生体外灌流および外部補強

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このプロトコルは、軌道シェーカーモデルを用いた剪断応力適用用に、内皮細胞の成長を6ウェルプレートの特定の領域に制限するコーティング方法を説明する。...

メカノ生物学的研究のための軌道シェーカー上の6ウェルプレートにおける内皮細胞の成長のセグメント化

ここでは、病理的および生理的な流体せん断ストレス条件に曝露した内皮細胞における近接ライゲーションアッセイ(PLA)を用いて、複数のSMAD複合体を同時に可視化・解析するプロトコルを確立する。...

近接ライゲーションアッセイを用いた異流体せん断応力条件下でのTGFβ/BMP/SMADシグナル伝達の可視化と定量化

ここでは、ヒト大動脈壁の平滑筋細胞の in vivo...

大動脈壁における生体力学的ひずみを再現するためのヒト大動脈平滑筋細胞器官チップモデルの構築

ここでは、内皮細胞をヒト多能性幹細胞から分化させる簡単なワークフローと、それに続く機械的刺激の詳細なプロトコルについて説明します。これにより、内皮細胞の発生メカノバイオロジーの研究が可能になります。このアプローチは、機械的刺激後に培養チップから回収された生細胞のダウンストリームアッセイに適合します。...

イン・ビトロ 発生メカノバイオロジー研究のための胎児血管オンチップモデル

学ぶヒト伏在静脈内皮細胞の単離と培養法。せん断応力と伸張刺激を制御下で与え、機械的ストレス応答を解析する手法を解説。血管移植片不全の予防に向けた治療戦略開発への応用が期待されます。

ヒト伏在静脈内皮細胞の単離と制御されたレベルのせん断応力および伸張への曝露

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