Name: 哺乳類のミトコンドリア機能を測定するための酸素非依存性アッセイ(英語) (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-19T12:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 59 s
Description: 学ぶ酸素非依存性アッセイによる哺乳類ミトコンドリア機能測定法。低酸素環境下での代謝ストレス適応メカニズムを解明し、フマル酸を代替電子受容体とする新規経路を検証するプロトコルを提供します。

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この原稿で制作された図は、BioRender.com で作成されました。この記事に関するフィードバックを提供してくださった Amy Walker に感謝します。J.B.S.はウースター生物医学研究助成財団の支援を受けました。

安定同位体トレーシングと LC-MS 分析による DHODH および SDH 活性の測定

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<li>Lee, P., Chandel, N. S., Simon, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+adaptation+to+hypoxia+through+hypoxia+inducible+factors+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular adaptation to hypoxia through hypoxia inducible factors and beyond.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (5), 268-283 (2020).</li>
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<li>Iwai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+accumulation+during+ischemia+induces+mitochondrial+damage+in+perfused+rat+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Sodium accumulation during ischemia induces mitochondrial damage in perfused rat hearts.</a> Cardiovascular Research. 55 (1), 141-149 (2002).</li>
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<li>Gameiro, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+HIF-mediated+reductive+carboxylation+is+regulated+by+citrate+levels+and+sensitizes+VHL-deficient+cells+to+glutamine+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">In vivo HIF-mediated reductive carboxylation is regulated by citrate levels and sensitizes VHL-deficient cells to glutamine deprivation.</a> Cell Metabolism. 17 (3), 372-385 (2013).</li>
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著者には、報告すべき利益相反はありません。

新たな研究により、哺乳類のミトコンドリアは分子状酸素を消費せずに機能できることが示されているため、研究者がミトコンドリアの機能を正確に定量化するために、OCR測定を超えて直交アッセイを採用することが最も重要です。ここでは、ミトコンドリアNAD+/NADHバランス、適応末端電子受容体の利用、ATPの産生、 de novo ピリミジン生合成、およびミトコンドリア由来ROSを測定することにより、複合体I、複合体II、複合体V、およびDHODHの活性を直接評価するために使用できる一連のアッセイをまとめました。特に、これらのアッセイは、OCR測定よりもミトコンドリア機能をより直接的に測定します。さらに、これらのアッセイは、低酸素状態のミトコンドリア機能を定量化するための扱いやすい方法を研究者に提供しますが、フマル酸塩が好まれる末端電子受容体として使用されているため、OCR測定はほとんど無関係です。最後に、ここで説明する増殖ベースの方法は、従来の呼吸測定実験よりも費用効果が高いため、哺乳類システムのミトコンドリア機能を研究するための広くアクセス可能な方法を提供します。
これらのアッセイを利用して培養細胞のミトコンドリア機能を測定する際には、重要な考慮事項があります。増殖アッセイに関しては、各細胞株の倍増率に合わせて播種する細胞数を調整することが重要です。細胞は、増殖の違いを定量化できるように、少なくとも10%のコンフルエントに播種し、3〜4倍に十分なスペースを確保する必要があります。各アッセイの別の考慮事項は、各ETC複合体の活性のコントロールとして使用される低分子の濃度です。異なる細胞株はこれらの阻害剤に対して異なる感受性を示す可能性があるため、これらの低分子の用量をテストして最適な濃度を特定することが重要です。
OCR測定およびここに記載されているすべてのアッセイを含む、in vitroでミトコンドリア機能を研究するアッセイの普遍的な制限は、培地の代謝組成です。標準的な細胞培養培地は、システムを表面的に高いレベルのミトコンドリア機能に偏らせる傾向があります。例えば、超生理学的グルタミンレベルは、TCAサイクル25のアナプレローシスを増加させ、ミトコンドリアNADH合成を促進し、その結果、酸化的リン酸化を増加させる。同様に、酸素分圧は、哺乳類組織では3mmHgから100mmHg(約0.1%〜13%O2)の範囲であるが、インビトロでは大気(140mmHg、約21%)である26,27。この過剰のO2は、ミトコンドリア呼吸能力およびスーパーオキシド産生を最大にする28。最近、より生理学的になるように培養培地を設計する努力がなされている29、30。注目すべきことに、ヒト血漿様培地中で細胞を培養すると、一部の癌細胞株30におけるミトコンドリア呼吸、T細胞31におけるミトコンドリアROS、および癌治療へのミトコンドリア適応32が減少する。したがって、使用する培地の組成に注意し、それがミトコンドリア機能にどのように影響するかを理解することが重要です。
ミトコンドリア機能の解釈における別の重要かつ普遍的な制限は、ミトコンドリアの数の違いの可能性である。したがって、mtDNA33の定量、膜電位非感受性色素34によるミトコンドリア質量の測定、またはミトコンドリアマーカーのウェスタンブロッティングのいずれかを通じてミトコンドリア含有量を測定することが重要です。これは、ミトコンドリア数の減少がミトコンドリア機能の低下と間違えられないようにするための重要な制御です。
また、ここで説明するアッセイに適用される特定の制限とトラブルシューティングもあります。第一に、分化した細胞が増殖しないことを考えると、増殖ベースのアッセイは、この文脈でミトコンドリア機能を評価するのに有用ではないであろう。DHODH活性を測定するための13C4-アスパラギン酸トレースプロトコルの主な制限は、細胞内でのアスパラギン酸の取り込みが非常に非効率的である可能性があることです35。この潜在的な限界を克服するために、研究者はアスパラギン酸トランスポーターSLC1A3を過剰発現して、13C4-アスパラギン酸の取り込みを促進することができます35。
SDH活性を測定するために13C5-グルタミントレースを使用するプロトコルの制限は、このアッセイでは、逆活性を測定するために細胞が還元カルボキシル化経路を利用してM+3同位体を濃縮する必要があることです。一部の細胞株は、ATPクエン酸リアーゼ発現が低い36、不十分なHIF安定化37、またはα-KG:クエン酸比が低すぎる38のために、還元的カルボキシル化フラックスができません。この制限を克服するために、13C4-アスパラギン酸トレースを利用してSDHの順方向および逆方向の活動を測定することができます7。このアッセイでは、SDHの前方活性は、フマル酸塩M+2:コハク酸塩M+2の比と、コハク酸M+4:フマル酸塩M+4の逆反応によって測定できます。特に、このトレースは還元的カルボキシル化経路のほとんどの酵素を回避します。
読み出しとしてDCPIP還元を使用する複合体I活性アッセイの制限は、ミトコンドリアが構造的に無傷ではないことである。ミトコンドリアを凍結融解してアッセイのためのNADH取り込みを可能にするプロセスは、ミトコンドリア膜の構造的完全性を確実に損なう可能性がある39。このアッセイは、複合体I増殖アッセイなどのアッセイと並行して実施し、観察された複合体I活性の変化が無傷の細胞にも当てはまることを確認する必要があります。
将来の研究では、これらの技術のいくつかは、マウスやCaenorhabditis elegansなどのモデル生物を使用して、in vivoでミトコンドリア機能を測定するために適用することができます。生体内でミトコンドリア機能を測定するために使用されている現在の方法は、生物レベルのOCR、特にマウスモデルを使用した場合の呼吸交換速度に集中しています。この方法の明らかな制限は、酸素がミトコンドリアETCのユビキタス末端電子受容体としての役割を超えて、多くの生化学的およびシグナル伝達機能を果たすことです。例えば、酸素はジオキシゲナーゼファミリーの酵素の触媒活性によって「消費」される。これらの酵素は細胞の酸素消費速度に寄与しますが、ミトコンドリア機能に参加、調節、または反映しません。in vitroでの古典的な呼吸測定実験は、典型的には「非ミトコンドリアOCR」を制御するが、生物呼吸交換比(RER)実験はこれを制御できず、in vivoでのミトコンドリア機能の指標としてのRERの解釈を制限する。しかし、13C4-アスパラギン酸トレースによるDHODH活性、13C5-グルタミントレースによる複合体II活性、組織から精製したミトコンドリアに対する複合体I活性、およびMitoBなどのLC-MSに優しい化合物を用いたミトコンドリアROSを測定するためにプロトコルを適応させて、in vivoでのミトコンドリア機能を測定することは可能です.ミトコンドリアの機能を調べるためのこれらの直接アッセイは、古典的な呼吸測定実験と組み合わせて、研究者に哺乳類の細胞および組織におけるミトコンドリア機能のより包括的で正確な評価を提供します。

ミトコンドリア機能は、哺乳類細胞の主要な生合成、生体エネルギー、およびシグナル伝達機能を維持するため、細胞の健康の重要な指標です1。ミトコンドリア機能の大部分は電子伝達系(ETC)を通る電子の流れを必要とし、ETCにおける電子の流れの中断は重篤なミトコンドリア病を引き起こします2。ETCは、ミトコンドリア内膜に埋め込まれた一連の還元・酸化(酸化還元)反応で構成されており、これらの電子移動反応は自由エネルギーを放出し、ATP合成、熱発生などの生理過程、de novoピリミジン生合成などの生合成経路、NADHなどの補因子の酸化還元状態のバランスをサポートします。ETC複合体IおよびIIIは活性酸素種(ROS)3,4,5を生成し、HIF、PI3K、NRF2、NFκB、MAPK 6などのシグナル伝達主要経路を調節します。その結果、ETCにおける電子の流れの測定基準は、哺乳類細胞におけるミトコンドリア機能の代理として古典的に使用されている。
呼吸測定実験は、哺乳類細胞のミトコンドリア機能を測定するために頻繁に使用されます。O2は哺乳類ETCにとって最も遍在する末端電子受容体であるため、その還元はミトコンドリア機能の代理として使用されます。しかし、新たな証拠は、哺乳類のミトコンドリアが、de novoピリミジン生合成7、NADH酸化7、硫化水素の解毒8など、ETCに依存するミトコンドリア機能を維持するための電子受容体としてフマル酸塩を使用できることを示しています。したがって、特定の状況、特に低酸素環境において、O2消費速度(OCR)の測定は、ミトコンドリア機能の正確または正確な指標を提供しない。
ここでは、OCRとは無関係にミトコンドリア機能を測定するために使用できる一連のアッセイの概要を説明します。複合体Iを介したNADH酸化、ジヒドロオロチン酸デヒドロゲナーゼを介した de novo ピリミジン生合成、複合体V依存性ATP合成、コハク酸デヒドロゲナーゼ(SDH)複合体の正味の方向性、およびミトコンドリア由来ROSを直接測定するアッセイを提供しています。これらのアッセイは、培養哺乳類細胞に対して実施することを意図しているが、その多くは in vivoでの ミトコンドリア機能の研究に適応させることができる。特に、このプロトコルに記載されているアッセイは、OCRよりもミトコンドリア機能のより直接的な測定です。さらに、それらは、OCRが指標測定ではない状況である低酸素状態でのミトコンドリア機能の測定を可能にします。まとめると、これらのアッセイは、古典的な呼吸測定実験と組み合わせて、哺乳類細胞のミトコンドリア機能のより包括的な評価を研究者に提供します。

<table><tbody><tr><td>&nbsp;1.5 mLチューブ</td><td>Cell Treat</td><td>667443</td><td></td></tr><tr><td>2.0 mLチューブ</td><td>Cell Treat</td><td>229446</td><td></td></tr><tr><td>6ウェルプレート</td><td>Cell Treat</td><td>229106</td><td></td></tr><tr><td>12ウェルプレート</td><td>Cell Treat</td><td>229112</td><td></td></tr><tr><td>13C4-アスパラギン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>604852</td><td></td></tr><tr><td>13C5-Glutamine</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>285978-14-5</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 遠心チューブ</td><td>Cell Treat</td><td>667411</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 遠心チューブ</td><td>Cell Treat</td><td>667421</td><td></td></tr><tr><td>150 mm 組織培養皿</td><td>Cell Treat</td><td>229651</td><td></td></tr><tr><td>1x リン酸緩衝生理食塩水</td><td>Gibco</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>2,6-ジクロロフェノールインドフェノール</td><td>ハネウェル社</td><td>33125</td><td></td></tr><tr><td>炭酸アンモニウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>37999</td><td></td></tr><tr><td>アンチマイシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>Ascentis Express C18</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>53825-U</td><td></td></tr><tr><td>ボトルトップフィルター 500 mL、0.22 & マイクロ;m、PES 9 9 mm 膜径</td><td>細胞治療</td><td>229717</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3294</td><td></td></tr><tr><td>Brequinar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0113</td><td></td></tr><tr><td>Cell Lifter, Double End Flat and Narrow Blade</td><td>Cell Treat</td><td>229305</td><td></td></tr><tr><td>CentriVap -105 Cold Trap</td><td>Labconco</td><td>7385020</td><td></td></tr><tr><td>Complete Protease Inhibitor錠剤</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td>4693116001</tr><tr><td>コールターカウンターカップ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>07-000-694</td><td></td></tr><tr><td>デシルビキノン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7911</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Invitrogen</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'S Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge 5425R</td><td>Eppendorf</td><td>2231000908</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge 5910 Ri</td><td>Eppendorf</td><td>5943000343</td><td></td></tr><tr><td>Galactose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5388</td><td></td></tr><tr><td>グルコース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>グルコースフリー DMEM</td><td>Gibco</td><td>11966025</td><td></td></tr><tr><td>グルタミンフリー DMEM</td><td>サーモフィッシャー</td><td>11960044</td><td></td></tr><tr><td>熱不活化ウシ胎児血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>HPLC グレード 35% 水酸化</td><td>アンモニウムThermo Scientific</td><td>460801000</td><td></td></tr><tr><td>HPLC グレードアセトニトリル</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>900667</td><td></td></tr><tr><td>HPLC グレード クロロホルム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>366927</td><td></td></tr><tr><td>HPLC グレード ギ酸</td><td>Thermo Scientific</td><td>28905</td><td></td></tr><tr><td>HPLC グレード イソプロパノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>563935</td><td></td></tr><tr><td>HPLC グレード MeOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>900688</tr><tr><td>HPLCグレードの水</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270733</td><td></td></tr><tr><td>Human Osteosarcome Cell Line 143B</td><td>ATCC</td><td>CRL-8303</td><td></td></tr><tr><td>塩酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331-500ML</td><td></td></tr><tr><td>イソトーンバッファー</td><td>ベックマン・コールター</td><td>8546719</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2222</td><td></td></tr><tr><td>マンニトール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>MitoSox Red</td><td>Invitrogen</td><td>M36008</td><td></td></tr><tr><td>N-アセチル-L-システイン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>オリゴマイシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75351-5MG</td><td></td></tr><tr><td>ペンシルリン ストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Potter-Elvehjem ティッシュグラインダー サイズ 21</td><td>Kimble</td><td>885502-0021</td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸フリー DMEM 培地</td><td>Gibco</td><td>11965175</td><td></td></tr><tr><td>Q Exactive Plus 質量分析計</td><td>Thermo Scientific</td><td>726030</td><td></td></tr><tr><td>ReCO2ver インキュベーター</td><td>ベイカー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>冷蔵 Centrivap ベンチトップ 真空濃縮器</td><td>Labconco</td><td>7310020</td><td></td></tr><tr><td>RIPA バッファー</td><td>ミリポア シグマ</td><td>20188</td><td></td></tr><tr><td>ロテノン</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>SeQuant ZIC-pHILIC 5&mu;m 150 x 2.1 mm 分析カラム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.50460.0001</td><td></td></tr><tr><td>SeQuant ZIC-pHILIC ガードキット</td><td>ミリポア Sigma</td><td>1.50438.0001</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム、ペレット</td><td>ミリポア Sigma</td><td>567530-250GM</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>SW、TRACEFINDER 5.1 SP3</td><td>Thermo Scientific</td><td>OPTON-31001</td><td></td></tr><tr><td>tert-ブチルヒドロペルオキシド溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>458139</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93352</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA(0.25%)、フェノールレッド</td><td>Gibco</td><td>25-200-114</td><td></td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3003</td><td></td></tr><tr><td>VANQUISH HORIZON / FLEX HPLC</td><td>Thermo Scientific</td><td>VF-S01-A-02</td><td></td></tr><tr><td>Z2 Coulter 粒子数とサイズ分析</td>器 <td>Beckman Coulter</td><td>BZ10131270</td><td></td></tr></tbody></table>

哺乳類のミトコンドリア機能を測定するための酸素非依存性アッセイ(英語)

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals

ミトコンドリア電子伝達系(ETC)における電子の流れは、哺乳類細胞における多面的な生合成、生体エネルギー、およびシグナル伝達機能をサポートしています。酸素(O2)は哺乳類ETCにとって最も遍在する末端電子受容体であるため、O2 消費速度はミトコンドリア機能の代理として頻繁に使用される。しかし、新たな研究は、フマル酸塩が低酸素状態でミトコンドリア機能を維持するための代替電子受容体として使用できるため、このパラメーターが必ずしもミトコンドリア機能を示すとは限らないことを示しています。この記事では、研究者がO2 消費速度とは無関係にミトコンドリア機能を測定できるようにする一連のプロトコルをまとめています。これらのアッセイは、低酸素環境におけるミトコンドリア機能を研究する場合に特に有用である。具体的には、ミトコンドリアATP産生、 de novo ピリミジン生合成、複合体IによるNADH酸化、およびスーパーオキシド産生を測定する方法について説明します。従来の呼吸測定実験と組み合わせることで、これらの直交的で経済的なアッセイは、研究者に関心のあるシステムにおけるミトコンドリア機能のより包括的な評価を提供します。

DHODH、複合体I、および複合体Vの活性はすべて、増殖アッセイを用いて評価することができる。培養液からウリジンが奪われると、細胞はピリミジン生合成のための de novo 経路により依存するようになります。したがって、細胞をウリジンを含まない培地で増殖させるように挑戦した場合、ウリジンを含む培地で培養した細胞よりも、ブレキナーによるDHODH活性の阻害に対してより敏感でした(図6A)。同様に、培養液からのピルビン酸の除去は、細胞を増殖のための複合体I活性により依存させる。したがって、細胞をピルビン酸を含まない培地で増殖させるように挑戦した場合、ピルビン酸含有培地で培養した細胞よりも、ロテノンによる複合体I活性の阻害に対してより感受性がありました(図6B)。複合体V活性は、グルコースの代わりにガラクトースを含む培地中で細胞を増殖させることによって評価することができる。ガラクトースは解糖系で正味ゼロのATPを生成するため、この燃料で増殖する細胞は、複雑なV活性を介したミトコンドリアATP合成により依存しています。したがって、ガラクトース含有培地中で増殖する細胞は、グルコース含有培地中で増殖する細胞よりもオリゴマイシンによる複合体V阻害に対してより感受性であった(図6C)。
SDH活性は、13C5-グルタミントレースを使用し、フマル酸塩およびコハク酸同位体への取り込みをモニタリングすることによって測定できます。ビヒクル処理条件では、SDH複合体は前方活性に有利であり、13C 4-フマル酸塩への13 C4-コハク酸塩の取り込みは、13 C 3-フマル酸塩の13 C3-コハク酸塩への取り込みよりも高かった(図7)。抗マイシン処理条件では、SDH複合体は逆の活性に有利であり、13C 3-フマル酸塩の13 C3-コハク酸塩への取り込みは、13 C 4-コハク酸塩の13C4-フマル酸塩への取り込みよりも大きかった(図7)。
ミトコンドリア内部のスーパーオキシド産生は、スーパーオキシドと反応すると2-ヒドロキシ-ミトエチジウムを生成する蛍光レポーターMitoSoxを用いて測定することができる。この研究では、tertブチル過酸化水素の存在下でMitoSoxで処理された細胞は、細胞のROSを消光する抗酸化物質であるNACの添加によって抑制された方法で、より高いレベルの2-ヒドロキシ-ミトエチジウムを示しました(図8)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig01.jpg"> 図1:複雑なV増殖アッセイの機構的基礎。 解糖によるグルコースとガラクトースの酸化。グルコースは解糖系から正味2個のATPを生成しますが、ガラクトースはUDP-ガラクトースにはUTP合成が必要であるため、正味ゼロのATPを生成します。したがって、ガラクトースで増殖した細胞は、解糖系から産生されるATPが不足しているため、ミトコンドリアATP合成により依存しています。略語:GALK =ガラクトキナーゼ;GALT = ガラクトース-1-リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ;PGM1 = ホスホグルコムターゼ 1;GPI = グルコース-6-リン酸イソメラーゼ、UGP = UDP-グルコースピロホスホリラーゼ;GALE = UDP-ガラクトース-4-エピメラーゼ;NDK = ヌクレオチド二リン酸キナーゼ;UMPK = ウリジン一リン酸キナーゼ;HK = ヘキソキナーゼ;PFK = ホスホフルクトキナーゼ;アルド=アルドラーゼ;TPI = トリオースリン酸イソメラーゼ;GAPDH = グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ;PGK = ホスホグリセリン酸キナーゼ;PGM = ホスホグルコムターゼ;ENO = エノレーゼ;PK = ピルビン酸キナーゼ。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig02.jpg"> 図2:複合体I増殖アッセイの機構的基礎。 複合体I活性の阻害時に変化する代謝経路の概略図。高ピルビン酸培地では、複合体I阻害はLDHを介したNADH酸化によってバイパスされます。低ピルビン酸培地では、この適応はあまり実現不可能であり、細胞はNADHを再酸化するために複合体I活性により依存するようになります。略語:LDH =乳酸デヒドロゲナーゼ;TCAサイクル=トリカルボン酸サイクル。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig03.jpg"> 図3:13C4-アスパラギン酸トレース時のDHODH反応の模式図。ブレキナーはジヒドロオロテートのオロチン酸への酸化を阻害し、UMPの下流合成を妨げます。13名C4-アスパラギン酸は、DHODH活性を介して13C3-UMPに組み込まれる。略語:OMM =外側ミトコンドリア膜;IMM = ミトコンドリア内膜;DHODH = ジヒドロオロテートデヒドロゲナーゼ。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig04.jpg"> 図4:13C5-グルタミントレースによる順方向および逆方向の複合体II活性の測定。複合体IIの前方活性を測定するために(左)、13C4-コハク酸塩および13 C4-フマル酸塩への13C 5-グルタミンの取り込みをモニターした。逆複合体II活性を測定するために(右)、13C 3-コハク酸塩および13 C3-フマル酸塩への13C5-グルタミンの取り込みをモニターした。略語:SDH =コハク酸デヒドロゲナーゼ;CytC = シトクロムC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig05.jpg"> 図5:スーパーオキシドとのマイトソックスレッド反応。 MitoSoxとミトコンドリアスーパーオキシドとの反応により、2-OH-MitoE2+が形成されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig06.jpg"> 図6:ミトコンドリア機能を測定するための増殖ベースのアッセイ (A)±100 ug/mLウリジンを含む培地でのDHODH阻害剤である5 uMブレキナーで処理した143B骨肉腫細胞の増殖。データはSEM±平均です。条件ごとにN = 3。(B)±5 mMピルビン酸を含む培地中で、複合体I阻害剤である2 uMロテノンで処理した143B骨肉腫細胞の増殖。データはSEM±平均です。条件ごとにN = 3。(C)複合V阻害剤である5 μMオリゴマイシンで処理した143B骨肉腫細胞の、10 mMグルコースまたは10 mMガラクトースのいずれかを唯一の中心炭素源とする培地での増殖。データはSEM±平均です。条件ごとにN = 3。*は、グラフパッドプリズムの一元配置分散分析(ANOVA)検定を使用した p &lt; 0.05を示します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig07.jpg"> 図7:複合体II活性を測定するための13C5-グルタミントレース。DMSOおよび500 nM抗マイシンA処理Caki1およびDLD1細胞におけるコハク酸酸化およびフマル酸還元(SDH逆)。データはSEM±平均を表します。条件ごとにN = 3。は、GraphPad Prismの対応のないt検定を使用してp &lt; 0.05を示します。略語:SDH =コハク酸酸化;SDHリバース=フマル酸還元。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig07large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig08v2.jpg"> 図8:スーパーオキシドを検出するためのLCMSベースのMitoSoxアッセイ。 tBuOOH ± NACの存在下でMitoSoxで30分間処理したCaki1細胞から単離した2-OH-Mito E2+ のイオンクロマトグラムを抽出しました。略語:LCMS =液体クロマトグラフィー - 質量分析;NAC = N-アセチルシステイン。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig08large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
表1:このプロトコルで使用される試薬、バッファー、および培地の組成。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184_Table%201%20Reaction%20Compositions_Revision%20(2).xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

ここでは、分子状酸素を消費する能力とは無関係に、哺乳類細胞のミトコンドリア機能を直接測定するためのアッセイをまとめたものです。

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in ...

私たちの研究は、ミトコンドリアが代謝ストレッサーをどのように感知し、適応するかに焦点を当てています。重要な代謝ストレッサーの1つは、細胞が酸素が不足しているときに発生する低酸素症です。私たちは、低酸素環境におけるミトコンドリア機能を研究するためのより良いアッセイを開発しています。細胞および組織の代謝物レベルを研究するために、より高分解能の質量分析が採用されました。安定同位体追跡研究を用いて、特定の代謝物の運命を追跡し、健常および罹患した哺乳類の生理学に関連する新しい代謝経路を明らかにしました。グループは、哺乳類のミトコンドリアが低酸素環境で重要な機能を維持できることを発見しました。機械的には、電子伝達系の代替電子セプターとしてフマル酸塩を採用しています。このプロトコルは、研究者が哺乳類細胞のミトコンドリア機能をより適切に評価するために使用できるいくつかのアッセイをまとめたものです。重要なことに、これらのプロトコルは、古典的な呼吸測定実験では十分ではないため、低酸素症のミトコンドリア機能を研究するために使用できます。

oxygen-independent-assays-to-measure-mitochondrial-function-in-mammals

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

単離ミトコンドリアマウス心臓におけるミトコンドリア透過性遷移孔の開口部を測定するための分光蛍光プロトコルがここに提示されます。アッセイは、ミトコンドリアCaの同時測定を含む...

単離ミトコンドリアマウス心臓における透水性遷移孔の開口部のマルチパラメータ測定

サンプル間のミトコンドリア膜電位の比較は、細胞の状態に関する貴重な情報をもたらします。ミトコンドリアを単離し、蛍光を使用して阻害剤およびアンカプラーに対する反応を評価するための詳細な手順について説明します。このプロトコルの方法と有用性は、細胞培養と細胞ストレスの動物モデルの使用によって説明されています。...

培養細胞およびマウス組織から単離とミトコンドリアの機能解析

提示された方法は、マウス骨格筋の最小量から単離されたミトコンドリアを使用したマイクロプレートベースの呼吸測定アッセイのコレクションの性能について、段階的な指示を提供します。これらのアッセイは、一般的に使用される動物モデルにおけるミトコンドリア酸素消費量の機構的変化/適応を測定することができます。...

ハイスループットマイクロプレート呼吸測定のためのマウス骨格筋の最小量から単離されたミトコンドリアを使用して

ここでは、以前に報告された方法の修正版を提示し、少量のマウス骨格筋から高品質で精製されたミトコンドリアを分離することを可能にします。この手順により、マイクロプレートベースの呼吸器アッセイ中に高機能で呼吸する高度に結合したミトコンドリアが得られます。...

ハイスループットマイクロプレート呼吸測定のためのマウスの骨格筋の最小量からミトコンドリアの単離

本稿で、ショウジョウバエのグリセリン thoraxes...

ショウジョウバエのティッシュの最小限の量を使用してのグリセリンの繊維でミトコンドリアの酸素消費量の測定

ミトコンドリアの呼吸は生物の生存にとって重要ですしたがって、酸素消費量は、ミトコンドリアの健康の優れた指標です。このプロトコルでは基底を測定する市販の呼吸の使用を述べるし、最大酸素消費量のライブ、線虫そのまま・自由に運動。...

そのまま線虫の酸素消費量の測定

新鮮な腫瘍ホモジナートにおけるミトコンドリア酸化リン酸化と電子移動能を評価する実用的なプロトコルと分析手法を開発しました。このプロトコルは、がんの開始、進行、および治療応答に寄与する様々なミトコンドリア機能を調査するために容易に適応することができる。...

切除された固形腫瘍均質物のミトコンドリア機能の分析的決定

ここでは、マウス骨格筋からのミトコンドリア単離の詳細な方法と、その後のマイクロプレートベースの呼吸数アッセイを用いた酸素消費速度(OCR)による呼吸の分析について説明する。このパイプラインは、ミトコンドリア代謝に対する複数の環境的または遺伝的介入の影響を研究するために適用することができる。...

呼吸法アッセイのためのマウス骨格筋からのミトコンドリアの単離

この論文は、脂質近位環境におけるin vitroでの内在性膜タンパク質とさまざまなパートナー因子との相互作用と集合を評価する方法を説明しています。...

足場リポソームを使用することにより、脂質近位タンパク質 - タンパク質相互作用を再構成しますインビトロ

アガロースゲル遅延アッセイによるtRNA（UUU）の産生および酵素TcdAとの複合体におけるtRNA（UUU）の分析のためのプロトコールが提示される。...

タンパク質分析のためのタンパク質tRNAアガロースゲルリターデーションアッセイ<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; - スルホニルカルバモイルアデノシンTcdA機能

学ぶ酸素非依存性アッセイによる哺乳類ミトコンドリア機能測定法。低酸素環境下での代謝ストレス適応メカニズムを解明し、フマル酸を代替電子受容体とする新規経路を検証するプロトコルを提供します。

哺乳類のミトコンドリア機能を測定するための酸素非依存性アッセイ(英語)

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