卵黄抗体に基づくサイトメトリービーズアッセイの標準化

疾患の診断を目的としたイムノアッセイ技術の中で、サイトメトリービーズアッセイは、1回のアッセイで数千の粒子を分析する、高感度で信頼性の高いアプローチとして登場しました。フローサイトメトリーの高精度と低コストのラテックスビーズにより、当社の技術は抗体や抗原などのイムノアッセイツールの分析に適用できます。IgY抗体は、低コストで、その生産において倫理的な利点があり、希少疾患の検出ツールとして使用できます。

Gallus gallus deckleの白い系統から産んだばかりまたは生後4日齢の卵を次亜塩素酸ナトリウムの0.2%希釈溶液に浸すことから始めます。流水ですばやくすすぎ、やさしく拭いてください。卵を慎重に割って、卵黄分離器の助けを借りて白から卵黄を分離します。

そして、ろ紙で余分な白を取り除きます。卵黄を突き刺し、その内部を50ミリリットルの円錐形のチューブに集めます。卵黄は、使用前に少なくとも20時間、摂氏マイナス24度で保管してください。

保存した卵黄を解凍した後、1ミリモルのPBSで1対10の比率で希釈します。溶液のpHを5に調整し、1つの通常の塩酸で、溶液を摂氏4度で6〜24時間インキュベートします。この溶液を3000Gで40分間遠心分離し、回収した上清を0.7mmセルロースフィルターを用いて濾過してから、上清のpHを5に再調整した。

カプリル酸を最終濃度8.7%まで加え、絶えず攪拌しながら、摂氏4度で30分間行う。サンプルを15分間遠心分離した後、沈殿した材料から上清を分離します。1モルの水酸化ナトリウムを使用して溶液のpHを7.4に再調整します。

そして、ブラッドフォードアッセイを使用して抗体を定量し、マイナス20°Cで保存します。21マイクロリットルのEDCと21マイクロリットルのNHSを21マイクロリットルのラテックスビーズに加えます。そして、ろ過された10ミリモルのPBSで、2.1ミリリットルの最終容量に調整します。

溶液を摂氏22度で、急速に振とうしながら3時間インキュベートします。以前に抽出した捕捉抗体であるIgY PfHRP2を、この溶液100マイクロリットルを含む別のマイクロチューブに追加します。そして再び16時間インキュベートする。

サンプルを遠心分離し、上清を廃棄した後、遠心分離と再懸濁サイクルを使用して、500マイクロリットルのろ過された10ミリモルPBSでラテックスビーズを2回洗浄します。ビーズのブロッキングについては、サンプルを1ミリリットルのブロッキングバッファーに再懸濁し、前に示したのと同じ手順に従って2時間インキュベートします。ビーズをPBSで洗浄した後、10ミリモルのPBSバッファーに再度懸濁します。

PBSとBSAの10ミリモルの混合物で1〜2000に希釈した100マイクロリットルの蛍光抗ニワトリ抗体を各マイクロチューブに加えます。サンプルを暗所で30分間インキュベートします。ビーズを洗浄した後、250マイクロリットルのろ過した10ミリモルPBSで再度懸濁します。

100マイクロリットルのブロックビーズ調製物を、異なる量の希釈組換えタンパク質PfHRP2を三重に含むチューブに分配することにより、検出限界を決定します。ビーズ溶液をタンパク質とともに摂氏22度で、急速に振とうしながら1時間インキュベートします。前述のように、500マイクロリットルのろ過された10ミリモルPBSでビーズを遠心分離しながら洗浄します。

上清を捨てた後、組換えタンパク質に対するマウスIgG抗体を2マイクログラム加え、各サンプルに10ミリモルのPBSとBSAで希釈し、同様の手順に従ってインキュベートします。次に、希釈した蛍光抗マウス抗体100マイクロリットルを各サンプルに加える。インキュベーション後、サンプルを250マイクロリットルのろ過した10ミリモルPBSに再懸濁します。

コンピューターとフローサイトメーターの電源を入れ、機器がコンピューターに接続するまで数分待ちます。コンピュータにインストールされているサイトメトリーソフトウェアをクリックしてログインします。ソフトウェアワークスペースから、サイトメーター、流路系スタートアップ、クリーニングモード、SITフラッシュの順に選択します。

ネガティブコントロール粒子の形態測定特性と蛍光特性に基づいてゲーティング戦略を定義します。細胞形態測定を決定するには、側方散乱Aを使用した前方散乱Aパラメータの分析にドットプロットプロットグラフィックを選択します.Y軸の側方散乱WとX軸の側方散乱Hの分析用にドットプロットプロットグラフィックを使用して側方散乱によって単一細胞を決定します。前方散乱により単一細胞を決定し、プロット図のドットプロットを用いて、Y軸における前方散乱W、及びX軸における前方散乱Hの解析を行う。

蛍光分析には、前方散乱A.ラベルのないサンプルと、以前に単色のAlexa Fluor 488でラベル付けされたサンプルを含む栓付きポリスチレンチューブを使用し、チューブの内容物を慎重に混合します。チューブをフローサイトメータープローブに取り付け、Acquire を左クリックします。レーザーの出力を設定するには、[パラメーター]をクリックし、以下のオプションで、前方散乱の電圧を182ボルトに調整し、側面散乱の電圧を236ボルトに調整します。

サイトメーターのしきい値を設定するには、[しきい値]をクリックし、以下のオプションでFSCを500ボルトに調整します。分析ゲートを設定して、サイズと複雑さによって粒子を特徴付け、単一細胞分析を実行します。ラテックスビーズのみを含む色素フリーサンプルを分析し、検出器FL1 FITCの電圧を332ボルトに調整して自家蛍光を除去します。

蛍光解析ゲートを四角形に設定し、ドットプロットグラフに示す負の点から設定します。形態測定分析と蛍光分析が調整されたら、50, 000イベント用にデバイスを構成し、[記録]をクリックします。カプリル酸を用いた分離によるIgY PfHRP2抗体の電気泳動プロファイルを以下に示す。

この図から、カプリル酸分離前後の抗体は、IgYの軽鎖と重鎖を指す65キロダルトンと27キロダルトンの特徴的なバンドで、同様の電気泳動プロファイルを示したことがわかります。これらに加えて、他のバンドも見え、おそらくC末端フラグメント卵黄タンパク質ビテロゲニンII前駆体に起因する。ラテックスビーズ上の抗体飽和濃度を評価することは、ビーズを用いたイムノアッセイの開発に不可欠です。

異なる濃度の抗体の蛍光率の曲線を、使用した市販のラテックスビーズの各マイクロリットルに結合して、ここに示す。濃度が増加するにつれて、パーセンテージ値も増加し、2マイクログラムの抗体濃度で頭打ちになり、標的抗原免疫測定法に最適なカップリング濃度として確立されました。検出限界は、変化するrPfHRP2タンパク質濃度に対するラテックス速度反応性の蛍光百分率を評価することによって決定した。

サンドイッチイムノアッセイから、蛍光はPfHRP2タンパク質の0.01マイクログラムから増加し、0.1マイクログラムでプラトー化されることが観察されました。ゼロマイクログラムと0.01マイクログラムで蛍光に有意差はなかった。しかし、蛍光には0.01マイクログラム、0.1マイクログラム、および10マイクログラムで有意差が観察されました。

このプロトコルの洗浄ステップは、ビーズの損失を避けるために重要です。得られた結果に間違いがないように、ゲージは明確に定義されなければなりません。ここで説明する手順は、フルサイトメトリーで評価されるラテックスビーズを使用した診断テストの信頼性を確保するために必要な重要な標準化を表しています。

したがって、この方法論は、従来のサンドイッチテストモデルの代替手段です。この方法は、さまざまな種類のアッセイに適用でき、ビーズの表面にいくつかの分子をコーピングしたり、さまざまな分析対象物を検出したりするのに適している場合があります。