Name: 3CでAを取得する:学部生のための染色体コンフォメーションキャプチャ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T13:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: 学ぶ染色体コンフォメーションキャプチャ（3C）法によるクロマチン構造解析と遺伝子発現制御のメカニズム。C. elegansを用いた実験操作で学部生も研究に参加できる詳細なプロトコルを提供します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この作業は、助成金番号P20GM103430の国立衛生研究所の国立総合医学研究所のロードアイランド機関開発賞(IDeA)ネットワークオブバイオメディカルリサーチエクセレンスとブライアント健康行動科学センターによって部分的にサポートされました。

学部研究および教育のための染色体コンフォメーションキャプチャー(3C)

<ol><li>McBryant, S. J., Adams, V. H., Hansen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+architectural+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Research%22%5BJournal%5D)">Chromatin architectural proteins.</a> Chromosome Research. 14 (1), 39-51 (2006).</li>
<li>Nalabothula, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chromatin+architectural+proteins+HMGD1+and+H1+bind+reciprocally+and+have+opposite+effects+on+chromatin+structure+and+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">The chromatin architectural proteins HMGD1 and H1 bind reciprocally and have opposite effects on chromatin structure and gene regulation.</a> BMC Genomics. 15, 92(2014).</li>
<li>John, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+accessibility+pre-determines+glucocorticoid+receptor+binding+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Chromatin accessibility pre-determines glucocorticoid receptor binding patterns.</a> Nature Genetics. 43 (3), 264-268 (2011).</li>
<li>Fawcett, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+occurrence+of+a+fibrous+lamina+on+the+inner+aspect+of+the+nuclear+envelope+in+certain+cells+of+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">On the occurrence of a fibrous lamina on the inner aspect of the nuclear envelope in certain cells of vertebrates.</a> The American Journal of Anatomy. 119 (1), 129-145 (1966).</li>
<li>Reddy, K. L., Zullo, J. M., Bertolino, E., Singh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+repression+mediated+by+repositioning+of+genes+to+the+nuclear+lamina%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transcriptional repression mediated by repositioning of genes to the nuclear lamina.</a> Nature. 452 (7184), 243-247 (2008).</li>
<li>Finlan, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+to+the+nuclear+periphery+can+alter+expression+of+genes+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Recruitment to the nuclear periphery can alter expression of genes in human cells.</a> PLoS Genetics. 4 (3), e1000039(2008).</li>
<li>Chambeyron, S., Da Silva, N. R., Lawson, K. A., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+re-organisation+of+the+Hoxb+complex+during+mouse+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Nuclear re-organisation of the Hoxb complex during mouse embryonic development.</a> Development. 132 (9), 2215-2223 (2005).</li>
<li>Chambeyron, S., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+decondensation+and+nuclear+reorganization+of+the+HoxB+locus+upon+induction+of+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Chromatin decondensation and nuclear reorganization of the HoxB locus upon induction of transcription.</a> Genes and Development. 18 (10), 1119-1130 (2004).</li>
<li>Mahy, N. L., Perry, P. E., Gilchrist, S., Baldock, R. A., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+organization+of+active+and+inactive+genes+and+noncoding+DNA+within+chromosome+territories%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Spatial organization of active and inactive genes and noncoding DNA within chromosome territories.</a> The Journal of Cell Biology. 157 (4), 579-589 (2002).</li>
<li>Mahy, N. L., Perry, P. E., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+density+and+transcription+influence+the+localization+of+chromatin+outside+of+chromosome+territories+detectable+by+FISH%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Gene density and transcription influence the localization of chromatin outside of chromosome territories detectable by FISH.</a> The Journal of Cell Biology. 159 (5), 753-763 (2002).</li>
<li>Li, B., Carey, M., Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+chromatin+during+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The role of chromatin during transcription.</a> Cell. 128 (4), 707-719 (2007).</li>
<li>Chen, A., Chen, D., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+of+DNase-seq+for+mapping+active+gene+regulatory+elements+across+the+genome+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Advances of DNase-seq for mapping active gene regulatory elements across the genome in animals.</a> Gene. 667, 83-94 (2018).</li>
<li>Hughes, A. L., Rando, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+underlying+nucleosome+positioning+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Mechanisms underlying nucleosome positioning in vivo.</a> Annual Review of Biophysics. 43, 41-63 (2014).</li>
<li>Weiner, A., Hughes, A., Yassour, M., Rando, O. J., Friedman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+nucleosome+mapping+reveals+transcription-dependent+promoter+packaging%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">High-resolution nucleosome mapping reveals transcription-dependent promoter packaging.</a> Genome Research. 20 (1), 90-100 (2010).</li>
<li>Hughes, A. L., Jin, Y., Rando, O. J., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+evolutionary+approach+to+identify+determinants+of+nucleosome+positioning%3A+A+unifying+model+for+establishing+the+genome-wide+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">A functional evolutionary approach to identify determinants of nucleosome positioning: A unifying model for establishing the genome-wide pattern.</a> Molecular Cell. 48 (1), 5-15 (2012).</li>
<li>Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+chromosome+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Capturing chromosome conformation.</a> Science. 295 (5558), 1306-1311 (2002).</li>
<li>van Berkum, N. L., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+spatial+chromatin+organization+of+large+genomic+regions+using+5C+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Determining spatial chromatin organization of large genomic regions using 5C technology.</a> Methods in Molecular Biology. 567, 189-213 (2009).</li>
<li>Smith, E. M., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invariant+TAD+boundaries+constrain+cell-type-specific+looping+interactions+between+promoters+and+distal+elements+around+the+CFTR+locus%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Invariant TAD boundaries constrain cell-type-specific looping interactions between promoters and distal elements around the CFTR locus.</a> American Journal of Human Genetics. 98 (1), 185-201 (2016).</li>
<li>Crane, E. E. Two inputs into C. elegans dosage compensation: Chromosome conformation and the miRNA-specific argonaute ALG-2. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22University+of+California%2C+Berkeley%22">University of California, Berkeley</a>. , PhD thesis (2012).</li>
<li>Bell, A. C., West, A. G., Felsenfeld, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+CTCF+is+required+for+the+enhancer+blocking+activity+of+vertebrate+insulators%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The protein CTCF is required for the enhancer blocking activity of vertebrate insulators.</a> Cell. 98 (3), 387-396 (1999).</li>
<li>Cuadrado, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+contributions+of+cohesin-SA1+and+cohesin-SA2+to+TADs+and+polycomb+domains+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Specific contributions of cohesin-SA1 and cohesin-SA2 to TADs and polycomb domains in embryonic stem cells.</a> Cell Reports. 27 (12), 3500-3510 (2019).</li>
<li>Sarro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disrupting+the+three-dimensional+regulatory+topology+of+the+Pitx1+locus+results+in+overtly+normal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Disrupting the three-dimensional regulatory topology of the Pitx1 locus results in overtly normal development.</a> Development. 145 (7), (2018).</li>
<li>Tolhuis, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+among+polycomb+domains+are+guided+by+chromosome+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Interactions among polycomb domains are guided by chromosome architecture.</a> PLoS Genetics. 7 (3), e1001343(2011).</li>
<li>Splinter, E., de Wit, E., van de Werken, H. J. G., Klous, P., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+long-range+chromatin+interactions+for+selected+genomic+sites+using+4C-seq+technology%3A+From+fixation+to+computation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Determining long-range chromatin interactions for selected genomic sites using 4C-seq technology: From fixation to computation.</a> Methods. 58 (3), 221-230 (2012).</li>
<li>Fernández-Miñán, A., Bessa, J., Tena, J. J., Gómez-Skarmeta, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+21+-+Assay+for+transposase-accessible+chromatin+and+circularized+chromosome+conformation+capture%2C+two+methods+to+explore+the+regulatory+landscapes+of+genes+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Chapter 21 - Assay for transposase-accessible chromatin and circularized chromosome conformation capture, two methods to explore the regulatory landscapes of genes in zebrafish.</a> Methods in Cell Biology. 135, 413-430 (2016).</li>
<li>Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+three+%26%2334%3BC%26%2334%3B+s+of+chromosome+conformation+capture%3A+controls%2C+controls%2C+controls%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The three &#34;C&#34; s of chromosome conformation capture: controls, controls, controls.</a> Nature Methods. 3 (1), 17-21 (2006).</li>
<li>Hagège, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+chromosome+conformation+capture+assays+%283C-qPCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of chromosome conformation capture assays (3C-qPCR).</a> Nature Protocols. 2 (7), 1722-1733 (2007).</li>
<li>Lajoie, B. R., van Berkum, N. L., Sanyal, A., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((My5C%3A+Webtools+for+chromosome+conformation+capture+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">My5C: Webtools for chromosome conformation capture studies.</a> Nature Methods. 6 (10), 690-691 (2009).</li>
<li>Han, M., Wei, G., McManus, C. E., Hillier, L. W., Reinke, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+C.+elegans+germ+nuclei+exhibit+distinct+genomic+profiles+of+histone+modification+and+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Isolated C. elegans germ nuclei exhibit distinct genomic profiles of histone modification and gene expression.</a> BMC Genomics. 20 (1), 500(2019).</li>
</ol>

著者は利益相反を宣言しません。

3Cは、基本的な分子技術に根ざした強力な技術です。3Cを学部生で使用するのに非常に興味深い手法にしているのは、この基本的なツールの基盤です。近年、クロマチン動態をこのように広範囲に観測する研究が数多く行われているため、これらの結果を用いて、単一の遺伝子またはゲノム領域に関する焦点を絞った実験を考案することは、学部研究においてユニークで影響力のある実験を生み出す可能性を秘めています。多くの場合、このような実験は学部生には高度すぎると考えられていますが、慎重に計画すれば、簡単に達成できます。3Cライブラリによって捕捉されたクロマチン結合をプローブするように設計されたアッセイは、半定量的エンドポイントPCRから全ゲノムシーケンシングまでさまざまであることに注意することが重要です。実際、最初の3C論文16 からのデータはqPCRから生成された。この幅広いアッセイは、すべての3C技術が同じ製品(核内の3D結合を表すDNA断片のライブラリ)を生成するため、すべて使用できます。
ここに提示されるのは、学部生の研究者により適した、より柔軟で収容可能なプロトコルの適応です。上記の一時停止期間は、夜間の遅延を意味します。ただし、これらの一時停止は週末にまたがり、細胞や核の場合は数週間続く可能性があります。最も重要な考慮事項は、作業がいつ完了するかです。多くの場合、プロトコルでは、一時停止がオプションではない場合、時間に敏感な手順があります。いくつかのポイント(1日目と2日目)以外に、サンプルを停止して凍結する場所がたくさんあります。これらは、ラボ作業のスケジュールとタイミングを柔軟にする必要がある学部生と協力する場合に重要です。これらのストップをプロトコルにエンジニアリングすることに加えて、学部生はペアまたは3人または4人の小グループで作業することが奨励されています。このプロトコルでは、生徒がお互いをサポートし、バディシステムを作成して全員が安全に作業できるため、グループはうまく機能します。ラボワークも、他の人が関わるともっと楽しくなります。グループを使用すると、学生は同じプロトコルを実行しながら、クロマチンの構成に焦点を当てたさまざまな質問に取り組むこともできます。したがって、学生が別々のプロジェクトに取り組んでいる間でさえ、プロトコルは彼らの努力を結びつけます、そしてこれのために、彼らはお互いをサポートすることができます。
他の適応は、特定の特殊なツールや機器が必ずしもすべての学部機関にあるとは限らないという事実を回避することを目的としています。これらの機器には、qPCRサーモサイクラー、ゲルドキュメンテーションシステム、およびナノ体積分析計が含まれますが、これらに限定されません。確かに、これらの機器は便利ですが、必須ではありません。ここで、3Cの古典的な方法は、プライマー設計部分でも説明されています。これには、目的のゲノム遺伝子座を特定し、そこから、さらに離れたクロマチン接触点について他のゲノム遺伝子座を評価することが含まれます。この手法は、既知の陽性(接続)および負(非接続)遺伝子座が識別されるHi-Cを使用するデータセットなど、公開されたデータセットを使用する場合にもうまく機能します。これらの公開データセットを使用して実験を設計することは、クロマチン結合の同定が成功する可能性が通常高いため、教育ラボへのもう一つの大きな適応です。また、研究論文は授業で議論し、参考にすることができます。
このプロトコルは、修正qPCRアプローチを使用して、3C産物の形成を視覚化します。コントロールは、3C技術の成功に不可欠です。各実験では、サンプルコントロールとプライマーコントロールの両方を使用して、3C手順の完了を判断します。サンプルコントロールには、未消化コントロール(ゲノムDNA)および消化コントロールが含まれます。未消化コントロールは、プライマーセットのベースラインシグナルを決定し、消化効率を決定するために架橋消化コントロールとともに使用され、制限部位を横切るプライマーの生成物の低下が予想される。この値を未消化のコントロールと比較すると、サンプルがどれだけよく消化されたかがわかります。
PCR用のプライマーとしては、コントロールプライマーおよびテストプライマーが挙げられる。コントロールプライマーは、アッセイ対象のゲノム領域の近くにあり、制限部位を含まないプライマーセットです。これは、テストプライマーPCR産物の存在量を決定するためのベースラインを提供します。テストプライマーは、目的の特定のゲノム遺伝子座の制限部位に隣接するフォワードプライマーおよびリバースプライマーです(図3)。これらのプライマーセットを使用した反応を比較して消化効率を決定し、制限部位が切断された場合に生成物の存在量が低下するはずです。クロマチン組織を決定する際には、ある遺伝子座からの1つのテストプライマーを異なるゲノム遺伝子座からの別のテストプライマーとペアにして、これら2つの遺伝子座が3D空間で互いに近接しているかどうかを判断します。その場合、PCR産物は3Cサンプルをテンプレートとして使用してのみ見つかることが期待されます。
バリデーションされたプライマーでさえ失敗する傾向があることに注意することが重要です(図4:r14プライマーセット)。さらに、PCR産物は、対照反応およびクロマチン結合が予測されない反応(ライゲーションされていないため消化された対照など)で頻繁に同定されます。これらのインスタンスはシーケンスされ、サンガーQCに失敗するか、定義されたシーケンスなしで戻ります(図5)。さらに、従来の3C実験では、架橋、消化、ライゲーションされていないDNAサンプルである「コントロールテンプレート」が生成され、一定量のDNAで生成できるすべてのライゲーションフラグメントを表します。「コントロールテンプレート」は、2つのゲノム遺伝子座間でqPCRシグナルの強度を比較して、シグナルが真の相互作用を表すのか、それとも単なるランダムな関連を表すのかを判断する上で重要な役割を果たします。アッセイ対象のクロマチンの大部分を人工染色体の形で捕捉し、3Cサンプルと一緒に処理する必要があるため、「コントロールテンプレート」の作成には問題があります。そのような構造を確保することは実行不可能である可能性があり、それを作成することは学期プロジェクトの範囲外である可能性があります。これらの困難のため、コントロールプライマーの使用をお勧めします。コントロール入門書は、「コントロールテンプレート」のすべての機能を置き換えるものではありませんが、データを分析して「存在」または「不在」の判断を行う機会を提供します。
qPCRを行う場合は、等量のサンプルを使用することが重要です。これは、ナノドロップなどのナノ分光光度計を使用する場合でも、既知の濃度のゲノムDNAから標準曲線を生成し、3Cサンプルをその線に適合させることによって決定する必要があります。これらの金額は記録し、その後のPCRで使用する必要があります。PCR反応の質も重要です。PCRがqPCRで実行されると、生成物の存在量が蛍光を使用して測定され、記録されます。この記録は、増幅プロットでアクセスできます。プログラムが終了したら、増幅プロットをチェックし、反応(テンプレートなしコントロールを除く)にベースライン、指数、プラトー/飽和フェーズの3つのフェーズがあることを確認することが重要です。特に閾値を設定するために、反応が指数関数的位相を有することを確認することは重要である(下記参照)。さらに、連続希釈サンプルの場合、サンプルの希釈と一致するCt値のシフトが必要です(最高濃度は最も低いCt値を持ち、最も低い濃度は最高のCt値を持ちます)。増幅プロットにこの変化を反映していないサンプルは、新しい希釈を必要とするか、3Cサンプル形成に関するより大きな問題を示しています。最後に、検量線を生成する間、PCRソフトウェアはPCR効率とR2 値を計算します。PCR効率は90%より大きくなければならず、R2 値は0.99より大きくなければならない。これらの条件のいずれかが満たされない場合は、サンプルまたはPCRプライマーに問題がある可能性があります。
qPCR後、消化率および3C相互作用の存在は、各反応のqPCRを用いて計算することができる。これらを決定するには、まずPCR反応の閾値を設定する必要があります。これは通常、qPCRマシンに付属のソフトウェアを使用して行われます。閾値を設定すると、サンプルCt値の比較に使用されるPCR産物の濃度が定義されます。閾値は、増幅の指数関数的段階におけるPCR反応の増幅曲線を二等分する必要があります。指数関数的増幅を伴うPCR反応(この場合、コントロールプライマーとテストプライマー反応)のみが比較でき、これは反応が同じ速度でDNAを増幅し、忠実に比較できることを確認する唯一の方法であるためです。3Cグラフを分析すると、条件付き陽性反応は、対照サンプル、ゲノム制御、および消化制御よりも多くの生成物を有するものとして識別されます(図4B)。ただし、これらのサンプルは、PCR産物のゲル精製に続いてサンガーシーケンシングを使用してさらに検証する必要があります。
サンガーシーケンシング後、QCに合格したサンプルはBlatを使用して分析できます。この分析の目的は、サンプルが制限部位に隣接する両方の標的ゲノム遺伝子座(このプロトコルの場合はDpnII)の配列を持っているかどうかを判断することです。両方の配列が同定された場合、3Cフラグメントはバリデーション済みと見なすことができる。Blatの結果が期待される配列を返さない場合、これは一方または両方のプライマーが最適ではなく、偽陽性のqPCR結果をもたらすことを示している可能性があります。偽陽性サンプルのトレース ファイルには未定義のベース ピークがあり、Seq レポートにはほとんど "n" 個のベース コールが含まれます。
サンガーバリデーションは、人工PCR産物形成による偽陽性の可能性があるため、不可欠です。これらの偽陽性は、シーケンシング産物が期待される標的配列または適切な3Cフラグメントに特徴的なDpnII部位を持たない場合に特定できます(図5)。PCRフラグメントのシーケンシングは、実験のための別のデータポイントも提供し、3C技術が核内の3D空間に集まっている遠隔のゲノム遺伝子座を識別していることを学生に思い出させます。
3C技術は、柔軟で簡単な手順で学部生に豊富な基礎分子技術を提供します。この3C技術は、次世代シーケンシング(NGS)を組み込んだ他の3C技術の出発点でもあります。これらのタイプの実験は、学部生をバイオインフォマティクスの重要な側面にさらすことができ、ここで概説されている基本原則に根ざしています。学部での経験と関与は、若い科学者としての成功と発展の鍵です。これらの機会を提供することで、学部生は基本的な原則の理解を深めながら、最先端の技術や質問に取り組む自信を築くことができます。

生物のゲノムは、機能に必要なすべての遺伝子だけでなく、それらをいつどのように使用するかについてのすべての指示も保持しています。これにより、ゲノムへのアクセスを調節することは、細胞の最も重要な機能の1つになります。遺伝子機能を制御するメカニズムはたくさんあります。しかし、その基本レベルでは、遺伝子調節は、調節転写因子(トランス因子)がそれらの特定のDNA配列(シス調節配列)に結合する能力に帰着する。これは生来の能力ではありません。代わりに、核内のゲノムの構成/構造によって制御され、トランス因子1,2,3に対するシス調節配列の利用可能性/曝露を制御します。トランスファクターがシス調節配列を見つけることができない場合、トランスファクターは調節タスクを実行できません。これにより、ゲノムが核内でどのように構成されているかを理解することが重要な研究の源となっています。
間期には、核内の真核生物の染色体が核膜と核マトリックスに固定された独自のドメインを占めるため(図1)、染色体はスパゲッティの皿の上の麺ではなく、ピザのスライスのようになります。染色体は、染色体の部分をねじったりループしたりするタンパク質-DNA相互作用(クロマチン)によって部分的に凝縮されます。電子顕微鏡、三次元DNA蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)、およびDNAタグ付け技術(すなわち、蛍光および人工DNAメチル化)により、クロマチンの不活性ドメインは核周辺に沿って密集していることが見出されています4,5,6、一方、活性で凝縮性の低いクロマチンの一部は核の内部に見られます7,8,9、10.これらの実験は、染色体動態の広角図を提供するが、DNase11、12およびヌクレオソーム13、14、15の研究で観察された遺伝子前運動の周囲で局所的に起こる変化を捉えることはほとんどない。
より高解像度のクロマチン動態を解き放つ鍵は、3D染色体マッピング技術である3Cの定式化でした。3C技術自体は、クロマチンの架橋、制限酵素によるクロマチン消化、クロマチンライゲーション、DNA精製の4つの主要なステップで構成されています(図2)。次いで、このプロセスによって生成された新しい人工DNA断片を特徴づけて、直線的に離れたDNA断片間の密接な物理的関連を明らかにすることができる16。3C技術は、3Cの初期ステップを利用してより広いゲノム全体の質問をする複数のスピンオフ技術(Hi-C、4C、ChIP-Cなど)を作成するための基礎となりました。この3C技術ファミリーは、染色体がトポロジー関連ドメイン(TAD)と呼ばれる複数の個別の単位に編成されていることを特定しました。TADはゲノムにコードされており、ループのない境界に隣接するクロマチンループによって定義されます16、17、18、19。TAD境界は、CCCT結合因子(CTCF)と凝集力を含む2つの進化的に保存された遍在する因子によって維持され、別々のTAD内のループが相互作用するのを防ぎます16,20。ループは、トランスファクターとその調節配列との相互作用、ならびにCTCFおよび凝集力21によって媒介される。
3C技術を用いた多くの研究は、ゲノム全体の幅広い質問をし、複雑なサンプル収集技術を採用していますが、3C技術の定式化は基本的な分子生物学的手法に基づいています。これにより、3Cは学部の研究ラボと教育ラボの両方での展開に興味をそそられます。3C手法は、より小さな焦点を絞った質問に採用でき、質問の焦点と方向に応じて、スケールアップまたはスケールダウン(単一遺伝子22、染色体16、および/またはゲノム18)に本質的に柔軟です。この技術は、幅広いモデルシステム7、16、19、23にも適用されており、その使用において汎用性があることが証明されています。これにより、3Cは、学生が一般的な分子生物学技術の経験を積むと同時に、指示された質問に答える貴重な経験を積むことができるという点で、学部生にとって優れた技術になります。
ここに提示されるのは、以前に公開されたプロトコル24、25、26、27に基づく3Cライブラリ調製に適合したプロトコルである。このプロトコルは、約1×107細胞に最適化されていますが、わずか1×105細胞で3Cライブラリを生成しています。このプロトコルは汎用性が高いことが証明されており、ゼブラフィッシュ胚、ゼブラフィッシュ細胞株、および若年成人(YA)のカエノラブディティスエレガンス(回虫)から3Cライブラリを生成するために使用されています。このプロトコルは、哺乳類細胞株、およびさらに適応して酵母にも適切である必要があります。
これらの適応の目標は、学部生が3Cにアクセスしやすくすることです。学部の教育研究室で達成できるものと同様の技術を使用するように注意が払われています。3C技術は、学部生がベンチ、教室、および卒業後の努力において彼らの発達に役立つ基本的な分子生物学技術を学ぶための多くの学習機会を提供します。

<table><tbody><tr><td>37%ホルムアルデヒド&nbsp;</td><td>ミラポアシグマ</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>100% エタノール</td><td>ミラポアシグマ</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>MP バイオメディカル</td><td>215350280</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>ミラポアシグマ</td><td>C0549</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete、EDTA-フリー プロテアーゼ阻害剤カクテル</td><td>ミラポアシグマ</td><td>COEDTAF-RO</td> 水<td>に 50 倍に混合。ショ糖バッファーおよびGBバッファーで1倍に希釈し、新鮮な</td></tr><tr><td>ジチオスレイトール(DTT)</td><td>ミラポアシグマ</td><td>D0632</td><td>1 Mストックを500 &microに希釈しました。ショ糖バッファーおよびGBバッファー中のM 新鮮な</td></tr><tr><td>DpnII</td><td>NEB</td><td>R0543M</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>ミラポールシグマ</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>グリシン</td><td>ミラポールシグマ</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>グリコーゲン</td><td>ミラポアシグマ</td><td>10901393001</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>ミラポールシグマ</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>ミラポールシグマ</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Millapore-Sigma</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>メチルグリーンピロニン&nbsp;&nbsp;</td><td>ミラポア・シグマ</td><td>HT70116</td><td></td></tr><tr><td>MgAc<サブ>2</サブ></td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>1222530</td><td></td></tr><tr><td>Na<サブ>2</サブ>HPO<サブ>4</サブ></td><td>ミラポア・シグマ</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>ミラポア・シグマ</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>フェノール・クロロホルム&nbsp;</td><td>ミラポアシグマ</td><td>P3803</td><td></td></tr><tr><td>プロナーゼ</td><td>ミラポアシグマ</td><td>11459643001</td><td></td></tr><tr><td>プロテイナーゼ K</td><td>IBI サイエンティフィック</td><td>IB05406</td><td></td></tr><tr><td>qPCR レディミックス (Phire Taq etc)</td><td>ミラポアシグマ</td><td>KCQS07</td><td></td></tr><tr><td>RNase A&nbsp;</td><td>ミラポアシグマ</td><td>R6148</td><td></td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム</td><td>ミラポアシグマ</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)</td><td>ミラポアシグマ</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>ミラポアシグマ</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA リガーゼ</td><td>プロメガ</td><td>M1804</td><td></td></tr><tr><td>トリスHCl</td><td>ミラポアシグマ</td><td>108319</td><td></td></tr><tr><td>トリトンX-100</td><td>ミラポアシグマ</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>トリプシンEDTA&nbsp;</td><td>ミラポアシグマ</td><td>T4049</td><td></td></tr></tbody></table>

3cでaを取得する:学部生のための染色体コンフォメーションキャプチャ

Getting an A with the 3Cs: Chromosome Conformation Capture for Undergraduates

染色体コンフォメーションキャプチャ(3C)は、クロマチンの3次元構成の詳細な情報を提供する同様の技術(たとえば、Hi-C、4C、および5C、ここでは3C技術と呼びます)のファミリーを生み出した強力なツールです。3C技術は、がん細胞におけるクロマチン組織の変化のモニタリングから、遺伝子プロモーターとのエンハンサー接触の同定まで、幅広い研究で使用されています。これらの手法を用いた研究の多くは、複雑なサンプルタイプ(すなわち、シングルセル解析)でゲノム全体の大きな質問をしていますが、しばしば失われているのは、3C技術が幅広い研究に適用できる基本的な分子生物学的手法に基づいていることです。クロマチン構成の焦点を絞った質問に取り組むことにより、この最先端の手法を使用して、学部の研究と教育ラボの経験を向上させることができます。この論文は、3Cプロトコルを提示し、学部の研究および教育経験において主に学部機関で実施するための適応と強調点を提供します。

この手順では、1つの実験的3Cサンプルと2つの対照サンプル(未消化および消化)が生成されます。これら3つのサンプルを用いて、qPCRを実施した。これらの結果から、消化効率を算出し(式1)、記録した(表1)。これらの計算から、3Cサンプルは、テストされた7つのゲノム遺伝子座にわたって約88%の消化効率(表1の平均)を有すると決定された。
次に、遺伝子座特異的プライマー(表2)とqPCRの組み合わせを使用して、サンプルを異なるゲノム遺伝子座間の長距離クロマチン接触の存在についてテストしました。これらの結果を使用して、対照プライマーセットに対する生成物存在量を計算(式 2)し、比較のためにグラフ化しました(図4)。これらのデータは、10の反応のうち8つが長距離相互作用の条件付き陽性であることを示しました。
次に、PCR反応をアガロースゲル上で実行しました。8つの条件付き陽性反応と1つの陰性反応について予想されるPCR産物をゲル精製し、サンガーシーケンシングに送りました。代表的な陽性反応(青矢印、青ボックス)と陰性反応(赤矢印、赤ボックス)の結果を示します(図5)。
<img alt="タンパク質の折り畳み図;展開状態から折り畳まれた状態への構造変化を注釈付きで示します。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65213/65213fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 図1:核内の染色体構造。 核内の仮想的な染色体組織。(A)核エンベロープ、黒い線。(b)核ラミナ、オレンジ;(c)ヘテロクロマチン、圧縮系統;(D)ユークロマチン、ルーズループ。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65213/65213fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="染色体クロスオーバー図;遺伝子組換え、染色分体交換プロセスを示しています。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65213/65213fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 図2:3Cプロトコルの概略図。線状染色体の遠い部分(青、黄、ピンク)は、調節ループを介して核内で互いに接近します。(A)ループ構造は転写因子(灰色の円と黒い星)によって媒介されます。これらの相互作用は、化学的架橋によって維持されます。(B)ループは酵素消化によって切断されます(黒い線)。(C)離れたクロマチン片は、消化によって作られた固着端を通して一緒に結紮されます。(d)DNAがタンパク質から精製されている。(E)断片内の配列が同定され、ゲノムにマッピングされます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65213/65213fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="染色体図、DpnII部位、RepeatMaskerデータ、遺伝子マッピング、ゲノム配列解析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65213/65213fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 図3:3Cプライマースキーム。 3Cプライマーは、目的のゲノム位置からさまざまな距離にある制限部位を中心に設計されています。ピンク色の矢印は、DpnII部位を囲む実験用プライマーセットを表す。実験用プライマーを混合してマッチングさせ、その領域のクロマチンループを評価することができます。オレンジ色のプライマーは、DpnII部位を持たない陰性対照を表す。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65213/65213fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="未消化および消化されたgDNAサンプルのテストプライマーレベルを比較した棒グラフ、3C結果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65213/65213fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> 図4:3C実験の代表的なqPCRデータ。 3Cテストプライマーセットの相対的な存在量。(A)未消化コントロール(青)、消化コントロール(灰色)、および3Cサンプル(オレンジ)における生成物の相対存在量を示すコントロールグラフ。(b)前記3C実験;未消化コントロール(青)、消化コントロール(灰色)、および3Cサンプル(オレンジ)におけるテストプライマーの組み合わせからの生成物の相対存在量。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65213/65213fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="電気泳動とシーケンシングの結果。DNA断片分析;酵素消化;遺伝子研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65213/65213fig05.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> 図5:3C qPCR産物の可視化。 一番上に、示されたサンプルを含むqPCRエンドポイント製品でゲル化します。下段に、示された反応についての代表的なサンガー配列トレースファイル。オレンジ色のサンプルは偽陽性の例であり( 図4、 r38/34を参照)、青色のサンプルは、トレースの上にDpnII部位が示されている真陽性の例です。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65213/65213fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>敷地</td>
			<td>%消化</td>
		</tr><tr><td>R8</td>
			<td>86.98</td>
		</tr><tr><td>R3</td>
			<td>88.44</td>
		</tr><tr><td>R38</td>
			<td>89.64</td>
		</tr><tr><td>R34</td>
			<td>87.55</td>
		</tr><tr><td>R33</td>
			<td>87.85</td>
		</tr><tr><td>R14</td>
			<td>86.97</td>
		</tr><tr><td>R47</td>
			<td>89.45</td>
		</tr></tbody></table>表1:計算された消化効率。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>名前</td>
			<td colspan="3">順序</td>
			<td>ゲノム遺伝子座</td>
		</tr><tr><td>r3 FWD</td>
			<td colspan="3">ACGCAAGTAAAATTGGTTTTTGACC</td>
			<td>chrX:11361475</td>
		</tr><tr><td>r3 RVS</td>
			<td colspan="3">TTTCCTGAGCTCTTAACCATGTTTGC</td>
			<td>chrX:11361561</td>
		</tr><tr><td>r38 FWD</td>
			<td colspan="3">TTACTTCTGAAGTAATTTTTTTCCCC</td>
			<td>chrX:5859700</td>
		</tr><tr><td>r38 RVS</td>
			<td colspan="3">アガガグクガ</td>
			<td>chrX:5859775</td>
		</tr><tr><td>r34 FWD</td>
			<td colspan="3">ATTTGTGGATTGCGTGGAGAGAGG</td>
			<td>chrX:5429702</td>
		</tr><tr><td>r34 RVS</td>
			<td colspan="3">AATAATCCTCTTAACAAACGTGGCC</td>
			<td>chrX:5429777</td>
		</tr><tr><td>r33 FWD</td>
			<td colspan="3">AAGAGTTGTCCAAAATAAATTGAGCTAAC</td>
			<td>chrX:6296704</td>
		</tr><tr><td>r33 RVS</td>
			<td colspan="3">TTCAGAAAAGTAAACTTTGACTTGGAACG</td>
			<td>chrX:6296807</td>
		</tr><tr><td>r14 FWD</td>
			<td colspan="3">AATTATCGATTTTTCCATCGCGCAG</td>
			<td>chrX:8036367</td>
		</tr><tr><td>r14 RVS</td>
			<td colspan="3">ATTTCAATGAAAATGTAAAATTCCTTCTCTCTCTCT</td>
			<td>chrX:8036427</td>
		</tr><tr><td>r47 FWD</td>
			<td colspan="3">ATCTAGACTTGATAATATTGTGTGTCCTC</td>
			<td>chrX:9464939</td>
		</tr><tr><td>r47 RVS</td>
			<td colspan="3">AAGTTCTGCAACTGTTAGATGAATAACAC</td>
			<td>chrX:9465064</td>
		</tr><tr><td>r8 FWD</td>
			<td colspan="3">GAGAATGTGTGTGTGTTAACTGAAAACTTG</td>
			<td>chrX:11094257</td>
		</tr><tr><td>r8 RVS</td>
			<td colspan="3">TTACGAAATTTGGTTTTGGACC</td>
			<td>chrX:11094362</td>
		</tr><tr><td>コントロールプライマーFWD</td>
			<td colspan="3">CAATCGTCTCGCTCACTTGTC</td>
			<td>chrX:7608049</td>
		</tr><tr><td>コントロールプライマー RVS</td>
			<td colspan="3">GATGTGAGCACAAGGCACC</td>
			<td>chrX:7608166</td>
		</tr></tbody></table>表2:代表的な3C実験のためのプライマー。

ここでは、染色体立体構造捕捉(3C)技術の適応を、学部生の関与と学習に重点を置いて詳細に紹介します。

3CでAを取得する:学部生のための染色体コンフォメーションキャプチャ

Chromosome conformation capture (3C) is a powerful tool that has spawned a family of similar techniques (e.g., Hi-C, 4C, and 5C, referred to here as 3C ...

私たちの研究は、クロマチン構成が遺伝子発現をどのように制御しているかを明らかにすることを目的としています。焦点は、遺伝子活性を制御するために遺伝子レベルでクロマチンを調節する因子を決定することにあります。現在、染色体確認捕捉(3C)と同様の技術がこの分野で進歩を遂げるために使用されています。サンプル収集およびシーケンシング技術への投資は、3C技術が私たちに示してくれるものを押し上げました。現在の最大の実験課題は、均一なクロマチン構造を持つサンプルを収集することです。サンプルの不均一性は、交絡結果につながります。将来的には、クロマチン構成の変化ががんでどのように役割を果たすかに焦点を当てる予定です。

getting-an-with-3cs-chromosome-conformation-capture-for

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

のHi - Cのメソッドは、クロマチンの相互作用（1）の公平な、ゲノムワイドな同定が可能になります。のHi -...

ハイC：ゲノムの三次元構造を研究する方法。

Chromosomics：同時に新規OctoChrome FISHアッセイを使用した全24ヒト染色体における数値と構造変化の検出

この作品は、高解像度その場でハイ C...

しっかりと段階的な初期のショウジョウバエの胚からゲノムワイドなクロマチン構造キャプチャ ライブラリの生成

遺伝子発現制御に重要な役割を果たしているクロマチンのループただし、クロマチンのループの選択的かつ可逆的な変更を可能にする技術の進歩はいません。ここでクロマチンのループの再編成のための強力なシステムを記述対象遺伝子座に CRISPR dCas9 (CLOuD9)...

クロマチンのループ構造の再編を CRISPR 媒介

遺伝子および調節配列の物理的な相互作用の同定が困難な染色体構造をキャプチャする方法によって促進されています。これは 4 C seq プロトコルを修正は PCR テンプレートが過大に増幅を最小限に抑えることによって PCR バイアスを軽減、追加制限の酵素のダイジェスト ステップを組み込むことによって読み取りの mappability...

円の染色体構造の次世代シーケンシングによる遺伝子制御配列の高スループット識別キャプチャ (4 C seq)

我々は、胚性幹細胞から生成された胚体における高スループットシーケンシングに続く定量染色体立体構造捕捉の適用を報告する。この技術は、胚性幹細胞分化中に所定の遺伝子の推定エンハンサーとプロモーター領域との接触を同定し、定量することを可能にする。...

定量染色体立体構造捕捉による胚体におけるエンハンサー・プロモーター接触の同定(4C)

長さスケール全体で染色体コンフォメーションをキャプチャする

このプロトコルは、トポロジー的会合ドメイン(TAD)の境界や、調節と他のDNA配列要素との間の長距離クロマチン相互作用など、メガベースサイズの標的ゲノム領域の3D組織を高解像度で特徴付けるために使用されるCapture Hi-C法について説明しています。...

キャプチャHi-C による 高分解能3Dクロマチン構成の解読

ここでは、メチルDNA結合キャプチャシーケンシング（MBDCap-seqのかMBD-seqの）技術とその後のバイオインフォマティクス解析パイプラインを使用して大規模な臨床患者スクリーニング研究におけるゲノムワイドDNAメチル化を調査するためのプロトコルを提示します。...

患者の組織のためのメチル結合DNA捕捉シーケンシング

遺伝子破壊ミュータンス連鎖球菌の世代の簡易・迅速かつ比較的安価な手法について述べる株;この手法は、様々...

遺伝子破壊ミュータンス連鎖球菌緊張せず遺伝子クローニングの生成

学ぶ染色体コンフォメーションキャプチャ（3C）法によるクロマチン構造解析と遺伝子発現制御のメカニズム。C. elegansを用いた実験操作で学部生も研究に参加できる詳細なプロトコルを提供します。

3CでAを取得する:学部生のための染色体コンフォメーションキャプチャ

さらに動画を探す