フローサイトメトリーにおける 枯草菌 胞子の計数と標識解析の改善

枯草菌の胞子の細胞カウンターは、従来の方法を使用して完全に手作業で行うことができ、オペレーターの経験に応じて精度を変更することができるため、面倒な作業になる可能性があります。このプロトコルは休眠および発芽の胞子の列挙を可能にする。さらに、この技術により、その表面の蛍光タンパク質のコーピングの割合を決定することも可能になります。

このプロトコルに存在するセットアップステップを考えると、ビジョンは、この実行における設備と技術的な理解とケアの詳細を示しています。まず、サイトメーターソフトウェアにログインします。ソフトウェアワークスペースで、Cytometerを選択し、続いてFluidic Startupを選択します。

次に、[クリーニングモード]を選択します。最後に、SIT フラッシュを開始します。50マイクロリットルのオートクレーブス胞子を採取し、エチジウムブロマイドと0.05体積%の希釈率で30分間、光から保護してインキュベートします。

17, 949 Gで10分間遠心分離し、PBSに再懸濁することにより、胞子をPBSで3回洗浄します。次に、メーカーの希釈推奨に従って10マイクロリットルのビーズを添加し、フローサイトメーターを使用してサンプルを分析します。ネガティブコントロールを基準として、粒子の形態測定特性と蛍光特性に基づいてゲーティング戦略を定義します。

次に、チューブを静かに混ぜます。フローサイトメータープローブに取り付け、Acquireをクリックします。レーザー出力を設定するには、サイトメーターウィンドウのパラメータータブに移動し、前方散乱を 375 に、側方散乱を 275 に調整します。

次に、しきい値タブを選択し、500に設定します。次に、胞子のみを含む無染料サンプルを分析して、自家蛍光を排除します。パラメータータブで、フィルター検出器 3 の電圧を 603 に、フィルター検出器 5 の電圧を 538 に調整し、コントロールの蛍光を使用して負の母集団と陽性の母集団を区別します。

次に、[補正] をクリックし、フィルター検出器 5 x 3 のセットアップ オフセットを 1 に設定します。取得用にデバイスを構成するには、 [実験] を選択し、実験レイアウトを選択して、取得を 30, 000 イベントに設定します。パラメータを調整した後、フローサイトメーターで標識され、ビーズを含むサンプルのデータを取得します。

50マイクロリットルの胞子を17, 949 gで10分間遠心分離する。次に、25マイクロリットルの1-エチル-3-3-ジメチルアミノプロピルカルボジイミドを使用して胞子を再懸濁し、15分間インキュベートします。その後、25マイクロリットルのN-ヒドロキシスルホコハク酸イミドを50ミリモルの濃度で胞子懸濁液に加える。

胞子懸濁液を室温で30分間インキュベートします。前述したように、遠心分離機によりPBSで胞子を3回洗浄します。サンプルに蛍光タンパク質を添加し、摂氏15度で一晩インキュベートします。

1〜50に希釈したエチジウムブロマイドを1ミリリットルあたり10ミリグラム添加し、サンプルを1時間氷上に放置し、光から保護します。胞子を洗浄し、前述のようにゲートを定義した後、ドットプロットのx軸のフィルター検出器3とY軸のフィルター検出器5のパラメーターを変更します。カウンティングビーズ法は、オートクレーブ胞子サンプル中の1マイクロリットルあたり10〜3回の胞子を2回検出しました。

オートクレーブ胞子サンプルのエチジウムブロマイド染色は、オートクレーブ非胞子の染色よりも高い平均蛍光強度を示し、遺伝物質の染色が高いことを示しています。オートクレーブ胞子表面は、APC標識された抗ヒトインターロイキン10抗体と結合し、非オートクレーブ胞子と比較して高い結合効率を示しました。エチジウムブロマイドを透過する胞子の存在は、全個体群に発芽胞子が存在する可能性を示しました。

フローサイトメトリー解析に基づき、蛍光抗体は、発芽した胞子と比較して、休眠胞子との結合率が高いことが観察されました。さらに、蛍光抗体の濃度が上昇するにつれて、結合胞子の割合と平均蛍光強度の増加が観察されました。フローサイトメトリーと胞子の正確な計数により正確な読み取り値を確保するために、電流ビーズの完全な均質化を行うことが重要です。

胞子に付着する抗原の濃度を標準化するカナダの研究では、ワクチン抗体としての胞子の使用を分析しています。