マイコバクテリアの天然および組換え細胞外小胞の濃縮
2023年12月8日
このプロトコルでは、マイコバクテリウム・スメグマティス(Msm)の軸種培養からの天然マイコバクテリア細胞外小胞(mEV)の濃縮と、mCherry(赤色蛍光レポーター)含有組換えMsmEVsの設計と濃縮方法について詳しく説明します。最後に、結核菌のEsxAタンパク質を含むMsmEVを濃縮することで、新しいアプローチを検証します。
マイコバクテリアのEVを濃縮することで、その内容の解明、派閥の解明、そして主にワクチン候補を利用する組換えEVの構築と生成の方法を設計することができます。6つの系列は、バクテリア表面の異なる位置から生成されます。保存されたマーカーはありません。
したがって、アフィニティベースのアプローチでは、EVのサブセットしか強化できません。これに対し、本手法では、生成したマイコバクテリアEVをすべて捕捉します。手順を実演するのは、私の研究室の博士課程の学生であるMohd Ilyasです。
まず、野生型または組換えマイコバクテリウム・スメグマチスのグリセロールストック1ミリリットルを、予熱した7H9ブロス10ミリリットルを含む50ミリリットルの遠心チューブに加えます。蓋を閉め、チューブを渦巻かせてから、摂氏37度で200〜220RPMで培養液を一晩インキュベートします。翌日、600ナノメートルでの光学濃度が約1に達したら、培養液を3,200gで室温で10分間遠心分離し、上澄み液を液体廃棄容器に廃棄する。
予め温めたSautons培地1ミリリットルを加え、静かに再懸濁して均一な懸濁液を得ます。Sautons培地を使用して容量を10ミリリットルに構成します。再度遠心分離し、上清を廃棄する。
洗浄後、細菌細胞を再懸濁します。予め温めた20ミリリットルのソートン培地で、600ナノメートルの光学密度を測定します。330ミリリットルのソートン培地を含む1〜2リットルの三角フラスコに必要量の細菌懸濁液を接種し、光学濃度が0.3に達するまで摂氏37度、200RPMでインキュベートします。
翌日、以前に示したように細胞を一度洗浄し、1/10 Tween 80を含む330ミリリットルのソートンにペレットを再懸濁します。50ミリリットルの細胞懸濁液を6つの1リットルフラスコに分配し、それぞれに1/10 Tween 80を含む280ミリリットルの予熱したオートンを入れます。光学濃度が2〜2.5に達するまで、摂氏37度、200RPMで培養物をインキュベートします。
400ミリリットルのボトル6本に2リットルの指数関数的培養物を加え、8, 000Gで摂氏4度で20分間遠心分離します。上清と事前に冷却したオートクレーブ滅菌したフラスコまたはビーカーを回収し、分析手順のためにペレットのアリコートを保管します。ペレットは、EVがmCherryの組換え体の場合は着色され、非蛍光タンパク質の野生型または組換え体の場合は茶色になります。
培養上清を0.45ミクロンの廃棄フィルターでろ過し、続いて0.22ミクロンのフィルターでろ過して、バクテリアの痕跡をすべて除去します。次に、30キロダルトンのメンブレン濃縮器を15ミリリットルの二重蒸留水で4, 000Gで摂氏4度で20分間予洗します。次に、同じ条件で15ミリリットルの事前にろ過された冷たいオートン培地で洗浄し、化学物質の痕跡をすべて除去します。
洗浄後、15ミリリットルの濾過培養上清を濃縮器に加え、摂氏4度で20分間、4, 000Gで濃縮する。濃縮液を冷たい40ミリリットルのオークリッジ遠心分離管または50ミリリットルの新鮮なファルコン遠心分離管に移します。2リットルの培養濾液全体が濃縮されたら、濃縮液を二重蒸留、洗浄、および予冷した50ミリリットルのポリプロピレン遠心分離管に移し、2段階の遠心分離にかけます。
最初に 4 、 000 G で、次に 15 、 000 G.Transfer で遠心分離された濃縮物を事前に冷やした 38.5 ミリリットルの超遠心チューブに入れ、 100 、 000 G で 4 °C で 4 時間回転させます。上清を、あらかじめ冷やした50ミリリットルの新鮮なFalcon遠心チューブに集めます。超遠心チューブを糸くずの出ない新しい吸収紙にひっくり返して上清の痕跡を除去し、ペレットを600マイクロリットルのHEPES緩衝液に再懸濁します。
再懸濁したペレットを13 mmリットルの冷蔵済みUltraClearポリプロピレン超遠心チューブの底に重ね、4 mmリットルの不活性60%密度グラジエントイオジキサノール溶液と穏やかに混合します。次に、40%、30%、20%、および10%のヨウジキサノールをそれぞれ1ミリリットルで重ね合わせます。上部に4ミリリットルの6%ヨウジキサノールを加えてチューブを満たします。
ガラスビーカーまたはスタンドでチューブを慎重に計量した後、スイングバケットに静かに移し、次にスイングバケットローターに移して、摂氏4度で16時間、141、000Gで超遠心分離します。超遠心分離後、チューブを慎重に取り外し、1ミリリットルの画分をオートクレーブ処理した微量遠心チューブに回収します。TEM分析では、マイコバクテリアのEVが円形であることが示され、ナノトラッキング分析により、直径20〜250ナノメートルのさまざまなサイズのEVが確認されました。
mCherryのN末端がCFP-29のC末端に翻訳融合すると、Msmの濃縮されたmEVの一部がピンク色に変色し、cf-29が目的の外来タンパク質を運ぶ能力を示しました。その後、CFP-29を使用して、Msm EVへのEsxAの供給を評価しました。MtbのEsxAは、Msm EVで少量観察された。
CFP-29 EsxA 3X FLAGは、mEVでより安定し、より高いレベルで蓄積されました。生理学的に異なる条件下で増殖したマイコバクテリアからEVを濃縮することで、持続的な感染力、病原性、病原体の拡散を左右する内容の変化や機能の変化に関する洞察が得られます。
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概要
本プロトコルでは、Mycobacterium smegmatis (Msm) の純粋培養物から天然のマイコバクテリウム由来細胞外小胞 (mEVs) を濃縮する方法について詳述します。また、mCherry含有組換えMsmEVsの設計および濃縮についても説明し、Mycobacterium tuberculosisのEsxAタンパク質を含むMsmEVsの濃縮を通じて、この新しいアプローチの有効性を検証します。
研究の主要構成要素
科学分野
- 微生物学
- ワクチン開発
- 細胞外小胞
背景
- マイコバクテリアの細胞外小胞（EV）は、細胞間コミュニケーションにおいて重要な役割を果たしています。
- 細菌表面のさまざまな部位から、異なる種類のEVが生成されます。
- 保存されたマーカーが欠如しているため、アフィニティーベースの手法ではEVの一部しか濃縮できません。
- 本研究では、生成されるすべてのマイコバクテリアEVを回収する方法を提示します。
研究目的
- 成分分析のために、天然のマイコバクテリウム由来EVを濃縮する。
- ワクチン候補となる組換えEVを設計し、作製する。
- EV内部の特定タンパク質を濃縮するための新しいアプローチを実証する。
使用された手法
- Mycobacterium smegmatisの無菌培養液からのmEVsの単離。
- mCherryを含む組み換えmEVsの設計。
- EsxAタンパク質を含むmEVsの濃縮。
- 実験手順による濃縮法の検証。
主な結果
- Mycobacterium smegmatisからの天然mEVの濃縮に成功。
- mCherry含有組換えmEVの開発。
- EsxAタンパク質含有mEVを用いた手法の検証。
- 研究室の博士課程学生による手順の実演。
結論
- 本手法により、マイコバクテリア由来EVの包括的な濃縮が可能になります。
- ワクチン開発に向けて、組換えmEVを設計することができます。
- このアプローチは、マイコバクテリア由来EVの機能に関する理解を深めます。
よくある質問
産業上の重要性
天然および組換えマイコバクテリア細胞外小胞（EVs）の包括的な濃縮により、小胞の内容物と機能の精密な解析が可能となり、ワクチンおよび感染症研究における初期段階のターゲット検証やメカニズムのデリスキングが促進されます。特定の免疫原やリポーターを含むEVsを設計し単離できる能力は、抗原送達および小胞介在性の生物学的効果を評価するための堅牢なプラットフォームを提供します。このワークフローは、ワクチン候補の評価およびポートフォリオの選別における、探索から前臨床段階への移行界面での予測信頼性を高めます。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
早期発見およびターゲットバリデーション
- 標的バリデーションに向けた、小胞関連タンパク質および免疫原の体系的な解析を可能にします。
- 天然および設計されたEVの生物学的役割を明らかにすることで、メカニズム的なリスク低減を支援します。
- 小胞システム内における抗原の組み込みおよびデリバリーの機能評価を促進します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 再現性の高いダウンストリームアッセイを実現するため、EVの標準化された濃縮を提供します。
- EVへのリコンビナントタンパク質ローディングの定量的および定性的評価を可能にします。
- ベシクルベースのスクリーニングに向けた、スケールアップ可能で再利用可能なプラットフォームの開発を支援します。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 疾患に関連する免疫原のデリバリーと小胞内容物解析を整合させ、トランスレーショナル研究への適用を可能にします。
- 小胞ベースのワクチン候補の探索から前臨床検証までの一貫したフローを実現します。
- 小胞を介した抗原提示を特性評価することで、リスクを調整した開発進展の意思決定を支援します。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、初期の仮説検証やターゲットバリデーションから、アッセイ開発、そして小胞ベースの候補物質の前臨床評価に至るまで、創薬の連続的なプロセスに統合されます。
- 探索生物学：ベシクルの内容物および機能に関する仮説駆動型の解析をサポートし、メカニズムを明確にします。
- スクリーニング：アッセイの標準化および化合物の評価に向けた、再現性のある定量的なEV調製物を提供します。
- 分析：サイズ、内容物、およびタンパク質組み込みデータを提供し、天然EVと組換えEVを比較します。
- トランスレーショナルリサーチ：ベシクルエンジニアリングと、疾患に関連した免疫原デリバリーとの整合を可能にします。
- エンタープライズ再利用：多様なマイコバクテリウム系におけるEV濃縮のための、再利用可能なワークフローを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 小胞ベースの候補物質評価における予測信頼性を高め、メカニズム的な曖昧さを軽減する。
- 運用的価値： EV濃縮を標準化し、R&Dチーム全体での再現性と拡張性を確保する。
- 戦略的価値： 強固なターゲットおよび抗原バリデーションを可能にすることで、go/no-go判断を改善し、資本効率を向上させる。
- ポートフォリオへの影響： 小胞ベースのワクチンおよび治療薬候補のリスク調整済み優先順位付けを支援する。
実施上の検討事項
- 細菌培養、小胞の単離、およびタンパク質工学の専門知識が必要です。
- EVの特性解析のための超遠心分離機および分析機器へのアクセスが求められます。
- 濃縮および分析プロトコルのチーム間での標準化が必要です。
- 異なるマイコバクテリウム属の種や免疫原構築物に合わせて適応させる必要がある場合があります。
- 保存されたマーカーの欠如により、アフィニティーベースの濃縮ではすべてのEVサブタイプを回収できない可能性があります。
