Name: 機器エンジニアリングによる下流の病原体検出のための柑橘類の芽処理の自動化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-21T13:10:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: 学ぶ柑橘類の芽処理の自動化技術。Budwood Tissue Extractorを用いて、病原体検出のための組織処理を迅速化し、労働コストと設備費用を削減します。植物病理学と作物管理の分野で応用可能です。

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著者らは、カフイラの人々を実験作業が完了した土地の伝統的な管理者として認めています。カリフォルニア大学リバーサイド校のノーマン・エルストランド教授には、UCRカリフォルニア農業食品企業(CAFÉ)イニシアチブの下でこのプロジェクトの研究活動を行うためのラボスペースを提供していただき、感謝しています。この研究は、CDFA-特殊作物ブロック助成プログラム(助成金番号18-0001-055-SC)の支援を受けました。追加のサポートはCRBプロジェクト6100によっても提供されました。USDA国立食糧農業研究所、ハッチプロジェクト1020106;National Clean Plant Network-USDA Animal and Plant Health Inspection Service (AP17PPQS&T00C118, AP18PPQS&T00C107, AP19PPQS&T00C148, & AP20PPQS&T00C049) がゲオルギオス・ヴィダラキスに授与されました。

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<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Past+and+future+of+a+century+old+Citrus+tristeza+virus+collection%3A+A+California+citrus+germplasm+tale%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Past and future of a century old Citrus tristeza virus collection: A California citrus germplasm tale.</a> Frontiers in Microbiology. 4, 366(2013).</li>
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<li>Gottwald, T. R., Polek, M., Riley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((History%2C+present+incidence%2C+and+spatial+distribution+of+Citrus+tristeza+virus+in+the+California+central+valley%5BTitle%5D)+AND+%22International+Organization+of+Citrus+Virologists+Conference+Proceedings+%281957-2010%29%22%5BJournal%5D)">History, present incidence, and spatial distribution of Citrus tristeza virus in the California central valley.</a> International Organization of Citrus Virologists Conference Proceedings (1957-2010). 15, (2002).</li>
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</ol>

著者は、競合する金銭的利益を宣言していません。

HLB柑橘類病の出現により、損失を減らすために、柑橘類産業、規制当局、および診断研究所は、病気管理の実践と組み合わせて、個々の樹木の検査のために、低スループットの手動サンプル処理およびqPCR34 などの病原体検出アッセイと組み合わせたハイスループット核酸抽出法に依存するように促されています35.カリフォルニア州のHLB陽性率は、2012年の0.01%から2020年には1.2%になりました。qPCRは強力で信頼性の高い病原体検出ツールですが、現在利用可能な技術では十分な量の植物組織をサンプリングして処理することができず、カリフォルニアの柑橘類の木のCLasの明確なアンダーサンプリングとアンダーテストが発生します。アンダーサンプリングとアンダーテストは、テストされた木の数と処理される木あたりの植物材料の量(つまり、葉の数)の両方に関連して発生し、樹冠内の感染した葉の散発的な分布のために、早期または軽度の感染を見逃す可能性が高くなります。サンプリングとCLasテストの現在の方法は、コスト(人件費や設備など)のために需要の増加に合わせて拡張できませ...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65159">Automating Citrus Budwood Processing for Downstream Pathogen Detection Through Instrument Engineering</a>. The Authors section was updated from:
Deborah Pagliaccia1,6 
Douglas Hill2 
Emily Dang1 
Gerardo Uribe1 
Agustina De Francesco1 
Ryan Milton2 
Anthony De La Torre2 
Axel Mounkam2 
Tyler Dang1 
Sohrab Botaghi1 
Irene Lavagi-Craddock1 
Alexandra Syed1 
William Grover3 
Adriann Okamba4,5 
Georgios Vidalakis2 
1Department of Microbiology and Plant Pathology, University of California Riverside 
2Technology Evolving Solutions (TES) 
3Department of Bioengineering, University of California Riverside 
4Ecole Sup&#233;rieure d&#39;Ing&#233;nieurs L&#233;onard de Vinci ESILV 
5University of California Riverside 
6California Agriculture and Food Enterprise (CAF&#201;), University of California Riverside
to:
Deborah Pagliaccia1,6 
Douglas Hill2 
Emily Dang1 
Gerardo Uribe1 
Agustina De Francesco1 
Ryan Milton2 
Anthony De La Torre2 
Axel Mounkam2 
Tyler Dang1 
Sohrab Bodaghi1 
Irene Lavagi-Craddock1 
Alexandra Syed1 
William Grover3 
Adriann Okamba4,5 
Georgios Vidalakis1 
1Department of Microbiology and Plant Pathology, University of California Riverside 
2Technology Evolving Solutions (TES) 
3Department of Bioengineering, University of California Riverside 
4Ecole Sup&#233;rieure d&#39;Ing&#233;nieurs L&#233;onard de Vinci ESILV 
5University of California Riverside 
6California Agriculture and Food Enterprise (CAF&#201;), University of California Riverside

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65159">Automating Citrus Budwood Processing for Downstream Pathogen Detection Through Instrument Engineering</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Automating Citrus Budwood Processing for Downstream Pathogen Detection Through Instrument Engineering

ウイロイド、ウイルス、バクテリアなどの柑橘類の移植片伝染性師部制限病原体は、世界のすべての柑橘類生産地域で壊滅的な流行と深刻な経済的損失を引き起こしています。柑橘類のウイロイドは、三葉、三葉の雑種、みかん、クレメンタイン、みかんなどの経済的に重要な柑橘類の種類で引き起こす外皮質と悪液質の病気のために、生産要因を制限しています1,2,3。カリフォルニアでは、これらのウイロイドに敏感な柑橘類の種類は、皮をむきやすく、セグメント化され、種のない果物に対する消費者の好みの変化傾向に続いて、「イージーピーラー」の成長と収益性の高い市場の基盤となっています4,5,6。したがって、柑橘類のウイロイドは、カリフォルニア州食品農業省(CDFA)の「柑橘類の苗床害虫清浄度プログラム-上院法案140」の下で規制されており、CDFAの植物害虫診断部門の研究所は、毎年何千もの柑橘類のウイロイド検査を実施しています7,8,9,10 .カンキツトリステザウイルス(CTV)は、1930年代の世界的な流行が始まって以来、1億本以上の柑橘類の木の死の原因となっています3,9,10,11。カリフォルニアでは、ウイルスの茎の孔食と三葉の破壊抵抗分離株が、36億ドルのカリフォルニアの柑橘類産業に深刻な脅威をもたらします12,13,14。その結果、CDFAはCTVを規制されたクラスAの植物害虫として分類し、中央カリフォルニアトリステザ根絶局(CCTEA)の研究所は毎年広範な現地調査と数千のウイルス検査を実施しています15,16。細菌「Candidatus Liberibacter asiaticus」(CLas)と黄龍峰(HLB)病は、柑橘類の作付面積が40%減少し、柑橘類の操業が57%減少し、約8,000人の雇用が失われた結果、フロリダに90億ドル近くの経済的損害をもたらしたと推定されています17,18。カリフォルニア州では、HLBによる柑橘類の作付面積の仮想的な20%の減少は、8,200人以上の失業と州の国内総生産の50億ドル以上の減少をもたらすと予測されました。したがって、柑橘類の害虫および疾病予防プログラムは、カリフォルニア14,17,19,20からのCLaをテスト、検出、および根絶するための調査に年間4,000万ドル以上を費やしています。
柑橘類のウイロイド、ウイルス、バクテリアの管理の重要な要素は、樹木生産のための病原体テストされた繁殖材料(すなわち、芽木)の使用です。病原体検査済みの柑橘類の芽は、高度な病原体除去および検出技術を採用した包括的な検疫プログラム内で生産および維持されています10,21。カリフォルニア大学リバーサイド校の柑橘類クローン保護プログラム(CCPP)は、カリフォルニアの柑橘類を保護し、柑橘類の全国クリーンプラントネットワークの機能をサポートするために、州と米国に新たに輸入された柑橘類の品種と柑橘類の芽木源の木から毎年何千もの芽材サンプルをテストしています10,17,22.大量の柑橘類検査を処理するために、ハイスループット、信頼性が高く、費用対効果の高い病原体検出アッセイは、CCPP 7,10,22などのプログラムの成功のための基本的な要素です。
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)などの分子ベースの病原体検出アッセイにより、植物診断ラボのスループットが大幅に向上しましたが、私たちの経験では、ハイスループットプロトコルの実装における最も重要なボトルネックの1つは、植物組織サンプル処理ステップです。これは、葉の葉柄や芽木の樹皮などの師部に富む組織の処理に現在利用可能なプロトコルが労働集約的で時間がかかり、高価で特殊な実験装置を必要とするため、特に柑橘類に当てはまります。これらのプロトコルでは、核酸の分解を避けるために、低温での手切り、計量、凍結乾燥、粉砕、および遠心分離が必要です8,23,24。たとえば、CCPP診断ラボでは、サンプル処理には、(i)手切り(6〜9サンプル/時間/オペレーター)、(ii)凍結乾燥(16〜24時間)、(iii)粉砕(30〜60秒)、および(iv)遠心分離(1〜2時間)が含まれます。このプロセスには、特殊な消耗品(頑丈な安全ロックチューブ、ステンレス鋼の粉砕ボール、アダプター、ブレード、手袋など)と複数の高価なラボ機器(超低冷凍庫、凍結乾燥機、組織粉砕機、液体窒素凍結、冷蔵遠心分離機など)も必要です。
他の業界と同様に、機器のエンジニアリングとプロセスの自動化は、コストを削減し、スループットを向上させ、高品質で均一な製品とサービスを提供するための鍵です。柑橘類業界では、操作に最小限のスキルしか必要としない低コストの組織処理機器が必要であり、診断ラボやフィールド操作に簡単に転送できるため、下流の病原体を迅速に検出するための高いサンプル処理能力が可能になります。テクノロジーエボリュービングソリューション(TES)とCCPPは、師部に富む柑橘類の組織(すなわち、芽)を迅速に処理するための低コスト(すなわち、特殊な実験装置の必要性を排除した)機器を開発(すなわち、設計および製造)し、検証しました(すなわち、柑橘類のサンプルでテストし、標準的な実験室手順と比較して)、芽木組織抽出器(BTE)と名付けました。 図1に示すように、BTEには、電源と制御用のベースコンポーネントに加えて、柑橘類の芽を処理するための取り外し可能なチャンバーが含まれています。BTEチャンバーは、師部に富む樹皮組織を柑橘類の芽から取り除くために特別に設計された砥石で構成されています。細断された樹皮組織は、スライドポートから抽出バッファーを含むシリンジに迅速に排出され、ろ過され、追加の取り扱いや準備なしで核酸の抽出と精製の準備が整います(図1)。BTEシステムには、ペーパーレスのサンプル追跡アプリケーションと統合された計量アプリケーションも含まれており、サンプル処理情報をオンラインデータベースにリアルタイムで記録します。
BTEシステムは、CCPPのラボ診断能力を100%以上向上させ、PCRアッセイを使用した高品質の核酸の精製と柑橘類の移植片伝染性病原体の下流検出に適した柑橘類組織抽出物を一貫して製造してきました。具体的には、BTEは組織処理の時間をサンプルあたり24時間以上から~3分に短縮し、60,000ドルを超えるラボ機器を置き換え(図2、ステップ2-4)、より大きなサンプルサイズの処理を可能にしました。
この論文では、CCPP Rubidoux Quarantine FacilityとLindcove Foundation Facilityからのすべての適切なポジティブコントロールとネガティブコントロールを含む、ソースツリーからの柑橘類の芽木サンプルを使用したBTEハイスループット柑橘類樹皮組織処理、核酸抽出、および病原体検出検証データを紹介します。また、現在のラボ手順と比較したスループットと処理時間の変化も示します(図2)。さらに、この作業は、柑橘類病原体検査ラボに詳細な段階的なプロトコルを提供し、BTEが病原体クリーンな苗床、調査、および根絶プログラムの機能をどのようにサポートできるかを示しています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65159/65159fig01.jpg"> 図1:バッドウッド組織抽出器。 BTEには、電源と制御用のベースコンポーネントに加えて、柑橘類の芽を処理するための取り外し可能なチャンバーが含まれています。BTEチャンバーは、師部に富む樹皮組織を柑橘類の芽から取り除くために特別に設計された砥石で構成されています。細断された樹皮組織は、スライドポートからシリンジに迅速に排出され、ろ過され、追加の取り扱いや準備なしで核酸の抽出と精製の準備が整います。略語:BTE =バッドウッド組織抽出器。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65159/65159fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65159/65159fig02.jpg"> 図2:従来のハンドチョッピングラボ手順とBTE処理の段階的な比較。 BTE処理には、ハイスループットの柑橘類樹皮組織処理、核酸抽出、および病原体検出が含まれます。各ステップの時間は括弧内に示されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65159/65159fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<table><tbody><tr><td>0.08インチ六角トリマーライン</td><td>PowerCare</td><td>FPRO07065</td><td>ブレードの交換が必要です。</td></tr><tr><td>1 Hp、8 gal 空気圧縮機</td><td>カリフォルニア エア ツール</td><td>8010</td> す<td>すぎた後、チャンバーをすばやく乾燥させます</td></tr><tr><td>1.5 mL 微量遠心チューブ</td><td>グローブ サイエンティフィック</td><td>111558B</td><td>syinges</td></tr><tr><td>10 mL シリンジ セット</td><td>テクノロジー 進化するソリューション</td><td>TE006-F1-10A-G1000-E1</td><td>シリンジの材料をカットします。グアニジンチオシアン酸緩衝液入り1Lボトル。警告 - グアニジンチオシアン酸塩、必要な有害廃棄物サービスが含まれています - 漂白剤12</td></tr><tr><td>"定規</td><td>Westcott</td><td>&lrmと混合しないでください。16012</td><td></td></tr><tr><td>12% 次亜塩素酸ナトリウム</td>を切断する前にトリマーラインを測定するには <td>Hasa</td><td>1041</td><td>処理後にチャンバーを消毒します</td></tr><tr><td>-20 C 冷凍庫</td><td>記章</td><td>NS-CZ70WH0</td><td>処理後のサンプルを保管</td></tr>します <tr><td>4インチ x 12インチ ビニール袋</td><td>Plymor</td><td>FP20-4x12-10</td><td>輸送中に枝を保持するための袋。Oリングは、詰ま</td></tr><tr><td>りを除去するために</td><td>6インチの綿</td>棒<td>ピューリタン</td><td>806-PCL</td>綿</tr>棒を密封するためにBTEチャンバーにバッグを取り付けます <tr><td>7ガロン収納トート</td>バッグ<td>HDX</td><td>206152</td><td>次亜塩素酸ナトリウム溶液を保持してチャンバーを消毒し、チャンバーをすすぐための水</td></tr><tr><td>エアブローガン</td><td>JASTIND</td><td>&lrm;JTABG103A</td>高圧<td>でチャンバーに空気を導き</td></tr>ます <tr><td>ブラックシャーピー</td><td>シャーピー</td><td>&nbsp;S-19421</td><td>1.5 mLチューブをマークして、後でサンプルを識別できるようにします</td></tr><tr><td>ボトルトップディスペンサー</td><td>ブランド</td><td>Z627569</td><td>グアンジンをシリンジに分配するための調整可能なボトルトップディスペンサー</td></tr><tr><td>BTEチャンバー</td><td>技術 進化するソリューション</td><td>TE002BB-A05-E1</td><td>つぼみの処理に使用されます。Oリング、BTEスライド、スライドプランジャー、ドレンバルブ、蓋、ブレードセット、ブレードセット取り外しツールが含まれています</td></tr><tr><td>ディッシュソープ</td><td>ドーン</td><td>57445CT</td><td>次亜塩素酸ナトリウムのチャンバーへの浸透を改善するためのサーフェクト</td></tr><tr><td>HEPAフィルター付きヒュームフード</td><td>エアサイエンス</td><td>P5-36XT-A</td><td>HEPAフィルター付きヒュームフード(ASTS-030)&nbsp; 可能な汚染を制限し、化学物質のこぼれから保護する</td></tr><tr><td>断熱フォーム輸送コンテナ</td><td>PolarTech</td><td>261/J50C</td><td>サンプルを採取した後、氷上で輸送するための断熱輸送用コンテナ</td></tr><tr><td>ラボコート</td><td>レッドカップ</td><td>KP14WH LN 46</td><td>ラボコートにより、汚染の可能性を制限し、化学物質の流出から保護する</td></tr><tr><td>ノートパソコン</td><td>Microsoft</td><td>Surface</td><td>Wifi対応のノートパソコンでTES GUIを実行可能。初期設定に必要で、組織処理ベースに関するより詳細な情報を提供します</td></tr><tr><td>NFC対応電話</td><td>サムスン</td><td>ギャラクシーS9</td><td>電話をダウンロードして使用するために TES電話アプリ NFC</td></tr><tr><td>クリップタグ</td><td>テクノロジー進化ソリューション</td><td>TE005-Clip-E1</td><td>ツリーにリンクできるサンプルタグ。TES電話アプリ</td></tr><tr><td>NFCカラータグ</td><td>テクノロジー進化ソリューション</td><td>TE005-Collar-E1</td>タグで機能するように作られています<td>ツリーに取り付けられています。TES電話アプリで機能するように作られています</td></tr><tr><td>ニトリルグローブ</td><td>Usa Scientific</td><td>3915-4400</td><td>手袋 汚染の可能性を制限し、化学物質の流出から保護する</td></tr><tr><td>ノイズリダクションイヤーマフ</td><td>3M</td><td>90565-4DC-PS</td><td>エアコンプレッサーとティッシュ処理ベースを操作しながら耳を保護します</td></tr><tr><td>ポリウレタン反動エアホース</td><td>FYPower</td><td>&lrm;510019</td><td>コンプレッサーにエアガンを取り付けます</td></tr><tr><td>安全なメガネ</td><td>Solidwork</td><td>SW8329-US</td><td>化学的および物理的な危険から目を保護します</td></tr><tr><td>スプレーボトル</td><td>JohnBee</td><td>B08QM81BJV</td><td>表面を分解するためのスプレー漂白剤</td></tr><tr><td>ティッシュエクストラクタ ベース</td><td>テクノロジー 進化するソリューション</td><td>TE001-A-E1</td><td>植物組織を処理するシステム。機能するにはBTEまたはLTEチャンバーが必要です。電源ケーブル、ブレードアダプター、8/32インチ六角レンチが含まれています</td></tr><tr><td>ティッシュプロセッシングベースウェイトスケール</td><td>テクノロジー 進化するソリューション</td><td>TE003-A05-200g-01-E1</td><td>200g、0.01解像度のウェイトスケールは、ティッシュプロセッシングベースに接続して重量範囲を強化したり、サンプルとウェイトをリンクしたりします。スケール、電源ケーブル、接続ケーブル、5mlシリンジホルダー、タワーエアシールドが含まれています&nbsp;</td></tr><tr><td>バーミキュライト</td><td>EasyGoProducts</td><td>B07WQDZGRP</td>有害廃棄物処理サービスワイヤーカッターBoenfu&lrm<td>を使用して有害廃棄物(グアニジンチオシアン酸塩)を輸送するために必要。</td></tr><tr><td></td><td></td><td>BOWC-06002-トリ</td><td>マーラインをカットするUSワイヤーカッター</td></tr></tbody></table>

機器エンジニアリングによる下流の病原体検出のための柑橘類の芽処理の自動化

Automating Citrus Budwood Processing for Downstream Pathogen Detection Through Instrument Engineering

ウイルス、ウイロイド、バクテリアなどの柑橘類の移植片伝染性の師部制限病原体は、世界中で壊滅的な流行と深刻な経済的損失の原因となっています。たとえば、柑橘類のトリステザウイルスは世界中で1億本以上の柑橘類の木を殺しましたが、「Candidatus Liberibacter asiaticus」はフロリダに90億ドルの費用をかけました。病原体でテストされた柑橘類の芽を樹木の繁殖に使用することは、そのような病原体の管理にとって重要です。カリフォルニア大学リバーサイド校の柑橘類クローン保護プログラム(CCPP)は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)アッセイを使用して、カリフォルニアの柑橘類を保護し、全米クリーンプラントネットワークにクリーンな繁殖ユニットを提供するために、毎年柑橘類の芽木源の木から数千のサンプルをテストしています。柑橘類ウイルスおよびウイロイドのハイスループット分子検出における深刻なボトルネックは、植物組織処理ステップです。
適切な組織調製は、高品質の核酸の抽出とPCRアッセイにおけるダウンストリーム使用に不可欠です。核酸の分解を避けるために、低温での植物組織の粉砕、計量、凍結乾燥、粉砕、および遠心分離は、時間と労力を要し、高価で特殊な実験装置を必要とします。この論文では、柑橘類の芽から師部に富む樹皮組織を迅速に処理するように設計された、芽木組織抽出器(BTE)と呼ばれる特殊な機器の検証を紹介します。BTEは、現在の方法と比較してサンプルスループットを100%向上させます。さらに、それは人件費と設備のコストを削減します。この研究では、BTEサンプルのDNA収量(80.25 ng / μL)は、CCPPのハンドチョッピングプロトコル(77.84 ng / μL)に匹敵しました。この機器と迅速な植物組織処理プロトコルは、カリフォルニアのいくつかの柑橘類診断研究所とプログラムに利益をもたらし、世界中の他の木本多年生作物の組織処理のモデルシステムになります。

BTE処理した柑橘類組織を用いたRNA抽出・精製・品質および組織処理時間の評価 このテストでは、255本の代表的な柑橘類の木の芽木サンプルを使用して、BTEのRNA品質と標準的な手順を比較しました。サンプルは、バッドウッド組織抽出器(BTE)(プロトコルステップ4.1〜4.6および 図2、右側、ステップ1、ステップ5、およびステップ6)によって処理されるか、Dangらによって説明されているように、樹皮組織の手の剥離およびチョッピング、凍結乾燥、粉砕、および遠心分離を利用する規制的に承認された柑橘類のつぼみ組織処理方法に従って調製された23(図2、 左側、ステップ1〜6)。
BTEと柑橘類組織処理のための従来の手切りおよび実験装置プロトコルとを並べて比較したところ、抽出された核酸の品質(すなわち、濃度、純度、および完全性)(図3A-C</...

師部が豊富な樹皮の柑橘類のつぼみ組織を迅速に処理する機器を設計、製造、検証しました。現在の方法と比較して、バッドウッド組織抽出器(BTE)はサンプルスループットを向上させ、必要な人件費と設備コストを削減しました。

Graft-transmissible, phloem-limited pathogens of citrus such as viruses, viroids, and bacteria are responsible for devastating epidemics and serious ...

実証された技術は、低コストの機器を使用して師部に富む柑橘類組織を迅速に処理し、労働集約的なプロトコルや特殊な実験装置の必要性を排除します。これにより、柑橘類のウイロイド、ウイルス、細菌の迅速なダウンストリーム検出と管理が可能になります。この方法は、スループットを向上させ、検査サービスの品質と均一性を向上させ、柑橘類産業に利益をもたらし、保育園や野外業務における病気の診断と治療に役立つ可能性があります。柑橘類の植物は病原体に感染しており、世界中で重大な経済的損失を引き起こします。バッドウッド組織抽出器(BTE)などの高度な病原体検出技術は、大規模な樹木生産用の病原体テストされた繁殖材料を製造するために必要です。この方法は、柑橘類のサンプルでテストおよび検証されていますが、他の多くの作物の診断ラボや野外作業に適用できます。このテクニックを実行する初心者は、プロトコルに精通し、指示に正確に従い、辛抱強く待つ必要があります。まず、電話アプリのテストトラッカーを使用してツリーを選択し、近距離無線通信(NFC)カラータグを電話に保持して、ツリー情報をタグにロードします。3〜4個の柑橘類のつぼみサンプルをバッドウッドティッシュエクストラクター(BTE)互換のビニール袋キャリアに挿入し、クリップで閉じます。本文に記載されている手順に従ってサンプルの品質を確認した後、電話アプリのテストトラッカーを使用してツリーのNFCカラータグをスキャンし、サンプルバッグのNFCクリップタグにリンクします。適切に消毒されたドラフト内で、組織抽出ベースの背面にあるスイッチを切り替えます。ボックスの左側にあるスイッチの上部が押されていることを確認し、緑色のLEDが点滅してチャンバーの準備ができていることを示すまで待ちます。BTEチャンバーを準備するには、空のサンプルバッグをOリングを使用してバックノズルに固定し、チャンバーの背面に取り付けます。ブレードに摩耗や損傷の兆候がないか(ブレードの切り込みがプラスチックに続いている、または先端に切り傷があるなど)がないか調べます。ブレードの矢印が単一のロック記号と一致し、チャンバーの下部にある空気放出がO記号に向かっていることを確認します。チャンバーの開口部に透明な蓋を置きます。チャンバーの右側にあるトラックを使用して、透明なBTEスライドをチャンバーにスライドさせ、チャンバーの下部にあるロックをスライドに入ることができるまで押し込みます。プランジャーキャップがスライドの上部に取り付けられていることを確認します。BTEチャンバーをBTEベースにロードするには、BTEベースノズルをチャンバーの背面に突き出して、準備したチャンバーをベースに置きます。黄色のライトが点滅し始めるまで、NFCクリップタグの白いステッカーをゆっくりと円を描くようにボックスの右側のZに移動して、サンプルをBTEベースにロードします。サンプルをベースに取り付けた後、サンプルバッグに穴がないことを確認します。次に、Oリングをサンプルバッグの上に置き、BTEノズルの前面に固定します。未使用のシリンジセットをロードするには、まずシリンジセットを引き裂きます。次に、未使用のシリンジセットを体重計タワーに置きます。赤いライトが点滅し始めたとき、またはスケールがゼロと表示されたら、シリンジセットを取り外します。液体が下部のシリンジに残っていることを確認しながら、フィルター付きのプランジャーをシリンジから取り外します。プランジャーをペーパータオルまたはタワーの上に置いて、表面に触れないようにします。最後に、出口ポートをシリンジに押し込み、90度回転させて、シリンジをスライド出口ポートに取り付けます。バッドウッドサンプルの処理を開始するには、上部の黒いボタンを押してマシンを起動します。バッグから1本のバッドウッドスティックをつかみ、BTEノズルの上部に通します。もう一方の手でチャンバーの反対側にあるつぼみの棒をつかみ、ゆっくりとブレードにインチダウンします。つぼみを回転させながらゆっくりと前後に動かします。わずかなブーンという音が聞こえたら、枝を機械の奥深くに移動して師部に焦点を合わせます。すべてのブランチで同じことを完了したら、上部の黒いボタンを押して処理を停止し、ライトが再び黄色に点滅し始めるのを待ちます。サンプルの重量を確認するには、シリンジを90度回転させて引き下げます。プランジャーをシリンジに戻し、シリンジをタワーに置きます。スケールがサンプルを自動検出した後、緑色のLEDが点滅し、サンプルの重量が適切な範囲内にあることを示します。サンプル重量が低すぎることを示す赤いライトが点滅する場合は、サンプル処理を繰り返します。重量が高すぎる場合は、いくつかのサンプルを取り除くと、黄色のLEDの点滅が遅くなります。サンプルを均質化するには、サンプルが入っているシリンジからプランジャーを取り外します。液体をシリンジに押し込み、プランジャーを戻します。プランジャーを押してバッファーと植物の樹液をメッシュフィルターに通し、ゴムチューブを介して空のシリンジに入れます。バッファーと植物樹液を、サンプルが均質な緑色の液体になるまで、あるシリンジから別のシリンジに3〜4回前後に押して、サンプルを混合します。十分に均質化されたら、メッシュフィルターなしで植物樹液サンプルをシリンジに押し込み、ゴムチューブとフィルター付きのシリンジをそこから取り外します。次に、植物樹液サンプルをシリンジから2ミリリットルの滅菌マイクロ遠心チューブに排出します。永久マーカーを使用してサンプルにバッグ番号をラベル付けした後、さらに使用するまで摂氏マイナス20度で保管してください。10番目のサンプルが処理された後、BTE取り外し可能なチャンバーを消毒し、緑色のLEDが青色に変わるのではなく点滅し続けます。チャンバーを分解してすべての汚染物質を清掃するには、透明なプラスチックカバー、透明なチャンバースライド、およびチャンバースライドの詰まりポートを取り外します。次に、チャンバーの下部にあるエアリリースバルブを開いている南京錠のマークに回します。チャンバーコンポーネントをセットアップ超音波洗浄機に入れた後、蓋が浮かないように蓋を下にしてチャンバーをバスに入れます。超音波洗浄機を15分間実行します。チャンバーコンポーネントを水浴で少なくとも30秒間すすぎ、チャンバーコンポーネントを乾燥ステーションに移動します。乾燥を開始するには、エアガンをチャンバーの上部開口部の溝に沿って配置し、ガンのトリガーを押して約30秒間空気を分配します。エアガンをチャンバーの上部ノズルに向け、トリガーを押した後、各ノズル入口の3つの完全な円をゆっくりとトレースします。エアガンをBTEの中央に配置し、最も内側のポイントからトリガーを押したまま、エアガンがスライドの方を向くまで移動します。チャンバーの前面と背面全体にすばやく空気を流して、表面の水を外部から取り除きます。柑橘類組織処理のためのBTEと従来の実験室プロトコルとの比較は、両方の場合において260ナノメートルの吸光度を測定することによって決定された抽出核酸濃度が同等であることを示した。260ナノメートルと280ナノメートルの吸光度の比として決定されたBTEによって抽出された核酸の純度は、タンパク質汚染が低く、高かった。柑橘類NADHデヒドロゲナーゼ遺伝子のmRNAを標的とするRT-qPCRによって分析された核酸完全性は、BTEと標準的な手動プロトコルの両方で非常に類似していました。従来のラボ手順では、サンプルごとに手でチョッピングするのに約7〜10分かかり、凍結乾燥、粉砕、遠心分離などの組織処理により多くの時間が必要でした。ただし、BTEは、核酸抽出のために各サンプルを、準備、計量、および洗浄のステップを含めて3分で処理しました。最初のBTEサンプル処理からの72の健康なサンプルのいずれも、テストされた柑橘類病原体の増幅曲線を生成しなかったため、柑橘類組織のBTE処理が検証されました。2回目のBTEサンプル処理では、2つのミックス感染サンプルを導入し、抽出された核酸は、バッチ1および5で異なる柑橘類ウイルスおよびウイロイドの存在を示した。ただし、ヘッド間の相互汚染、偽陽性、または陰性の結果は検出されませんでした。処理中、枝を1か所に長時間置いたままにしておくと、枝に深く切り込みすぎて、目詰まりの可能性が高くなり、無細胞繊維材料が収集される可能性があります。処理が完了すると、材料はほとんどのDNAおよびRNA抽出および精製プロトコルの準備が整い、植物病原体の分子検出アッセイでテストできます。バッドウッド組織抽出器の開発により、ハイスループットエリアとグローブ全体のスクリーニングへの扉が開かれました。葉組織抽出器とともに、根や花柄など、以前は処理が困難とされていた植物組織を大規模に処理することができます。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

出典: Chen, H., 他 柑橘類の葉組織サンプルを用いた従来のPCRを用いた柑橘類緑化病原体 Candidatus liberibacter 属の特異的かつ正確な検出。 J. Vis. Exp.

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CRISPR-Cas12aと組み合わせたリコンビナーゼポリメラーゼ増幅を用いたフィールド展開可能な カンディダトゥス ・リベリバクター・アジアティカス検出(英語)

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実験計画法と自動化ワークフローで実現された遺伝子コード化されたバイオセンサー設計空間の効率的なサンプリング

学ぶ柑橘類の芽処理の自動化技術。Budwood Tissue Extractorを用いて、病原体検出のための組織処理を迅速化し、労働コストと設備費用を削減します。植物病理学と作物管理の分野で応用可能です。

機器エンジニアリングによる下流の病原体検出のための柑橘類の芽処理の自動化

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