Name: 狂犬病抗原を封入した拍動性高分子微粒子の作製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: 学ぶ狂犬病抗原を封入した拍動性高分子微粒子の作製法。PLGAを用いた単回注射型ワクチン技術で、低中所得国での予防接種アクセス向上に貢献します。

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我々は、Particles for HumanityにRABV抗原を提供してくれたChiron BehringとBharat Biotech Internationalに感謝する。また、チャールズ・ルプレヒト、VMD、MS、PhD.の貴重なガイダンスと技術的貢献に感謝したいと思います。著者らは、SciFLEXARRAYER S3ピコリットル分注装置の使用を許可してくれたRebecca Richards-Kortum博士の寛大さと、この装置の使用に関するChelsey Smith博士の指示に感謝したいと思います。また、狂犬病抗原の顕微鏡画像を生成したマサチューセッツ大学チャン医科大学にも感謝します。最後に、提出前に文書をレビューしてくれたドン・チッカリングとエリン・エウリアーノに感謝します。この研究は、ビルアンドメリンダゲイツ財団からの助成金(INV-004360)によってサポートされました。

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<li>Peyre, M., Sesardic, D., Merkle, H. P., Gander, B., Johansen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+divalent+vaccine+based+on+biodegradable+microspheres+induces+protective+immunity+against+tetanus+and+diphtheria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">An experimental divalent vaccine based on biodegradable microspheres induces protective immunity against tetanus and diphtheria.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 92 (5), 957-966 (2003).</li>
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<li>McHugh, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+fillable+microparticles+and+other+complex+3D+microstructures%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fabrication of fillable microparticles and other complex 3D microstructures.</a> Science. 357 (6356), 1138-1142 (2017).</li>
<li>Sanchez, M. E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rabies+vaccine+characterization+by+nanoparticle+tracking+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Rabies vaccine characterization by nanoparticle tracking analysis.</a> Scientific Reports. 10 (1), 8149(2020).</li>
<li>Fu, K., Pack, D. W., Klibanov, A. M., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+evidence+of+acidic+environment+within+degrading+poly%28lactic-co-glycolic+acid%29+%28PLGA%29+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Visual evidence of acidic environment within degrading poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres.</a> Pharmaceutical Research. 17 (1), 100-106 (2000).</li>
</ol>

マクヒュー博士は、包含された研究に基づいて特許を申請しており、現在はParticles for Humanityのコンサルタントです。グラフ氏は、包含された仕事に基づいて特許を申請しています。カダシア博士、ヤン氏、ブレイディ氏は、この作業中にMITから同様の微粒子ワクチン送達技術をライセンス供与した公益法人であるパーティクルフォーヒューマニティの一部です。

特定のニーズに合わせてパーティクルジオメトリを変更することができます。ただし、円筒構造の場合、著者らは、プロトコルに記載されている高さ:直径:壁の厚さの5:4:1の比率を維持することを推奨しています。このアスペクト比により、粒子を密封するのに十分なPLGA材料が存在し、取り扱いに十分な機械的堅牢性を維持します。粒子の寸法と形状はCADプロセス中に簡単に変更できるため、無数の形状を生成できます。CADの柔軟性と3Dプリントを組み合わせることで、微粒子設計の迅速な反復が可能になります。このプロトコルは多光子3Dプリンタを使用しますが、微細構造寸法を適切な材料で印刷できる仕様の任意の3Dプリンタを使用して、最初のマスターモールドを生成できます。さらに、フォトリソグラフィは、このプロトコルで生成されたものよりもはるかに大きなアレイ内の同様の構造を作成するために以前に使用されてきました。しかし、手間、カスタムメイドのフォトマスクの注文の遅れ、機器のアクセシビリティにより、反復的な設計プロセスが遅くなります16。最後に、社内のマスターモールド製造が不可能な場合、マスターモールドの生成は有料サービス会社にアウトソーシングできます。マスターモールドの生成に使用される3Dプリンターや方法に関係なく、プリントの基板への接着は、下流のステップで重要です。具体的には、PDMSモールドの生成中に接着性が不十分な場合、プリントされたパーティクルがPDMSモールドに留まったままになるため、プリントパーティクルを手動で除去し、マスターモールドを破壊する必要があります。
粒子の充填は、考慮すべきもう一つの重要な側面です。微粒子は充填能力が限られているため、ろ過はRABV抗原を濃縮するだけでなく、微粒子コア体積の大部分を占めるストック賦形剤を除去するためにも使用されます。しかし、RABV抗原のサイズが大きい(約60 nm x 180 nm)17ため、遠心分離ステップ中に抗原を部分的にペレット化することが可能です。このため、RABV抗原の高い回収率を達成するためには、遠心分離後にピペッティングやボルテックスによって抗原を再懸濁することが重要である。高濃度溶液は、分注サイクルを短縮し、充填中の抗原分解を制限するため、分注に最適です。ただし、粘度は圧電ディスペンシングロボットが安定した液滴を形成する際の大きな制限であるため、非常に高濃度の溶液をディスペンスすることは不可能または推奨されない場合があります。安定した液滴形成を実現する最も簡単な方法は、充填液を希釈することですが、所望の充填を達成するために必要な追加の充填サイクルにおける抗原の安定性と、粒子の充填に必要なより長い時間を考慮する必要があります。
制限 この方法では、初期金型を製造するための高度に専門化された機器と、微粒子製造用の特殊な充填装置が必要です。初期のマスターモールドを生成できる印刷解像度を備えた3Dプリンターの必要性は、サービスごとの有料アプローチによって覆すことができますが、圧電ディスペンシングロボットへのアクセスは制限されています。圧電ディスペンシングロボットの調達には、ブランド、スループット、および機能に応じて、多くの場合80,000ドルから200,000ドルの範囲で、多額の初期先行投資が必要です。他のいくつかの充填方法が潜在的な代替手段であるが、これらの方法はRABV抗原12を用いて検証されていない。
将来のアプリケーション 封入されたRABV抗原のかなりの割合は、シーリングプロセスを通じて安定なままでした。理論的には、曝露後予防治療の投与タイムラインを模倣する異なるタイプのPLGAで構成される粒子にこの抗原を組み込むことにより、すべての用量を1回の注射で投与することができます。追加の用量を投与するために繰り返し通院する必要がなくなると、患者のコンプライアンスが向上し、治療結果が向上します。さらに、高度に複雑な不活化狂犬病ウイルスのELISA反応性を保持する能力を実証したので、サブユニットワクチンを含む他の抗原がこのカプセル化方法に適合する可能性があります。PULSED微粒子で他の予防抗原を使用すると、ワクチン接種が不十分な集団のワクチン接種率を高めることで、LMICで何百万人もの命を救うことができます。しかし、これを達成するには、ワクチンはカプセル化だけでなく放出によっても安定している必要があり、ペイロードは体温とPLGA分解生成物による高温と潜在的に酸性の微小環境にさらされるため、困難な場合があります18。今後の研究では、放出による抗原の安定化戦略を追求し、多くの感染症の予防に広く適用できる単回注射ワクチン接種プラットフォームの可能性を開くでしょう。

ワクチン接種は非常に効果的な医療ツールであり、2000年から2019年の間に3,700万人以上の死亡を予防しました1。この有効性にもかかわらず、ワクチンで予防可能な病気は、特にワクチン接種未完了およびワクチン接種不足の割合が高いために年間150万人のワクチンで予防可能な死亡に寄与している低中所得国(LMICs)では、世界の健康に重大なリスクをもたらし続けています2。狂犬病もこれらの格差の例外ではありません。狂犬病は、人類に知られている最も致命的な病気としての地位にもかかわらず、ほぼ普遍的に致命的であり、完全に治療可能であり、多くの高所得国で根絶されたと分類されています。代わりに、狂犬病の負担は、病気が人間と家畜に壊滅的な結果をもたらすアジアとアフリカの一部に住む人々によって不釣り合いに負担されています3,4。
予防接種は狂犬病の世界的な影響を管理するために重要です5.ワクチン接種の費用は、疾患の発生率が全体的に低いことを考慮すると、曝露前予防(PrEP)の広範な実施を禁止している。さらに、LMICsでは、曝露後予防(PEP)の有用性は、医療を求める患者に対する社会経済的圧力によって制限されています。医療アクセスポイントへの移動距離、治療中の賃金の損失、治療費、日常活動を妨げる予約、物忘れなどのロジスティック要因により、PEP遵守率は60%と低くなります6,7。この高い患者減少率は、狂犬病と闘うために狂犬病予防接種のギャップに対処するためのアプローチを改善する機会を提供します。
抗原の放出を制御する単回注射(SI)ワクチン接種システムは、1回の注射で完全免疫を得る方法として検討されています。医療提供者への複数回の訪問の必要性を排除することで、個人が適切なケアを求めることを妨げる負担が軽減されます。SIワクチン接種を達成するために、抗原は通常、注射可能な微粒子の形をとることが多い生分解性ポリマーマトリックス内にカプセル化されます。注入されると、ポリマーは分解し、隔離された抗原を放出します。現在までに、SIワクチン接種を達成するために2つの一次放出戦略が追求されてきた。1つのアプローチでは、抗原は長期間にわたって連続的に放出される。単回注射の免疫原性を高めることを意図しているが、このアプローチがヒトの狂犬病ウイルス(RABV)に対する防御免疫応答を誘発するのに十分であるかどうかは不明である8。他方では、抗原は、従来の実証済みのプライムブーストワクチンレジメンを模倣するために所定の遅延後に放出される。噴霧乾燥およびエマルジョン/溶媒蒸発ベースの微粒子作製法は前者の戦略を示し、モデルワクチン9と破傷風トキソイド10などの安定性の高い抗原の両方をうまくカプセル化するために使用されています。しかしながら、これらのカプセル化方法は、抗原11を変性させる可能性のある熱、溶媒相互作用、および物理的力を含むストレッサーを伴う。
薬物をカプセル化するために均一に液化および密封された粒子(PULSED)は、生分解性微粒子に生物製剤をカプセル化するために採用できる最近開発された製造方法です。マイクロモールディングは、液体ペイロードで満たされ、ポリマーがリフローし、生分解性ポリマーの連続した層内に貨物の中央デポを完全にカプセル化できるように加熱される粒子を生成するために使用されます。この微細構造は、ポリマーシェル12の分解速度に依存する持続時間の後に、ペイロードの拍動放出をもたらす。この原稿は、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によって評価された安定したRABV抗原をカプセル化するためのPULSED製造法を使用して、多くのFDA承認製剤13で使用されている生分解性ポリマーであるポリ(乳酸-co-グリコール酸)(PLGA)で構成される微粒子内に不活化RABVをカプセル化する方法を示しています。分子量および/または末端基の異なるPLGA粒子を組み合わせることにより、このアプローチは、1回の注射後の現在の狂犬病ワクチン接種の時間経過を模倣する可能性があります。

<table><tbody><tr><td>0.22 以上m PES フィルター</td><td>コール・パーマー+B4B2:B63</td><td>04396-26</td><td></td></tr><tr><td>0.25 mm シム</td><td>マクマスター カー</td><td>98090A935</td><td></td></tr><tr><td>0.75 インチ バインダー クリップ</td><td>ステープルズ</td><td>480114</td><td></td></tr><tr><td>10 mL シリンジ</td><td>ベクトン・ディッキンソン・アンド・カンパニー</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>10 mL&nbsp;拡大鏡付き滅菌ポリスチレン使い捨て血清ピペット ストライプ</td><td>フィッシャーブランド</td><td>13-678-11E</td><td></td></tr><tr><td>101.6 mm Cクランプ</td><td>アマゾン</td><td>PT-SD-CP01A</td><td>黒いハンドルは最終的に落ちます。これが発生したら、ペンチを使用して調整してください。</td></tr><tr><td>19 G 針</td><td>エクセリント</td><td>26438</td><td></td></tr><tr><td>25 mL&nbsp;拡大鏡の縞が付いている生殖不能のポリスチレンの使い捨ての血清学のピペット</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11</td><td></td></tr><tr><td>3-(トリメトキシシリル) メタクリレートのプロピル&nbsp;</td><td>ミリポアシグマ</td><td>M6514-25ML</td><td></td></tr><tr><td>5mL&nbsp;滅菌ポリスチレンディスポーザブル血清ピペット、拡大鏡ストライプ</td><td>付きエッペンドルフ</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>50mL遠心チューブコー</td><td>ニング&nbsp;</td><td></td><td></td>352098</tr><tr><td>50mL&nbsp;拡大鏡の縞が付いている生殖不能のポリスチレンの使い捨ての血清学のピペット</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11F</td><td></td></tr><tr><td>アセトン</td><td>のフィッシャー</td><td>AC268310010</td><td></td></tr><tr><td>アルミニウム ブロック</td><td>McMaster Carr</td><td>9057K175</td><td></td></tr><tr><td>アルミ ホイル</td><td>VWR</td><td>89079-069</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 0.5 mL 遠心フィルター、100 kDa</td><td>ミリポア シグマ</td><td>C82301</td><td></td></tr><tr><td>抗狂犬病ウイルス抗体、無血清抗体、クローン1112-1、100</td><td>フィッシャーブランド</td><td>13-678-11D</td><td></td></tr><tr><td>抗狂犬病ウイルスマウスモノクローナル抗体、クローンD1-25、ビオチン化</td><td>フィッシャーブランド</td><td>14-388-100</td><td></td></tr>カル<tr><td>ボキシメチルセルロース</td><td>東京化学工業</td><td>C0045</td><td></td></tr>クリップ<tr><td>チップ300、フィルター、ラック付き</td><td>フィッシャーブランド</td><td>13-678-11</td><td></td></tr><tr><td>Costar 0.65 mL 低結合スナップキャップ 微量遠心チューブ</td><td>コーニング&nbsp;</td><td>3206</td><td></td></tr><tr><td>Costar 1.7 mL低結合スナップキャップ微量遠心チューブ</td><td>コーニング&nbsp;</td><td>3207</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nanoscribe 3Dプリンターの印刷パラメーターを定義するために使用されるNanoscribeソフトウェアの説明は、プリンターに付属のステップ1.2. ソフトウェアです。</td><td></td><td></td></tr><tr><td>デシケーター</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>10529901</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>両面テープ</td><td>ステープル</td><td>649280</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (10x)、カルシウムなし、マグネシウムなし</td><td>Gibco</td><td>14200075</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>VWR</td><td>89370-084</td><td></td></tr><tr><td>F1-ClipTip マルチチャンネル ピペット、30 から 300 & マイクロ;L</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11E</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand SureOne エアロゾル バリア ピペット チップ、0.1 &ndash; 10 & マイクロ;L</td><td>フィッシャーブランド</td><td>13-678-11F</td><td></td></tr><tr><td>フィッシャーブランド SureOne エアロゾル バリア ピペット チップ、100 &ndash; 1000 & マイクロ;L</td><td>Fisherbrand</td><td>03-448-17</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand SureOne エアロゾル バリア ピペット チップ、2 &ndash; 20 &micro;L</td><td>Fisherbrand</td><td>FB14955202</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand SureOne エアロゾル バリア ピペット チップ、20 &ndash; 200 & マイクロ;L</td><td>フィッシャーブランド</td><td>13-374-10</td><td></td></tr><tr><td>フィッシャーブランド&nbsp;エリートピペットキット</td><td>フィッシャーブランド</td><td>05-408-137</td><td></td></tr><tr><td>フィッシャーブランド&nbsp;ピペットコントローラー&nbsp;</td><td>フィッシャーブランド</td><td>FB14955202</td><td></td></tr><tr><td>ガラス ペトリ皿、90 mm</td><td>VWR</td><td>470313-346</td><td></td></tr><tr><td>スライド ガラス</td><td>グローブ サイエンティフィック</td><td>1380-10</td><td></td></tr><tr><td>Helicon Focus 8</td><td>HeliconSoft</td><td></td><td>スタック イメージの焦点を合わせるために使用されるソフトウェア</td></tr><tr><td>IP-Q 樹脂</td><td>Nanoscribe</td><td></td><td>プリンターレジンは10倍レンズと互換性があり、Nanoscribe Photonic Professional GT2</td></tr>、<tr><td>Lascar、EL-USB-TC-LCD、熱電対</td><td>、Amazon</td><td>5053485896236</td><td>、または同等の</td></tr><tr><td>顕微鏡スライドボックス</td><td>、ミリポア、シグマ</td><td>、Z374385-1EA</td>、<td>または同等の</td></tr><tr><td>Nanoscribe Photonic Professional GT2、10倍対物レンズ付き、Nanoscribe</td>、10倍レンズ、ナノ<td>クロ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ミクス、大型の微細構造のプリントに使用されます。</td><td>Nanoscrive 3Dプリンターとのインターフェースに使用されるNanoWrite Nanoscribeソフトウェア. プリンターに付属のソフトウェア。</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nunc MaxiSorp 平底 96 ウェルプレート</td><td>Invitrogen</td><td>44-2404-21</td><td></td></tr><tr><td>OPD 基質錠剤 (o-フェニレンジアミン二塩酸塩)</td><td>Fisherbrand</td><td>02-707-432</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M Wrapping Film, 4 in.</td><td>フィッシャーブランド</td><td>13-374-10</td><td></td></tr><tr><td>PDC 60 タイプ 3 コーティング</td><td>Scienion</td><td>P-2020</td><td></td></tr><tr><td>PDMS 粒子金型</td><td>ライス 大学</td><td>n/</td><td>a N/A- 粒子は 400 &mu;直径 m で、壁の厚さは 100 &mu;m、高さは500&mu。mで、内径は200&mu;mになります。配列は 14 x 22 個の粒子で、間隔は 600 &mu;mは互いに離れています。4 点と 5 点の星は、600 &mu;m 配列上の右上と左上のパーティクルの左右に m あります。</td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>08-757-100D</td><td></td></tr><tr><td>ピアス 安定過酸化物基板バッファー (10x)</td><td>フィッシャーブランド</td><td>02-707-430</td><td></td></tr><tr><td>プラスチックカップ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>S04170</td><td></td></tr><tr><td>PLGA フィルム、502H</td><td>シグマ</td><td>502H: 719897-1G</td><td></td></tr><tr><td>プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート</td><td>ミリポアシグマ</td><td>484431</td><td></td></tr><tr><td>狂犬病抗原</td><td>カイロンベーリングとバーラトバイオテックインターナショナル</td><td></td><td>マテリアルは、会社と材料譲渡契約を締結することにより買収されました。</td></tr><tr><td>かみそりの刃</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>メス</td><td>VWR</td><td>21899-530 および 76457-512</td><td></td></tr><tr><td>SciFLEXARRAYER S3 PCD 60</td><td>Scienion</td><td></td><td>または</td></tr><tr><td>同等の 96 ウェルプレート用シーリングテープ</td><td>Thermo Scientific</td><td>15036</td><td></td></tr><tr><td>シリコンウェーハ</td><td>ユニバーシティウェーハ</td><td>1025</td><td></td></tr><tr><td>スプリングクランプ</td><td>IRWIN</td><td></td><td></td>VGP58100</tr><tr><td>ステンレス鋼ブロック</td><td>マクマスター</td><td>カー9083K12</td><td></td></tr><tr><td>ストレプトアビジン&マイナス;ペルオキシダーゼポリマー、超高感度</td><td>フィッシャーブランド</td><td>02-707-404</td><td></td></tr><tr><td>シルガード 184</td><td>ダウ</td><td>2646340</td><td></td></tr><tr><td>テフロンシート</td><td>マクマスターカー</td><td>9266K12</td><td>PLGAフィルムの製造に使用されます。適切なサイズにカットする必要があります。</td></tr><tr><td>テフロンシート、厚さ0.8mmの</td><td>マクマスター</td><td>カー9266K81</td><td></td></tr><tr><td>トリクロロ(1H、1H、2H、2H-パーフルオロオクチル)シラン</td><td>シグマ</td><td>448931-10G</td><td></td></tr><tr><td>ピンセット&nbsp;</td><td>Pixnor</td><td>ESD-16</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Distilled Water</td><td>Fisher Scientific</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>UV Oven, CL-1000S UV Crosslinker</td><td>UVP</td><td>95-0174-01</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>真空デシケーター</td><td>Bel-Art</td><td>F420100000</td><td>これらのうちの 2 つが必要になります。1つは、汚染を防ぐためにトリクロロ(1H、1H、2H、2H-パーフルオロオクチル)シランでサンプルを前処理するためにのみ使用されます。</td></tr><tr><td>120°に達することができる真空オーブン。C</td><td>VWR</td><td>97027-664</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>真空、CRVpro4&nbsp;</td><td>ウェルチ</td><td>3041-01</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>木製舌圧子</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>72320</td><td></td></tr></tbody></table>

狂犬病抗原を封入した拍動性高分子微粒子の作製

Fabrication of Pulsatile Polymeric Microparticles Encapsulating Rabies Antigen

狂犬病曝露後予防に関する現在のガイドラインでは、数週間にわたって複数回の注射を投与する必要があります。これは、狂犬病への致命的な曝露の大部分が発生する低中所得国(LMICs)に住む人々にとって不釣り合いな負担になる可能性があります。抗原をポリマー粒子に封入することにより、ワクチンレジメンを1回の注射に凝縮するために、さまざまな薬物送達戦略が検討されています。しかしながら、カプセル化プロセス中の過酷なストレッサーは、カプセル化された抗原の変性を引き起こし得る。この記事では、狂犬病ウイルス(RABV)抗原を、調整可能な拍動放出を示すポリマー微粒子にカプセル化する方法について説明します。この方法は、薬物をカプセル化するために均一に液化および密封された粒子(PULSED)と呼ばれ、ソフトリソグラフィーを使用して微粒子を生成し、多光子の3Dプリントされたマスターモールドから逆ポリジメチルシロキサン(PDMS)モールドを作成します。次に、ポリ(乳酸-co-グリコール酸)(PLGA)フィルムをPDMS金型に圧縮成形し、圧電ディスペンシングロボットを使用して濃縮RABVを充填するオープンフェースシリンダーを生成します。次に、これらの微細構造は、粒子の上部を加熱することによって密封され、材料が流動して連続した非多孔質ポリマーバリアを形成することを可能にします。製造後、無傷の三量体狂犬病ウイルス糖タンパク質の検出に特異的な酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を使用して、微粒子からの免疫原性抗原の高い回収率を確認します。

粒子のシーリングと充填は、このプロトコルで最も重要なステップの2つです。粒子はフルオレセインナトリウム塩で満たされ、理想的な充填といくつかの一般的なエラーを示しました。視覚化を容易にするために、RABV抗原の代わりにフルオレセインナトリウム塩を使用しました。充填中は、粒子コアの底に溶液を分注し、溶媒/水が蒸発するのに十分な時間を確保することが重要です。完了すると、溶質のデポが粒子コアの底に残ります(図1A)。充填したら、粒子を正しく密封することが重要です。 図1B は、シーリングプロセスのいくつかの結果(成功と失敗)を示しています。12秒のシーリング時間の後、粒子の中心から粒子の外側への明確な経路が残り、完全にシールされていない粒子を示しています。逆に、36秒間シールしたままにしておくと、PLGAはほぼ完全に溶融し、浅いプロファイルの微細構造になります。理想的な形態は、粒子構造を維持しながらポリマーによって完全にカプセル化された貨物を含むため、粒子が18秒と24秒間密封されると視覚化できます。 図1C は、充填およびシーリング後のいくつかの潜在的な結果を示しています。分注中に、溶媒が粒子の底に到達しない場合、粒子コアの中央で溶質が乾燥したままになります(誤って充填されています)。これらの粒子はまだ密閉される可能性がありますが、貨物の積み込みが不十分な場合、積み込み効率が制限される可能性があります。粒子があまりにも多くの貨物で満たされている(過充填されている)場合、貨物がPLGAが開口部を流れるのを妨げるため、シーリングプロセスが阻害されます。正しく充填および密封されると、この形状の粒子は19Gの針の中に簡単に収まるほど小さくなります。さらに、2%カルボキシメチルセルロースなどの粘性溶液を注入すると、10個の粒子が19 Gの針(100%±0%)を一貫して流れました(補足図7)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65147/65147fig01.jpg"> 図1:充填およびシーリングプロセスに関する一般的な問題 。 (A)画像は、粒子に6 nLの100 mg/mLフルオレセインナトリウム塩を水に溶解させた1回の充填サイクル後の溶媒の蒸発を示しています。(B)シーリングプロセスから0、12、18、24、および36秒で除去された502H PLGA粒子の代表的な画像。 (C)粒子が正しく充填された場合、正しく充填された場合、または過剰に充填された場合のシーリングプロセスの異なる結果。画像は、複数の画像をフォーカススタッキングし、フォーカススタッキングソフトウェアを使用してそれらをマージすることによって生成されます。スケールバー = 200 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65147/65147fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
抗原を粒子にロードする前にスピンフィルターで抗原を処理することは、2つの理由で重要です。第一に、遠心分離はワクチン溶液中のストック賦形剤を除去するのに役立ち、RABV抗原を保持しながら粒子負荷容量を制限することができる。現在のプロトコルでは、抗原を約50倍精製します。第二に、抗原もこのプロセス中に濃縮されます。 図2A は、濃縮抗原試料中の無傷のRABVビリオンの顕微鏡写真を示す。この抗原は、出発ストック溶液よりも約4.4倍濃縮されています(図2B)。遠心スピンフィルターに最初にロードされた抗原の量は、達成される最終的なフォールド濃度を調節するように変更することができます。例えば、40 μLのストック抗原を負荷すると、約1.75倍の濃度になります。 補足図8 は、濃縮プロセスにおけるボルテックス(ステップ5.15)の重要性を示しています。サンプルのボルテックスを怠ったり、不適切にボルテックスしたりすると、濃縮プロセスが制限されます。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65147/65147fig02.jpg"> 図2:抗原濃度。 抗原の濃度は遠心濾過により透過型電子顕微鏡(A)により示し、ELISA(B)により確認した。エラーバーは標準偏差を示します。統計分析は、一元配置分散分析によるテューキーの多重比較検定を使用して行われます。**p &lt; 0.01, **p &lt; 0.0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65147/65147fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
図3A は、密封されていない粒子および密封された粒子に充填された濃縮抗原を示す。かなりの量の抗原が粒子にロードされますが(0.0469±0.0086IU)、この材料は粒子容量の&lt;90%を占め、追加の抗原をロードするための十分なスペースを残します。興味深いことに、密封されていない粒子は0.0396±0.0077IUしか含まず、負荷された総量の85%±16%しか含まない。統計的に有意な損失であるが、RABV抗原の一部は、充填プロセスにおける再水和および乾燥の繰り返しの間に変性した可能性がある。封鎖後、抗原の69%±5%が生理活性型でカプセル化されたままである。これは、熱応力によるシーリングプロセス中に有意な損失が生じることを示唆していますが、不活化ウイルス抗原のほとんどは無傷のままです(図3B)。抗原と共に安定化賦形剤の同時封入は、製造プロセス全体を通して抗原安定性をさらに高めるための1つの可能な戦略であり、以前に他の不活化ウイルス抗原で成功している14、15。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65147/65147fig03.jpg"> 図3:粒子作製後の生理活性RABV抗原 。 (A)画像は、RABV抗原を含有する非密封および密封粒子を示す。(B)粒子作製工程による抗原安定性(n=4)。ローディング制御は、抗原を溶液に直接分注することによって生成されます。エラーバーは標準偏差を示します。スケールバー = 200 μm。統計分析は、一元配置分散分析によるテューキーの多重比較検定を使用して行われます。*p &lt; 0.05.画像は、複数の画像をフォーカススタッキングし、フォーカススタッキングソフトウェアを使用してそれらをマージすることによって生成されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65147/65147fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足図 1: パーティクル、フィデューシャル、および配列の次元。 この図は、CAD ソフトウェアに表示される 4 つの尖った星の指標 (A)、円筒形の微粒子 (B)、五芒星の指標 (C)、および指標を持つ粒子の配列 (D) の幾何学的特性を示しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65147/Figure%20S1.pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図2:この図は、PDMS金型を硬化させるためにオーブンに入れられた構造の断面を示しています。 矢印は、バインダークランプが適用される場所を示しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65147/Figure%20S2.pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図3:濃縮抗原を効率的に回収するための適切な技術。 最初のスピンの終わりに、赤(A)で囲まれた濃縮サンプルはフィルターに保持され、ろ液は収集チューブの底(より大きな外管)に収集されます。ペレット状の抗原を再懸濁するために、ボルテックスの準備として回収管(B)を用いて遠心フィルターユニットをキャップする。ボルテックス時には、チューブの先端をボルテックスパッドに接触させ、ボルテックスパッド(C)との角度を45°に保ちながらキャップの端を回転させます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65147/Figure%20S3.pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図4:実行前のプログラミング圧電ディスペンサー。(A)「メインタブ」からロボットセットアップ&gt;その他の&gt;部門機能に移動して、「ターゲット基準点の検索」&gt;「ターゲット基準点の検索」を設定します。青色で強調表示されているボタンを使用して、受託者マークを設定します。まず、[テンプレートの学習]を選択し、関心のある受託者マークの周囲にボックスを描画し、[テンプレートの検索]をクリックしてテンプレートの正確性を確認し、テンプレートを保存します。4 つ星と 5 つ星に対してこれを行い、「2 つの異なるテンプレート イメージを使用する」の手順に従ってファイル名を保存します。次に、ブラックボックス内のすべてのパラメータが一致していることを確認します。[テンプレートの読み込み] (緑色のボックス) を使用して 4 つの尖った星の指標を読み込みます。「ターゲット参照点の検索」プログラムを保存するには、タスクリスト(オレンジ色のボックス)を選択します。(B)ロボット設定&gt;タスクタブに移動して実行を設定し、実行選択のタスク(緑色のボックス)を使用してタスクリスト(黒いボックス)からタスクを追加して、青いボックスに表示されている一連のタスクをロードします。最後に、タスク(オレンジ色のボックス)を保存します。(C)ロボットセットアップ&gt;ターゲット基板に移動して「ターゲット基板」を設定し、ターゲット(青いボックス)を追加します。(D)ここに表示されているパラメータを入力し、保存(青いボックス)を選択します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65147/Figure%20S4.pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図5:抗原のローディングとダイジングアラインメントのキャリブレーション。(A) [ノズルのセットアップ] &gt; [タスクの実行] タブに移動し、TakeProbe 10 uL (ブラックボックス) を選択し、DO(ブラックボックス)をクリックして、10 μL の抗原を分注チップに吸引します。(B)これにより、別のウィンドウが開きます。濃縮抗原がロードされたウェルを選択し、OK (青いボックス) を選択します。(C)抗原を吸引した後、青いボックスを選択してチップを洗浄し、この洗浄をさらに2回繰り返します。カメラ(黒いボックス)を選択し、ドロップボリューム(緑色のボックス)を選択してドロップボリュームを決定します。体積標準偏差(%)&lt;2(オレンジ色のボックス)で安定した液滴が形成されていることを確認します。(D)これらの手順に従うと、スナップドロップカムが開きます。ドロップダウンメニューで[画像](青いボックス)を選択し、[ノズルヘッドカメラウィザード]を選択します。これにより、新しいウィンドウが開きます。次の一連の手順をすばやく実行します。(E)補足図4で作成したターゲットがロードされていることを確認してから、[ターゲットに移動](青いボックス)を選択します。ドロップを15に調整し、スポット(ブラックボックス)を選択します。見つかったら、すぐに[移動](緑色のボックス)を選択します。[自動検索]が選択されていることを確認し、粒子サイズ= 12を削除してから、[開始](オレンジ色のボックス)をクリックします。自動検出に失敗した場合は、スライド上の別の領域(紫色のボックス)に移動してから、このプロセスを繰り返します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65147/Figure%20S5.pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図6:スポッティングアレイのプログラミングと実行の開始。 (A) ターゲットセットアップ &gt; ターゲットに移動し、青いボックスに表示されているパラメーターを入力します。(B)次に、[フィールド設定]タブに移動し、番号に 20 と入力します。ドロップフィールド(青いボックス)で、ウェル(黒いボックス)を選択してから、ディスペンスするターゲット/パーティクルを選択します(緑色のボックス)。別のウェルを選択し、ターゲット/パーティクルを再選択することで、1回のランで追加の充填サイクルが実行されます。(C)メイン画面で、 補足図5 で作成した実行とターゲットが選択されていることを確認します。(D)[実行]タブに移動し、[ 実行の開始 ](青いボックス)を選択します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65147/Figure%20S6.pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図7:微粒子注入性。(A-C)フルオレセインナトリウム塩で満たされ、19Gの針に密封された微粒子の焦点積層ステレオスコープ画像。(d)合計10個の粒子を、2%カルボキシメチルセルロース溶液(n=8)を用いて19G針を通して注入した。スケールバー= 1 mm。エラーバーは標準偏差を示します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65147/Figure%20S7.pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図8:抗原濃度に関する潜在的な問題。赤い線は、予想される濃度の倍率上昇を示します。エラーバーは標準偏差を示します。統計分析は、一元配置分散分析を用いたテューキーの多重比較検定を用いて行った。 p &lt; 0.001, ****p &lt; 0.0001.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65147/Figure%20S8_Revised.pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル1:RABV ELISA用のバッファーおよび溶液の調製。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65147/Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足コーディングファイル1:パーティクルアレイを含むSTLファイル。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65147/Supplemental%20File%201.STL" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足コーディングファイル2:パーティクルのシールに使用されるカスタムスライドホルダーの形状を含むSTLファイル。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65147/Supplemental%20File%202.STL" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

この方法は、狂犬病抗原を、所定の遅延後に拍動放出を可能にする構造的および材料的特性を有する生分解性ポリマー微粒子に封入することを記載する。粒子コアから回収された抗原の酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)評価では、粒子作製を通じて無傷の三量体狂犬病ウイルス糖タンパク質の存在が確認されます。

The current guidelines for rabies post-exposure prophylaxis require multiple injections administered over several weeks. This can be disproportionately ...

このアプローチの重要性は、1回の注射で複数回投与ワクチンを投与するために使用できることであり、特にアクセスの課題のために新生児が予防接種を受けていない低中所得国で、何百万人もの命を救う可能性があります。この製造方法により、狂犬病ワクチンは、1回の注射で現在のワクチン接種スケジュールを模倣する微粒子にカプセル化されたときに、本来の免疫付与形態を保持することができます。狂犬病は致命的な病気であり、場合によっては死を防ぐために最大5回のワクチン注射を繰り返す必要があります。ただし、1回の訪問で完全なワクチンレジメンを投与することで、アドヒアランスを改善し、命を救うことができます。この技術は、さまざまな疾患の多様な治療法または予防薬を提供できるプラットフォーム技術を表しています。まず、3Dプリントされたマスターモールドの表面を、表面に40マイクロリットルのトリクロロシランが入ったスライドガラスを含む真空チャンバーに入れて処理します。1時間真空を開始します。PDMSプレポリマーベースと硬化剤をプラスチックカップに質量比9:1で混合します。次に、溶液を50ミリリットルのチューブに移し、300 Gを室温で3分間遠心分離します。遠心分離後、溶液が透明であることを確認してください。表面処理が完了したら、マスターモールドをアルミホイル皿に入れ、未硬化のPDMSを金型に注ぎ、フィーチャーが完全に水没することを確認します。アルミホイル皿を真空チャンバーに入れ、真空を1時間引いて気泡を取り除きます。アルミホイル皿を取り外した後、マスターモールドの両端に800マイクロメートルのスペーサーを置き、気泡を避けてきれいなスライドガラスをマスターモールドに重ねます。バインダークリップを使用して、金型を800ミクロンのスペーサーに固定します。プレポリマーを120°Cのオーブンで4時間硬化させます。硬化したら、バインダークリップを慎重に解放します。かみそりの刃を使用して、マスターモールドを硬化PDMSモールドから分離します。PLGAフィルムを調製するには、リングシム内の焦げ付き防止ポリマーシートに450ミリグラムのPLGAを置きます。次に、2枚目の焦げ付き防止ポリマーシートをPLGAに重ね、101.6ミリメートルのCクランプを使用して、2つのアルミニウムブロック間のスタックを指で締めるまで圧縮します。Cクランプアセンブリを真空オーブンに入れます。オーブンで30分後、クランプを締めてさらに30分間戻します。次に、アセンブリをデシケーターに4時間移して冷却します。冷却したら、clを緩めますamps、焦げ付き防止ポリマーシートからPLGAフィルムをはがし、ラベルの付いたペトリ皿に入れます。後で使用するために、ペトリ皿をデシケーターの中に保管します。PLGAパーティクルを生成するには、前述のようにPDMSモールド表面を処理します。ピンセットまたはメスを使用して、250ミクロンのPLGAフィルムを粒子アレイとほぼ同じサイズに切断し、処理したPDMSモールドに置きます。PDMS金型の上にあるPLGAフィルムの上にきれいなガラス顕微鏡スライドを重ね、アレイとPLGAフィルムの上にスプリングクランプを配置してそれらを一緒に固定します。クランプされた金型アセンブリを真空オーブンに1時間保持してから、室温で15分間冷却します。冷却したら、かみそりの刃を使用して静かに圧力をかけ、PDMSモールドをPLGA粒子アレイから分離し、PLGA粒子をデシケーターに保管してさらに使用します。粒子を濃縮狂犬病ワクチン抗原で満たすには、圧電ディスペンサーを準備し、PLGA粒子を含むスライドを分注領域に置きます。濃縮抗原をプレートにロードし、ターゲット設定パラメータを入力してRunをクリックします。圧電ロボットは粒子を充填します。完了したら、ステレオスコープを使用して、パーティクルが充填されていることを確認します。充填された粒子を密封するために、ホットプレート上にステンレス鋼ブロックを置き、ステンレス鋼ブロック上に2つの平行な顕微鏡スライドを置きます。ステンレス鋼ブロックを水平にした後、ホットプレートの電源を入れ、温度を摂氏205度に設定します。ステンレス鋼の所望の表面温度に達したら、充填されたPLGA粒子を2枚のスライドガラスに懸濁させ、直ちに18秒間タイマーを開始します。密封されたパーティクルアレイをホットプレートから取り出した後、ラボベンチの2枚のスライドガラスに吊るし、1分間冷却します。密封された粒子を採取するには、メスの刃をスライドに対して45度の角度で保持し、粒子の基部に圧力を加えてスライドから分離します。メスを使用して、収穫した粒子を0.5ミリリットルの低タンパク質結合チューブに移動します。狂犬病ワクチンの安定性を維持するために、ウシ血清アルブミンとグルコースを含む250マイクロリットルのPBSを追加します サンプルをステレオスコープの下に置き、1対の細い先端ピンセットで1本のプロングを使用して粒子を粉砕します。粒子充填中、完全な溶媒または水の蒸発には十分な乾燥時間が必要です。乾燥後、溶質デポーが粒子コアの底部に残る。このPLGAでは、18秒から24秒の間に、貨物を含む粒子が粒子構造を失うことなく完全に密閉されていたため、粒子の理想的な形態が観察されました。粒子は、適切に梱包および密封された場合、19ゲージの針に簡単に収まるほど小さかった。さらに、10個の粒子は、2%カルボキシメチルセルロースなどの粘性溶液に注入すると、19ゲージの針を通って一貫して流れました。透過型電子顕微鏡写真は、濃縮抗原サンプル中の無傷の狂犬病変異体を示し、これらは出発原液よりも約4.4倍濃縮されていました。封鎖後、抗原の約69%が生理活性型でカプセル化されたままであり、熱ストレスが封鎖中に有意な損失を引き起こすことを示唆しているが、ウイルス抗原のほとんどは無傷のままである。微粒子の充填は、最も重要なステップの1つです。粒子が正しく充填されていないと、粒子が正しくシールされる可能性は低くなります。安定性を理解するには、粒子コア内の賦形剤やその他の生物学的に関連する材料を含む追加の製剤開発が必要です。

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