Name: 肺上皮間葉転換を促進するためのシリカ曝露マウスモデルでのニコチンの使用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-03T14:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: 学ぶニコチンとシリカの複合曝露マウスモデルによる肺線維症の進行機構。上皮間葉転換を促進するシナジー効果を解明し、肺疾患治療戦略の開発に貢献する再現性の高い実験手法を確立する。

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本研究は、安徽省大学シナジーイノベーションプログラム(GXXT-2021-077)および安徽科技大学大学院イノベーション基金(2021CX2120)の支援を受けて行われました。

すべての手順は、国立衛生研究所の実験動物のケアと使用に関するガイド(NRCの第8版)によって発行されたガイドラインに従って実施され、安徽科技大学の動物倫理委員会によって承認されました。
1.動物の調製
<ol><li>32匹の雄のC57/BL6マウスを8週間の実験室で12時間の明暗サイクルで飼育する。マウスが餌と水に自由にアクセスできることを確認してください。</li>
	<li>2週間の環境順応後、10週齢のマウスの体重が23〜26gの場合、コンピューターによって生成された乱数を使用して、動物を分割せずにランダムにグループ化し、対照群(Con)、ニコチン基(Nic)、シリカ基(SiO 2)、およびシリカ基と結合したニコチン(Nic+ SiO2)の4つのグループのマウスを作成します。</li>
</ol>2.ニコチン製剤
注:ニコチン密度は1.01 g / mLです。
<ol><li>ニコチンを無水エタノールに溶解し、20倍に希釈して50 mg/mLのニコチンストック溶液を調製します。</li>
	<li>ニコチン原液を滅菌生理食塩水で1,000倍に希釈し、0.05 mg/mLの濃度で作業溶液を作ります。 注意: ニコチンは光を避けて保管してください。原液は4°Cで最大1週間保存できます。</li>
</ol>3. シリカ調製
<ol><li>滅菌結晶性シリカを生理食塩水に懸濁して20 mg/mLのシリカ懸濁液を調製し、超音波振とう水浴中で25分間振動させます。</li>
	<li>マウスが点鼻薬を受ける前に、渦振動子でシリカ懸濁液を3分間振とうします。200μLのピペットで2x-3xピペッティングしてシリカ懸濁液を混合し、50μLを点鼻薬として取ります。 注:二酸化ケイ素懸 ?? 液を混合し、できるだけ早く点鼻薬 で 投与する必要があります。.</li>
</ol>4.マウスの捕獲とニコチン曝露
<ol><li>マウスの体重を量り、曝露前に毎日体重を記録します。</li>
	<li>1〜40日目に、NicおよびNic + SiO 2グループのマウスに1日2 回(12時間間隔)ニコチンを皮下注射します。0.25 mg / kgのニコチン用量を使用します。たとえば、体重25gのマウスに6.25μgのニコチンが含まれていることを確認します。このマウスの場合、注入量は 6.25/0.05 = 125 μL となります。 同時に、Con群のマウスに等量の生理食塩水を注入します。</li>
	<li>各グループに必要な 1 mL シリンジを準備し、それらを使用してニコチンまたは生理食塩水の注入量を吸引します。ニコチンを取り込む前に、まず0.1〜0.2 mLの空気をシリンジに引き込み、次に125μLのニコチンを吸い上げます。.シリンジを慎重に軽くたたいて、針とシリンジの前端をニコチンで満たします。.ニコチン含有シリンジを光から保護されたトレイに入れます。. 注:注射時には、0.1〜0.2 mLの空気がニコチンの後ろにあり、すべての液体がマウスに正常に投与されることを保証します。.</li>
	<li>右手でネズミの尻尾をつかみ、動物がリラックスしたら、左手の親指と人差し指を使って、尾から頭、耳の端まで首の後ろの皮膚を押し、適度な圧力をかけます。その後、右手を離し、左の小さな親指と薬指で尻尾と後肢をつまむと、マウスは左手で完全に動けなくなります。 メモ: マウスを適切な力でつかみます。力が足りないとネズミが噛みつきやすくなり、力が強すぎるとネズミが窒息してしまうことがあります。</li>
	<li>マウスの耳端付近の首の後ろの皮膚を注射器で頭から尾まで穿刺し、ニコチンを一定の割合で注射する。注射が成功したことを示す半円形の皮膚の膨らみを探します。 注意: 針が皮膚に刺さると、抵抗感があります。針が挿入されると抵抗が消えます。この時点で、針を少し引き抜いて、ゆっくりと均一に注入する必要があります。</li>
</ol>5. in vivoでのシリカ曝露
<ol><li>5〜19日目に、二酸化ケイ素懸濁液をSiO2およびNic+SiO2グループのマウスの鼻腔に点滴します。麻酔器で2%イソフルランを投与し、3.6 mL / hの用量で各マウスに迅速に麻酔をかけます。麻酔後、マウスを片手のひらに置き、マウスの鼻腔を露出させます。50μLのシリカ懸濁液を4〜8秒以内に鼻腔に注入します。</li>
	<li>シリカ懸濁液ができるだけ早く肺に入るように、点眼後、マウスの心臓を人差し指で3〜5秒、毎秒3〜5回静かに押して、呼吸数を促進します。</li>
	<li>マウスの呼吸が徐々に均一になったら、マウスをケージに入れて3分間観察します。</li>
	<li>シリカ懸濁液を投与されたすべてのマウスについて、手順1〜3を繰り返します。対照群では、5〜19日目に50μLの滅菌生理食塩水を鼻腔に注入します。</li>
</ol>6.新鮮で固定された肺組織の獲得
<ol><li>41日目に、50 mg / kgのペントバルビタールナトリウムを使用して、体重に応じて0.1 mL / 20 gの用量でマウスを腹腔内に麻酔します。.フォームテストプレートに手足を固定し、75%のアルコールを毛皮にスプレーします。</li>
	<li>心臓灌流を行って新鮮な肺組織を取得し、腹部の正中線を切断して胸腔を露出させ、右心臓の頂点に小さな開口部を作ります。次に、予冷したリン酸緩衝生理食塩水(PBS)20mLを左心尖部からゆっくりと均一に注入し、右心尖部にできた開口部から血液を流出させます。肺葉全体を取り出し、予冷した1.5 mL遠心チューブに入れ、タンパク質抽出を保留して保存するために-80°Cに移します。</li>
	<li>他のマウスに20 mLの予冷PBSを灌流し、続いて10 mLの4%パラホルムアルデヒドを同じ場所に灌流して、肺全体を固定します。各肺を30 mLの4%PFAで保存します。</li>
	<li>72時間後、固定された肺組織をパラフィンに包埋します。<ol><li>調製した固定液に肺組織を40°Cの超音波水浴に30分間浸し、続いて75%エタノール、95%エタノール、無水エタノールでそれぞれ50分間脱水プロセスを行います。</li>
		<li>キシレンで2回、それぞれ50分間洗浄します。</li>
		<li>55〜60°Cで2〜3時間溶融パラフィンワックスに組織を入れ、肺組織のキシレンが徐々にパラフィンワックスに置き換わるようにします。</li>
		<li>肺組織を包埋フレームにパラフィンで固定し、ワックスブロックが固まるのを待ちます。ワックスブロックが固まったら、パラフィン切片化機を使用して肺を4〜5μmでスライスします。</li>
	</ol></li>
	<li>肺切片を45°Cの超純水に入れます。 パラフィンが溶けたら、肺切片を接着顕微鏡スライドにロードします。</li>
</ol>7. ヘマトキシリンとエオシン(HE)の染色
<ol><li>スライドを60°Cで2時間焼き、スライドをキシレンに浸して2 x 30分間脱ワックスします。続いて、スライドを無水エタノール、95%エタノール、85%エタノール、75%エタノールにそれぞれ5分間入れます。最後に、超純水で3 x 5分間洗浄します。</li>
	<li>50 μLのヘマトキシリン染色溶液をピペットガンで肺組織に滴下し、5分間染色します。次に、スライスを流水で5分間洗います。</li>
	<li>50 μLの2%塩酸エタノールを切片に加え、蒸留水で30秒間すすぎます。次に、50 μLのエオシン染色溶液を肺組織に添加し、1分間染色します。</li>
	<li>パラフィン切片を脱水し、透明化し、密封します。<ol><li>100〜150mLの75%エタノール、85%エタノール、95%エタノール、無水エタノール、およびキシレンを混合プラスチック染色タンクに加えます。スライドを75%、85%、95%、無水エタノールにそれぞれ5分間入れて脱水します。</li>
		<li>次に、スライドをキシレンに5分間入れて透明にします。</li>
		<li>最後に、20μLの中性ガムを肺切片に滴下し、スライドの上にカバーガラスを置いて密封します。 注意: 上記の手順は室温で実行されます。</li>
	</ol></li>
</ol>8.マッソン染色
<ol><li>ステップ7.1の説明に従って、パラフィン切片を脱ワックスし、水和させ、洗浄します。</li>
	<li>50 μLのWeigertヘマトキシリン染色溶液で切片を7分間染色し、続いて50 μLの酸性エタノール分画溶液で10秒間染色し、流水で洗浄して核を青色に変えます。</li>
	<li>切片を50 μLのMassonトリクローム溶液で4分間染色し、水で洗浄します。</li>
	<li>切片を蒸留水で1分間すすぎ、次にLichun red acid magentaで7分間染色します。</li>
	<li>弱酸性作動溶液(30%塩酸)で1〜2分間、リンモリブデン酸溶液で1〜2分間、弱酸性作業溶液で1〜2分間洗浄します。</li>
	<li>切片をアニリンブルー染色液で2分間染色した後、弱酸性作業溶液で1分間洗浄します。</li>
	<li>切片を95%エタノールで脱水した後、無水エタノールで1秒間脱水し、キシレンで1秒間透明化した後、最後にステップ7.4の説明に従って中性樹脂で密封します。</li>
</ol>9. 免疫組織化学
<ol><li>スライスを60°Cで6時間焼きます。ステップ7.1の説明に従って、パラフィン切片を脱ワックスし、水和させ、洗浄します。</li>
	<li>抗原回収:スライスを沈めるのに十分なクエン酸抗原賦活化溶液を含む耐熱プラスチックスライスボックスに入れ、20〜30分間沸騰させます。</li>
	<li>室温まで冷却し、切片を取り除き、脱イオン水ですすいでください。続いて、0.5% Tween-20(PBST)を含むPBSに5分×2分間浸漬します。</li>
	<li>疎水性ペンでスライドの肺部分の近くにループを描き、疎水性の円を形成します。</li>
	<li>50μLの3%過酸化水素溶液(3%H2O2)をスライスに滴下し、内因性ペルオキシダーゼの不活性化のために光から保護された室温で15分間インキュベートします。</li>
	<li>スライスをPBSTに3 x 5分間浸します。</li>
	<li>50 μLの5%ウシ血清タンパク質(BSA)-PBSTをスライスに滴下し、室温で1時間ブロックします。</li>
	<li>ブロッキング溶液を廃棄し、希釈した一次抗体CD206(希釈倍率:1:1,500)、TGF-β1(希釈率:1:200)、ビメンチン(希釈率:1:2,000)をスライスに滴下し、4°Cで一晩インキュベートします。 注:この研究では、すべての抗体を5%BSAで希釈しました。</li>
	<li>翌日、スライスを室温に戻します(40分)。手順9.6の説明に従ってスライスを洗います。</li>
	<li>二次抗体を5%BSAで希釈します。西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体(希釈倍率:1:500)50 μLを滴下し、室温で1時間インキュベートします。手順9.6の説明に従ってスライスを洗います。</li>
	<li>酵素標識二次抗体に対応する3,3'-ジアミノベンジジン(DAB)溶液50μLを肺組織に滴下し、黒い免疫組織化学的ウェットボックス内で5〜10分間インキュベートします。色が強い茶色になるまで顕微鏡で観察します。スライスを蒸留水ですすぎ、反応を終了します。 注:茶色の染色は陽性染色と見なされます。</li>
	<li>50 μLのヘマトキシリン染色剤で30秒間染色し、流水で洗浄します。次に、スライスを75%、85%、95%、無水エタノールにそれぞれ3分間浸し、次にキシレンに2 x 10分間浸します。手順7.4の説明に従ってスライドを密封します。</li>
</ol>10. ウェスタンブロット解析
<ol><li>冷凍庫から肺組織を取り出し、重さを量ります。次に、肺組織20mgあたりPMSFを含むRIPA溶解バッファー150μLを添加します。ハンドヘルドホモジナイザーを使用してマウスの肺を氷上で3〜5分間溶解し、肺組織を適切に溶解できるように4°Cで2時間静かに振とうし、4°Cおよび14,800 × g で15分間遠心分離し、上清を回収します。 注:RIPA溶解バッファーを使用する数分前に、100 mMのフェニルメタンスルホニルフルオニルフルオリド(PMSF)を添加します。PMSFの最終濃度は1 mMです(例えば、PMSF10 μL + RIPA990 μL)。</li>
	<li>BCAタンパク質濃度キットを使用して、メーカーの指示に従ってサンプルのタンパク質濃度を測定します。測定後、最小濃度のタンパク質ライセートをベースとして使用し、同じバッチのタンパク質ライセートをRIPAで最小濃度に希釈して、同じ質量と容量を実現します。 注:肺組織負荷の総量は30μgです。</li>
	<li>160 μLのプロテインライセートに40 μLの5倍ローディングバッファーを加え、100°Cで10分間加熱します。</li>
	<li>準備した10%ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)ゲルをウェスタンブロッティング電気泳動システムで組み立て、SDS-PAGE電気泳動バッファーを添加し、電気泳動コームを静かに引き出し、ウェルあたり20μLのタンパク質サンプルをゆっくりと均一に加えます。電源を入れ、80Vで30分間電気泳動を開始します。タンパク質が下部ゲル層に達したら、100Vに切り替え、60〜70分間電気泳動を続けます。 注:電気泳動には新しい電気泳動バッファーが必要です。</li>
	<li>湿式転写によりタンパク質をPVDFメンブレンに転写します。事前にメタノールでPVDFメンブレンを活性化します(5〜30秒)。電気泳動ゲルプレートを取り出し、慎重にこじ開け、セパレーターゲルを湿式転写バッファーに入れ、電気転写サンドイッチを作り、湿式転写システムを組み立てます。電気泳動タンクに転写バッファーを充填し、400 mAで90分間移送します。 注:転写バッファーは、湿式転写中の高温の影響を避けるために、事前に冷却されています。</li>
	<li>PVDFメンブレンを0.5%Tween-20(TBST)を含むトリス緩衝生理食塩水で3 x 5分間洗浄します。TBSTで希釈した5%スキムミルクでPVDFメンブレンをブロックし、シェーカー上で室温で60分間インキュベートします。その後、TBSTで2分間洗浄します。洗浄後、一次抗体ビメンチン(1:5,000)およびGAPDH(1:10,000)を5%BSAで希釈したメンブレンを4°Cで一晩インキュベートします。</li>
	<li>メンブレンを室温で30分間置き、TBSTで5 x 5分間洗浄します。洗浄後、5%スキムミルクで希釈した二次抗体(1:10,000)とメンブレンを室温で60分間インキュベートします。</li>
	<li>メンブレンをタンパク質側を上にして置き、調製したECLワーキング溶液を滴下し、1〜2分間インキュベートし、ゲルイメージャーで結果を観察します。ゲルイメージャーのソフトウェアで測定されたグレースケール値を使用して、タンパク質発現レベルを評価します。 注:ここでは、GAPDHが内部リファレンスとして機能しました。</li>
</ol>

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</ol>

すべての著者は、利益相反がないことを宣言します。

ニコチンと結晶性二酸化ケイ素への同時曝露の役割と潜在的なメカニズムを調査するには、二重曝露動物モデルが必要です。このモデルは、ニコチンの皮下注射とシリカの点鼻滴によってこの作業で達成されました。ニコチン注射を成功させるには、首の後ろの皮膚をつかむと痛みを伴う可能性があるため、オペレーターはマウスのつかみ方に慣れる必要があります。したがって、マウスが把持に徐々に適応できるようにすることが重要です。さらに、マウスのシリカ曝露における重要なステップは、点鼻薬です。手術の成功率とマウスの生存率を高めるためには、事前に点鼻薬の練習が不可欠です。
注射を行うときは、マウスが注射器を見たときに強い闘争を避けるために、注射器をマウスの頭上をすくい取る必要があります。ネズミの尻尾は右手でしっかりとつかみ、左手で首の後ろの耳の縁まで皮膚を丁寧に優しく押し上げ、そこの皮膚をつまみます。右手でネズミの尻尾を離した後、噛みつきを防ぐために左手の親指と薬指で尻尾と後肢を安定させます。右手に1 mLのシリンジを使用して、針を首の上の緩い皮膚に頭から尾の方向に30°の角度で挿入する必要があります。.抵抗が失われた...

作業者のシリカ曝露は、一部の職業環境では避けられず、一度シリカに曝露すると、環境から除去した後でも劣化が進行します。さらに、これらの労働者のほとんどが喫煙しており、従来のタバコには何千もの化学物質が含まれており、主な中毒性成分はニコチン1です。電子たばこは、若い年齢層でますます人気が高まっています2。これらの電子タバコはニコチン送達システムとして機能し、ニコチンへのアクセスを増加させ、肺感受性と肺炎を増加させます3。また、タバコの煙は、ブレオマイシンに曝露されたマウスの肺線維症を加速し4、シリカに曝露されたマウスの肺毒性と線維症を増加させます5,6。ただし、ニコチンがシリカによって引き起こされる炎症性および肺線維症プロセスに影響を与える可能性があるかどうかは、まだ調査されていません。
高用量のシリカを気管に1回吸入することによって確立された珪肺症マウスモデルは、マウスにとって外傷性です。この方法では、珪肺症モデルがすぐに提供されますが、作業者が繰り返しシリカにさらされる環境の現実には一致しません。そこで、点鼻薬 で 低用量のシリカ懸濁液を繰り返し投与することで、シリカ曝露マウスモデルを確立しました。この用量は、マウスに炎症や線維症を引き起こす可能性があります。.
他のタバコ成分の影響を回避するために、このマウスモデルを首のゆるい皮膚にニコチンを皮下注射し、中毒性成分であるニコチンが珪肺症に及ぼす影響を測定しました。皮下注射を投与することで、正確な投与が可能となり、ニコチン曝露モデルの作成や用量毒性反応、中毒の観察が可能になります。ニコチン中毒モデルは、0.2-0.4 mg / kg 7,8のニコチン注射用量で、雄マウスで開発されています。このモデルでは、中毒マウスの薬物探索ニーズを満たすために、12時間間隔で2回の皮下注射を行った。このマウスのニコチン依存症モデルは、ヒトの喫煙習慣とシリカへの曝露をシミュレートするのに役立ちます。
単一因子動物モデルには疾患研究の限界があるのに対し、ここで説明する方法は、ニコチンとシリカの共曝露の2因子マウスモデルを含みます。シリカ曝露の前に、マウスは喫煙者のニコチン曝露を再現するためにニコチンに事前曝露されました。その後、喫煙歴のある個人の作業環境でシリカ曝露を模倣するために、5日目から19日目までシリカ曝露が行われました。
肺胞マクロファージは、肺の炎症や線維化の調節に重要な役割を果たすことが知られています。マクロファージはシリカを吸入してもシリカを分解できず、マクロファージの分極またはアポトーシス9 を引き起こし、腫瘍壊死因子α(TNF-α)やトランスフォーミング成長因子β(TGF-β)などのサイトカインを放出します。表面マーカーCD86の存在によって識別されるM1マクロファージは、珪肺症における炎症反応の主要な扇動者であり、CD206によってマークされるM2マクロファージは、状態10の線維化期の原因である。二重ばく露マウスでは、ニコチンはシリカ損傷肺のマクロファージのM2表現型への分極を誘導し、肺線維症を促進しました。さらに、TGF-β1は線維症およびEMT11の誘導の鍵である。TGF-β1の発現増加は、EMTによる肺線維症の進行を加速させました。このモデルは、珪肺症に対するニコチンの効果を分析することに成功し、ニコチン禁煙の重要性をさらに強調しました。

<table><tbody><tr><td>10%ホルマリン中性固定剤</td><td>南昌Yulu実験装置有限公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>アルコール消毒剤</td><td>Xintai Kanyuan Disinfection Products Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA、フラクションV</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>ST023-200g</td><td></td></tr><tr><td>CD206モノクローナル抗体</td><td>Proteintech</td><td>60143-1-IG</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸抗原賦活化液</td><td>バイオシャープライフサイエンス</td><td>BL619A</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルベンゼン</td><td>West Asia Chemical Technology (Shandong) Co</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Enhanced BCA Protein Assay Kit</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>P0009</td><td></td></tr><tr><td>GAPDHポリクローナル抗体</td><td>プロテインテック</td><td>10494-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>C0105S</td><td></td></tr><tr><td>HRP substrate</td><td>Millipore Corporation</td><td>P90720</td><td></td></tr><tr><td>HRP 標識アフィニピュアヤギ 抗マウス IgG(H+L)</td><td>プロテインテック</td><td>SA00001-1</td><td></td></tr><tr><td>HRP 結合アフィニピュアヤギ 抗ウサギ IgG(H+L)</td><td>プロテインテック</td><td>SA00001-2</td><td></td></tr><tr><td>ImmPACT[R] DAB EqV ペルオキシダーゼ (HRP) 基質</td><td>ベクター研究所</td><td>SK-4103-100</td><td></td></tr><tr><td>Masson's Trichrome Stain Kit</td><td>Solarbio</td><td>G1340</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Macklin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nicotine</td><td>Sigma</td><td>N-3876</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)&nbsp;</td><td>バイオシャープ</td><td>BL601A</td><td></td></tr><tr><td>生理食塩水&nbsp;</td><td>淮南市</td><td></td><td></td>第一人民病院</tr><tr><td>PMSF</td><td>Beyotime Biotechnological</td><td>ST505</td><td></td></tr><tr><td>正の蛍光顕微鏡</td><td>OlympusCorporation</td><td>BX53+DP74</td><td></td></tr><tr><td>染色済みカラータンパク質分子量&nbsp;マーカー、または染色済みカラータンパク質ラダー</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>P0071</td><td></td></tr><tr><td>PVDF膜</td><td>Millipore</td><td>3010040001</td><td></td></tr><tr><td>RIPA Lysis Buffer</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>P0013B</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGEゲル調製キット</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>P0012A</td><td></td></tr><tr><td>二酸化ケイ素</td><td>Sigma</td> <td>#BCBV6865</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&ベータ;</td><td>Bioss</td><td>bs-0086R</td><td></td></tr><tr><td>ビメンチンポリクローナル抗体</td><td>プロテインテック</td><td>10366-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>材料名/設備名</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mL チューブ</td><td>バイオシャープ</td><td>BS-05-M</td><td></td></tr><tr><td>振動サーモスタット金属浴</td><td>アブソン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>パラフィン包埋機</td><td>精密(常州)医療機器有限公司</td><td>PBM-A</td><td></td></tr><tr><td>パラフィンスライ</td><td>サーJinhuaクラタイインスツルメンツ株式会社</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ピペット</td><td>エッペンドルフ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>偏光顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>BX51</td><td></td></tr><tr><td>精密天びん</td><td>Acculab</td><td>ALC-110.4</td><td></td></tr><tr><td>RODI IOTインテリジェント多機能浄水システム</td><td>RSJ</td><td>RODI-220BN</td><td></td></tr><tr><td>Scilogex SK-D1807-E 3Dシェーカー</td><td>Scilogex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Small動物用麻酔器</td><td>Anhui Yaokun Biotech Co., Ltd.</td><td>ZL-04A</td><td></td></tr><tr><td>ユニバーサルピペットチップ</td><td>KIRGEN</td><td>KG1011</td><td></td></tr><tr><td>ユニバーサルピペットチップ</td><td>KIRGEN</td><td>KG1212</td><td></td></tr><tr><td>ユニバーサルピペットチップ</td><td>KIRGEN</td><td>KG1313</td><td></td></tr><tr><td>ボルテックス&nbsp;ミキサー&nbsp;</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>素材名・機材</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adobe Illustrator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photoshop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prism7.0</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

肺上皮間葉転換を促進するためのシリカ曝露マウスモデルでのニコチンの使用

Using Nicotine in a Silica-Exposed Mouse Model to Promote Lung Epithelial-Mesenchymal Transition

喫煙とシリカへの曝露は職業労働者の間で一般的であり、シリカは非喫煙者よりも喫煙者の肺を傷つける可能性が高くなります。タバコの主要な中毒性成分であるニコチンが珪肺症の発症に果たす役割は不明です。本研究で用いたマウスモデルは、単純で制御が容易であり、ヒトの上皮間葉転換による肺線維症に対する慢性ニコチン摂取とシリカへの反復曝露の影響を効果的にシミュレートしました。さらに、このモデルは、タバコの煙に含まれる他の成分の影響を回避しながら、珪肺症に対するニコチンの影響を直接研究するのに役立ちます。
環境適応後、マウスに0.25mg/kgのニコチン溶液を首の上のゆるい皮膚に、毎朝夕方、12時間間隔で40日間皮下注射した。さらに、結晶性シリカ粉末(1〜5μm)を通常の生理食塩水に懸濁し、20mg/mLの懸濁液に希釈し、超音波水浴を用いて均一に分散させた。イソフルラン麻酔をかけたマウスは、このシリカダスト懸濁液50μLを鼻から吸入し、胸部マッサージ で 目覚めさせた。シリカ曝露は、5〜19日目に毎日投与されました。
二重ばく露マウスモデルをニコチンにばく露し、次にシリカにばく露したが、これは両方の有害因子にばく露された労働者のばく露歴と一致した。さらに、ニコチンはマウスの上皮間葉転換(EMT)を介して肺線維症を促進しました。この動物モデルは、珪肺症の発症に対する複数の要因の影響を研究するために使用できます。

マウスの珪肺症の進行におけるニコチンの潜在的な役割を調査するために、シリカ曝露と組み合わせたニコチンを研究するマウスモデルが確立されました。 図1 は、ニコチン注射とシリカ懸濁液の点鼻を組み合わせた二重曝露マウスモデルを使用した実験手順を示しています。各群のマウスの病理学的変化は、HE染色を用いて観察された。ニコチンとシリカの組み合わせに曝露されたマウスは、ニコチンまたはシリカのみに曝露されたマウスよりも有意に重度の肺損傷を示しました。ニコチンに曝露したマウスの肺のリンパ管付近でリンパ球が増加し、炎症性細胞塊を形成した。マッソン染色では、ニコチンとシリカの組み合わせに曝露された肺では、他のグループの肺と比較してコラーゲン線維沈着が有意に増加し、これはマッソン染色の定量化によって裏付けられました(図2)。シリカ曝露マウスでは肺胞構造が破壊され、マクロファージの数が増加しました。しかし、シリカと結合したニコチンに曝露した後、著しい炎症性細胞浸潤があり、線維芽細胞結節が現れました。さらに、蓄積されたマクロファージ、特にM2マ...

この研究では、実験的な珪肺症マウスの肺線維症の進行に対するニコチンの相乗効果を研究するためのマウスモデルについて説明します。二重曝露マウスモデルは、ニコチンとシリカに同時に曝露した後の肺の病理学的進行をシミュレートします。説明されている方法は単純で再現性が高いです。

Smoking and exposure to silica are common among occupational workers, and silica is more likely to injure the lungs of smokers than non-smokers. The role ...

この研究で採用されたマウスモデルは、ヒトの上皮間葉転換を通じて、慢性的なニコチン摂取とシリカへの反復曝露が肺線維に及ぼす影響を効果的にシミュレートします。陪審員部分モデルは、ニコチンの皮下注射とシリカの点鼻滴によって、簡単で信頼性の高い方法で達成されました。滅菌結晶性シリカを生理食塩水に懸濁して、20ミリグラム/リットルの懸濁液を調製します。超音波振とう水浴中で25分間振動させます。シリカ懸濁液を渦振動器で3分間置きます。懸濁液を吸引して混合し、50マイクロリットルを点鼻液に使用します。シリカ曝露を開始するには、まず、麻酔マウスを片手のひらに置き、マウスの鼻腔を露出させます。4〜8秒以内に1つの鼻孔から50マイクロリットルのシリカ懸濁液を注入します。懸濁液の肺への迅速な浸透を可能にするために、人差し指でマウスの胸を3〜5秒間そっと押し、呼吸数を維持するために毎秒3〜5回押すことを繰り返します。.マウスが均一な呼吸を示したら、ケージ内で3分間観察します。ニコチンシリンジは、1ミリリットルのシリンジに0.2ミリリットルのマークまで空気を引き込むことによって準備します。次に、125マイクロリットルのニコチンを吸い上げます。シリンジをタップして針と前端をニコチンで満たし、光から保護されたトレイに置きます。右手でネズミの尻尾をつかみます。マウスがリラックスしたら、左手の親指と人差し指を使用して、尾から耳の端までの皮膚に適度な圧力をかけます。次に、右手を離し、左指、小指、薬指を使用して尻尾と後肢をつまみ、マウスを固定します。注射器を右手に持ち、首の後ろの皮膚を頭から尾の方向に穿刺します。ニコチンを均一な速度で注入します。麻酔をかけたマウスをフォームテストプレートに固定し、毛皮に75%アルコールをスプレーします。腹部の正中線に沿って切開し、胸腔を露出させます。心臓の右側の頂点に小さな切り込みを入れます。予冷したPBSを左心尖部から20ミリリットルをゆっくりと均一に注入し、右心尖部にできた開口部から血液を流出させます。肺葉全体を切除し、マイナス80°Cで冷蔵保存します。残りのマウスに10ミリリットルの4%パラホルムアルデヒドを灌流します。PBS灌流後、肺を30ミリリットルのパラホルムアルデヒド溶液で保存します。72時間後、準備した固定液に肺を浸し、超音波水浴に入れます。摂氏40度で30分間焼き戻します。次に、組織を75%エタノール、次に95%エタノール、次に無水エタノールにそれぞれ50分間入れて脱水を行います。肺組織をキシレンに50分間2回浸して洗浄します。溶かしたパラフィンワックスに組織を入れ、摂氏55〜60度で2〜3時間置きます。ワックスが固まったら、切片化機を使用して、厚さ4〜5マイクロメートルの肺スライスを取得します。切片を超純水で45°Cで加熱します。ワックスが溶けたら、肺切片を接着顕微鏡スライドに置きます。ヘマトキシリンとエオシンの染色研究では、ニコチンとシリカの組み合わせに曝露されたマウスは、ニコチンまたはシリカのみに曝露されたマウスよりも有意に重度の肺損傷があることが示されました。Massonの染色により、ニコチンシリカの組み合わせに曝露された肺のコラーゲン線維沈着が他のグループと比較して増加していることが明らかになりました。シリカに曝露したマウスでは、肺胞構造が破壊された。免疫組織化学的研究により、ニコチンとシリカの組み合わせに曝露されたマウスにおいて、CD 2 zero 6陽性マクロファージと線維化促進因子であるTGFベータ1陽性細胞の増加が明らかになりました。ビメンチンの発現は、二重発現を受けたマウスでは、他のグループと比較して高かった。免疫組織化学的研究およびタンパク質定量化は、重度の上皮間葉転換を示唆している。ニコチン注射を成功させるには、首の後ろの皮膚をつかむと痛みを伴う可能性があるため、オペレーターはマウスのつかみ方に慣れる必要があります。

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Medicine

医学

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エアー液界面におけるマウスの呼吸器上皮細胞と実験たばこの煙への暴露の分離

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全身吸入システムを用いたマウスのタバコの煙暴露

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&gt;jove_content&lt;局所的な血管新生を刺激する臓器特異的微小環境の再現は、損傷した組織の正常な再生に不可欠です。本報告は、成体マウスにおいて、肺特異的微小環境が血管新生と肺胞再生をどのように調節するかを探るために、生きたマウスの肺表面にフィブリンゲルを移植する新しい方法を示すものである。...

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ex vivoでの肺灌流（EVLP）臓器を評価し、ドナープールを拡張する機能を有効にすることで、より容易に利用できるようになるためにヒトでの肺移植を可能にした。ここでは、ラットのEVLPプログラムと将来の拡張のための再現可能なモデルを可能に改良の開発について説明します。...

孤立の方法<em&gt;エクスビボ</emラットモデルにおける&gt;肺灌流：ラットEVLPプログラムの開発の教訓

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肺上皮間葉転換を促進するためのシリカ曝露マウスモデルでのニコチンの使用

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