Name: 幼若マウスにおける慢性四尾行記録のための軽量駆動インプラント (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 34 s
Description: 学ぶ軽量マイクロドライブを用いた幼若マウスの慢性四尾行記録法。脳ネットワークの発達と神経発達障害のメカニズム解明に貢献し、最大16の両側性脳領域から同時記録が可能です。

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この研究は、国立衛生研究所R01 NS104829(B.E.P.)、R01 MH117149(L.J.V.)、F99NS12053(L.D.Q.)、およびUT Southwest GSO Endowment Award(R.J.P. および L.D.Q.)の支援を受けました。著者らは、技術支援を提供してくれたJenny Scaria(テキサス工科大学健康科学センター薬学部)と方法論的提案をしてくれたブレンドン・ワトソン博士(ミシガン大学)に感謝している。

若年マウスの日常神経活動を記録するためのマイクロドライブインプラント

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<li>Voigts, J., Siegle, J., Pritchett, D. L., Moore, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+flexDrive%3A+An+ultra-light+implant+for+optical+control+and+highly+parallel+chronic+recording+of+neuronal+ensembles+in+freely+moving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Systems+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The flexDrive: An ultra-light implant for optical control and highly parallel chronic recording of neuronal ensembles in freely moving mice.</a> Frontiers in Systems Neuroscience. 7, 8(2013).</li>
<li>Voigts, J., Newman, J. P., Wilson, M. A., Harnett, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+easy-to-assemble%2C+robust%2C+and+lightweight+drive+implant+for+chronic+tetrode+recordings+in+freely+moving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neural+Engineering%22%5BJournal%5D)">An easy-to-assemble, robust, and lightweight drive implant for chronic tetrode recordings in freely moving animals.</a> Journal of Neural Engineering. 17 (2), 026044(2020).</li>
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<li>Yamamoto, J., Wilson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+chronically+implantable+precision+motorized+microdrive+array+for+freely+behaving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Large-scale chronically implantable precision motorized microdrive array for freely behaving animals.</a> Journal of Neurophysiology. 100 (4), 2430-2440 (2008).</li>
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</ol>

著者は開示するものは何もありません。

げっ歯類のin vivo神経回路機能を探索する現代の実験では、個々のニューロン(すなわち、単一ユニット)または局所集団(局所電界電位、LFPを介して)の活動を監視するために、永久に埋め込まれた電極を介した細胞外電気生理学を利用することが多いが、そのような方法は技術的な課題のために幼若マウスに適用されることはめったにない。この原稿は、p20からp60以降の発達的に重要なウィンドウにわたってマウスのin vivo電気生理学的記録を取得する方法を説明しています。この方法論には、マイクロドライブインプラントの印刷と構築のための製造プロセス、外科的移植手順、および術後の回復戦略が含まれ、これらはすべて幼若マウスでの使用に特化しています。このプロトコルの開発には、成体マウスと比較して幼若マウスのサイズが小さく相対的に弱いこと、マイクロドライブを取り付ける必要のある幼若マウスの頭蓋骨の骨化の減少など、いくつかの考慮事項が影響しました。
in vivo電気生理学を行うために一般的に使用される2つの主要な方法は、電極のアレイ(例えば、四極管)およびシリコンプローブである。シリコンプローブは軽量であり、単位重量当たり多数の記録部位を提供することができ、そして幼若ラットにおいて以前に利用されてきた25。ただし、シリコンプローブはユニットあたり比較的高価です。対照的に、この原稿に記載されているマイクロドライブは、50米ドル未満の原材料を使用して構築できるため、in vivo記録の費用効果の高いオプションになります。さらに、シリコンプローブは固定線に埋め込む必要があることが多く、空間的に多様な脳領域の記録が禁止されています。対照的に、この原稿で説明されているマイクロドライブの設計は、独立して調整可能な四極管を利用して、最大16の異なる場所での同時記録に対応し、それらの場所間の空間的関係を実質的に制限しません。このマイクロドライブの設計は、カニューレ穴の押し出しを任意の前方/後方および内側/遠位の位置に移動することにより、ここで説明したものとは異なる場所をターゲットにできるように簡単に変更できます。別の脳領域をターゲットにする場合、四極管はしばしば直進しますが、これらの細いワイヤーはマイクロドライブカニューレを出るときにわずかにたわむ可能性があることに注意することが重要です。したがって、脳領域が小さくなったり腹側が多いほど、テトロードでその領域をうまく標的にすることはより困難になります。
この原稿に記載されているマイクロドライブインプラントは、個々のテトロードがネジに取り付けられ、各テトロードの記録深さの微調整を可能にするという点で、いくつかの以前のテトロードベースのマイクロドライブ設計23、32、33、34、35と基本的に類似している。現在のマイクロドライブ設計のいくつかの特徴は、空間的に分布した脳領域を標的にすることの容易さなど、独特ですが、現在の原稿の主な目新しさは、外科的移植と術後の回復戦略の説明であり、これにより、まだ発達中の幼若マウスのネットワーク活動の慢性的な研究が可能になります。実際、ここで説明する手術と回復の方法論は、幼若マウスの他のインプラントをサポートするように適応させることができます。
複数日にわたって一貫した記録を維持するには、ワイヤーまたはプローブを頭蓋骨にしっかりと固定する必要があります。マウスの頭蓋骨の全体的な構造はp20以降わずかな変化しか受けませんが、頭蓋骨はp20からp4536歳の間にかなり厚くなります。実際、p20の頭蓋骨は、損傷することなく取り付けられたインプラントを支えるには剛性が不十分です。この生物学的限界を克服するために、このプロトコルは、移植手術中にシアノアクリレート を介して 頭蓋骨を人工的に厚くします。この戦略を用いてp20より若いマウスへの移植は可能である可能性が高いが、マウスの頭蓋骨はおよそp2036までかなりの大きさおよび形状の変化を受ける。したがって、まだ発達中の頭蓋骨のシアノアクリレートと固定骨スクリューは、頭蓋骨の自然な成長とその下にある脳組織の発達に大きな影響を与える可能性があるため、p20未満のマウスに長期間移植することは推奨されません。重要なことに、この研究では、p20から始まる慢性移植後に頭蓋骨または脳サイズの全体的な測定値への影響は観察されませんでした(図5C)。
この原稿に記載されている方法の重要なステップは、手術後の回復戦略です。この戦略によれば、マウスが成熟し、筋肉および筋骨格系の発達を経るにつれて、インプラントの重量は継続的に相殺されるべきである。着床直後、マウスはカウンターバランスなしではインプラントの重量にうまく耐えることができず、マウスがケージ内の食物や水源に適切に到達できないため、栄養失調や脱水症につながります。カウンターバランスシステムは、構築が簡単で安価で、実装が簡単で、あらゆる移植可能な年齢のマウスがホームケージ全体を自由に探索できるため、十分な栄養と水分補給が保証されます。マウスが年をとるにつれて、相殺の量は、成体マウスで完全に除去できるようになるまで減らすことができます。ただし、実験期間中は、少なくとも公称カウンターウェイトを常に取り付けて、カウンターバランスシステムを継続して使用することをお勧めします。成体マウスは時間の経過とともにマイクロドライブのサイズと重量に耐えることができるかもしれませんが、カウンターウェイトを改善しない自由な行動中に自然な動きを続けると、マイクロドライブを頭蓋骨に固定する骨ネジにトルクとせん断力が発生し、特に長時間の慢性実験中に切断される可能性が高まります。
現在の研究では、2つの重要な制限が注目に値します。まず、p20での移植が頭蓋骨と脳の発達に与える影響を評価するために、マウスのいくつかのコホートを長期移植後に屠殺しました(図5C)。これらの解析では、頭蓋骨腔のサイズや脳の質量に対する移植の有意な影響は示されていませんでしたが(図5C)、現在の研究では、p20-p60の初期発達期間を通じて複数の時点で頭蓋骨のサイズや脳質量を調べていませんでした。以前の研究では、脳腔の発達がp2036までに完了することが示されていますが、この初期のウィンドウでの移植は、ここで評価された成人年齢によって修正または補償される予期しない変化をもたらす可能性があります。第二に、図3および図4に示す電気生理学的データを生成した実験は、細胞収量を最大化するように設計されていなかった。したがって、ここに示すデータは、安定した慢性的な記録と十分に絶縁された単一ユニットを示していますが、このデバイスの最大潜在的収量を表すものと見なすべきではありません。
多くの人間の神経学的および精神医学的障害は、自閉症および統合失調症を含む、初期の発達期または青年期に現れる。しかし、利用可能なマウスモデルが多数あるにもかかわらず、これらの疾患の根底にある可能性のある回路レベルの機能障害についてはほとんど知られていません。これらの初期のネットワークの変化を特定することは、早期発見戦略と治療パラダイムを作成するために重要です。しかし、技術的な課題により、神経精神疾患のマウスモデルの開発全体でネットワーク機能がどのように破壊されるかは不明です。ここで説明するマイクロドライブと回復戦略は、マウス脳における多領域脳ネットワーク発達の調査をサポートするように設計されており、したがって、研究者は健康な脳の発達を測定し、マウスの疾患モデルにおけるその発達の変化を特定できます。

脳は、小児期および青年期の重要な発達ウィンドウの間に大規模な変化を経験します1,2,3。自閉症や統合失調症を含む多くの神経疾患や精神疾患は、若年期および青年期の脳発達のこの期間中に行動的および生物学的に最初に現れます4,5,6。発生初期に起こる細胞、シナプス、および遺伝的変化については多くのことが知られていますが、この時間枠全体で回路レベルまたはネットワークレベルのプロセスがどのように変化するかについてはほとんど知られていません。重要なことに、最終的に複雑な行動、記憶、認知の根底にある回路レベルの脳機能は、細胞およびシナプス機能の予測不可能な創発的な特性です7,8,9,10。したがって、ネットワークレベルの脳機能を完全に理解するためには、無傷の神経回路のレベルで神経活動を直接研究する必要があります。さらに、神経精神疾患の進行を通じて脳活動がどのように変化するかを特定するには、疾患の行動表現型が現れる特定の時間ウィンドウ中に有効な疾患モデルでネットワーク活動を調べ、成人期まで持続する観察された変化を追跡することが重要です。
最も一般的で強力な科学的モデル生物の1つはマウスであり、行動および/またはニーモニック表現型の年齢依存的な発症を伴う神経発達障害をモデル化する多数のユニークな遺伝子株を有する11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 .ヒトとマウスの脳間の正確な発生時点を相関させることは困難であるが、形態学的および行動学的比較は、p20-p21マウスが2〜3歳のヒト年齢を表し、p25-p35マウスが11〜14歳のヒト年齢を表し、マウスがp603までにヒト20歳の成人の発達に相当するものに達する可能性が高いことを示している。22.したがって、若年脳がどのように発達するかをよりよく理解し、自閉症や統合失調症などの疾患で脳の神経ネットワークがどのように機能不全になるかを特定するには、20日から60日齢のマウスのin vivoで脳活動を直接監視することが理想的です。
しかし、マウスの初期発生における脳活動を監視する上での基本的な課題は、幼若マウスのサイズが小さく、相対的に弱いことです。脳発達の縦断的研究に必要な電極の慢性的な移植は、典型的には、微細な電極ワイヤおよびインターフェースボード23,24を保護するために大きくてかさばるハウジングを必要とし、インプラントはマウス頭蓋骨にしっかりと取り付けられていなければならず、これは骨化の減少のために若いマウスではより薄くそして剛性が低い。したがって、in vivoげっ歯類生理学の事実上すべての研究は、それらの相対的なサイズ、強度、および頭蓋骨の厚さのために成人被験者で行われてきました。今日まで、in vivo幼若げっ歯類脳生理学を探索するほとんどの研究は、野生型幼若ラットで行われており、これは、ヒト障害の自由に行動するモデルにおいて幼若脳機能を実験的にモニターする能力を必然的に制限している25,26,27,28,29,30。
この原稿では、発達上重要な時間枠(p20からp60以降)にわたる幼若マウスの長期(最大4週間以上) のin vivo 脳機能を慢性的に研究するための新しいインプラントハウジング、外科的移植手順、および術後の回復戦略について説明しています。移植手順は、幼若マウスの頭蓋骨への電極の信頼性の高い恒久的な固定を可能にする。さらに、このマイクロドライブは完全に組み立てられたときの重量が~4-6gであり、インプラントの重量を相殺するために必要な最小限のカウンターバランスのために、典型的な行動パラダイム中の幼若マウスの行動性能に影響を与えないため、マイクロドライブの設計は軽量です。

<table><tbody><tr><td>10 VビデオトラッキングLED</td><td>Neuralynx</td><td>HS-LED-Red/Green-omni-10V</td><td>ヘッドステージプリアンプと併用 LEDソケットを含むヘッドステージプリアンプ 動きトラッキング用</td></tr><tr><td>16TT EIBボード</td><td>Neuralynx</td><td>EIB-36-16TT</td><td>電子インターフェースボード - オムネティクスコネクタ</td></tr><tr><td>16TTヘッドステージプリアンプ</td><td>Neuralynx</td><td>HS-36-LED</td><td>Omnetics 44ソケット信号増幅器は、EIBボードとテザーケーブルの間にあり、録音アプリケーションに適しています。ヘッドステージ用コネクタを含む 動き追跡用LED</td></tr>用 <tr><td>Baby-Mixter 止血</td>剤 <td>FST</td><td>13013-14</td><td>細かい湾曲止血器</td></tr><tr><td>ボーンアンカースクリュー</td><td>ストールティング</td><td>51457</td><td>EIBボードをメインドライブ本体に取り付けるために使用</td></tr><tr><td>Burpenorphine</td><td>ZooPharm</td><td>Lot #BERLAB0.5-221207</td><td>Burpenorphine (0.5 mg/mL) 5mL</td></tr><tr><td>個 ケーブルテザー</td><td>Neuralynx</td><td>HS-36 Litzテザー</td><td>オムネティクスヘッドステージ用の軽量シールドワイヤーテザー、長さオプション 1 m/2 m/3 m/5 m</td></tr><tr><td>カルプロフェン/リマディル</td><td>バイオサーブ</td><td>MD150-2</td><td>術後抗炎症剤</td></tr><tr><td>透明樹脂 v4</td><td>Formlabs</td><td>FLGPGR04</td><td>3Dプリントプロセス中に3Dプリンタで光重合する液体樹脂</td></tr><tr><td>カスタム(シャトル)スクリュー</td><td>Advanced Machining and Tooling, Inc.</td><td>カスタム</td><td>機械加工およびねじ込みカスタムネジ</td></tr><tr><td>歯科用アクリル液体部品</td><td>ティーツ義歯材料</td><td>ロット#329801</td><td>液体&nbsp;義歯材料の成分(上記参照)</td></tr><tr><td>歯科用アクリル粉末部品</td><td>ティーツ義歯材料</td><td>ロット#583987</td><td>「冷間硬化」義歯材料、メタクリル酸メチル;所定の位置に</td></tr><tr><td>記録装置を固定するためのアプリケーションのための液体成分と混合DietGel Boost</td><td>ClearH2O</td><td>72-04-5022</td><td>若年/回復中のマウスのための高カロリー栄養補助食品</td></tr><tr><td>Digital Lynx 16SX</td><td>Neuralynx</td><td>DigitalLynx 16SX Base</td><td>最大512の記録チャンネル用の16コンボボードスロットを備えたメイン録音装置</td></tr><tr><td>Dissectorはさみ-重いブレード</td><td>FST</td><td>14082-09</td><td>さまざまな</td></tr><tr><td>デュモン#5セラミックコーティング鉗子</td><td>FST</td><td>11252-50</td><td>四極管の取り扱い/ねじ切り/ピン留め</td></tr><tr><td>デュモン #5SF 鉗子</td><td>FST</td><td>11252-00</td><td>多目的組立使用</td></tr><tr><td>デュモン #5SF 鉗子</td><td>FST</td><td>11252-00</td><td>多目的外科用</td></tr><tr><td>デュモン #7 細かい鉗子(湾曲)</td><td>FST</td><td>11274-20</td><td>各種</td></tr><tr><td>デュモン #7 細かい鉗子(湾曲)</td><td>FST</td><td>11274-20</td><td>多目的外科用</td></tr><tr><td>EIB-36メッキアダプター</td><td>ニューラリンクス</td><td>EIB-36 メッキアダプター</td><td>メッキ・組立使用</td></tr><tr><td>EIB-36 メッキアダプター</td><td>ニューラリンクス</td><td>EIB-36 メッキアダプター</td><td>手術中に頭蓋骨にドライブを下げるための定位アクセサリー</td></tr><tr><td>ユータソル</td><td>・ヴィルバック</td><td>710101</td><td>安楽死のためのペントバルビタールナトリウム</td></tr><tr><td>極細ボンハサミ</td><td>FST</td><td>14083-38</td><td></td></tr><tr><td>各種 極細グレーフ鉗子</td><td>FST</td><td>11150-10</td><td>小さなまっすぐな鋸歯状の鉗子</td></tr><tr><td>極細のブドウ鉗子</td><td>FST</td><td>11150-10</td><td>小さなまっすぐな鋸歯状の鉗子</td></tr><tr><td>細かい止血剤</td><td>FST</td><td>13006-12</td><td>細かい止血剤</td></tr><tr><td>細かいハサミ- CeramaCut</td><td>FST</td><td>14958-09</td><td>四極管切断</td></tr><tr><td>細かいハサミ - ToughCut</td><td>FST</td><td>14058-09</td><td>各種</td></tr><tr><td>Form 3+</td><td>Formlabs</td><td>PKG-F3-P-WS-SVC-BASIC</td><td>3Dプリンタ for fabrication of all printed parts/materials; Low-force stereolithography 3D printer (LFS)</td></tr><tr><td>Gel super glue</td><td>Loctite</td><td>1363589</td><td>Various steps</td></tr><tr><td>Graefe 鉗子</td><td>FST</td><td>11049-10</td><td>Small angled serated sersps</td></tr><tr><td>Ground wire</td><td>A-M Systems</td><td>Lot# 582335</td><td>ステンレス鋼の裸線、.005インチ直径、焼きなまし、100フィート</td></tr><tr><td>毛除去ジェル</td><td>ジェネリック</td><td>市販</td><td>マウスヘッドの上部からの毛の術前除去用</td></tr><tr><td>ヒートガン</td><td>Dewalt</td><td>D26960K</td><td>四極管融合 紡績後の</td></tr>高温<tr><td>焼灼キット</td><td>FST</td><td>18010-00</td><td>該当する場合、骨ワックスと一緒に使用</td></tr><tr><td>ホットビーズ滅菌器</td><td>FST</td><td>18000-45</td><td>外科手術中のアドホック機器滅菌のための電気滅菌装置</td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>コベトラス</td><td>11695067771</td><td>イソフルラン気化器で使用するための標準的なイソフルラン液体麻酔 最大5%</td></tr><tr><td>イソプロピルアルコール 91%</td><td>ジェネリック</td><td>市販</td><td>標準的な術前滅菌手順用</td></tr><tr><td>ジュエリースクリュー(少年マウス用骨スクリュー)</td><td>部品供給株式会社</td><td>MX-000120-02SFL</td><td>S / S小ネジ#000-120 x 1/8 ''フィリスターヘッド、スロット付きドライブ</td></tr><tr><td>LaGrangeはさみ</td><td>FST</td><td>14173-12</td><td>さまざまな</td></tr><tr><td>大型ポリイミドチューブノード</td><td>ソン医療</td><td>ロット#13564</td><td>ポリイミドチューブ-内径0.0071 ";外径0.0115 ";長さ36 "</td></tr><tr><td>液体瞬間接着剤</td><td>ロックタイト</td><td>1365882</td><td>さまざまなステップ</td></tr><tr><td>マイクロドリル</td><td>Foredom</td><td>K.1070</td><td>K.1070高速回転マイクロモーターキット;コントロールボックス、3/32インチコレット、可変速フットコントロール、ハンドピースクレードル付き;定位的にフィット;100&ndash;115 Vは</td></tr><tr><td>マイクロドリルバリ(0.5 mm +)</td><td>FST</td><td>19007-05/07/09</td>開<td>頭</td></tr>術<tr><td>鉱物油</td><td>シグマ</td><td>Pcode 1002076577を使用します。M5904-500mL</td><td>さまざまなステップ</td></tr><tr><td>鉱物油</td><td>シグマ</td><td>Pcode 1002076577;M5904-500mL</td><td>開頭穴を開けたまま使用するための</td></tr><tr><td>小型マイナスドライバー</td><td>FST</td><td>30051-10</td><td>骨ネジの挿入/締め付け</td></tr><tr><td>ネオスポリン トリプル 抗生物質軟膏</td><td>ジョンソン&ジョンソン</td><td></td><td>512373700抗生物質軟膏</td></tr><tr><td>オムネティクス 44ソケット ナノコネクタ</td><td>ニューラリンクス</td><td>ニューラリンクスパート #A70427-801</td><td>非標準 アイテム - オムネティクス 44ソケット(メス) 2つのガイドピン付き 2列ストレートレッグナノコネクタ カスタムメイドのカウンターバランス装置で使用するための(オス)</td></tr><tr><td>プラチナ10%イリジウムワイヤー</td><td>カリフォルニアファイン</td><td>ワイヤーMO#M374710</td><td>テレードアセンブリステーションとスピナー2.0(下記参照)を使用して、記録中に使用するために四極管に紡がれた細い記録ワイヤー。HML NATRL VGボンドコート;サイズ .0007 X 200FT</td></tr><tr><td>プラチナ ブラック メッキ 溶液</td><td>Neuralynx</td><td>プラチナ ブラック メッキ</td><td></td></tr><tr><td>ポリカーボネート製 ケージの底</td>部 <td>トーマス・サイエンティフィック/メリーランド州のプラスチック</td><td>1113M35; mfr. No. E0270</td><td>標準ケージの底部; 上部に金網装置を装着可能 移植されていないマウス用のチャウ+ウォーターボトルを含む</td></tr><tr><td>ポリカーボネート製ケージトップ N10 マイクロフィルター</td><td>付き Ancare</td><td>N/A</td><td>標準的なケージトップは、カウンターバランス装置</td></tr><tr><td>Povidoneヨウ素10%</td>ジェ<td>ネリック</td><td></td>市販の<td>標準的な術前滅菌手順のために</td></tr><tr><td>PVCパイプ</td>シャー<td>ロットパイプシャーロットパイプ</td><td>N / A</td><td>1/2 "×600 PSIスケジュール40白いPVCパイプ;マウスの回復中にカウンターバランス装置に使用/組み立てのために</td></tr>メス<tr><td>の刃- #4</td><td>FST</td><td>10060-00</td><td>切開</td></tr><tr><td>メスのハンドルを使用 - #4 肉眼解剖学</td><td>FST</td><td>10060-13</td><td>切開使用</td></tr><tr><td>自己保持ピンと骨ねじ鉗子</td><td>FST</td><td>26100-00</td><td>頭蓋骨に挿入しながら骨と接地ねじ用のホルダー</td></tr><tr><td>小さなEIBピン</td><td>神経リンクス</td><td>小さなEIBピン</td><td>EIBボードへの四極管の取り付け</td></tr><tr><td>小さなポリイミドチューブ</td><td>ノードソン医療</td><td>ロット#19102423</td><td>ポリイミドチューブ - 内径0.004インチ;外径0.0044インチ;長さ 36インチ</td></tr> <tr><td>SolidWorks</td><td>ダッソー・システムズ</td><td></td><td>マイクロドライブ設計用SolidWorks 3D CADプログラム</td></tr><tr><td>へらとプローブ</td><td>FST</td><td>1090-13</td><td>ワセリン/鉱物油用アプリケーター+アドホック四極管矯正用オプション使用</td></tr><tr><td>スプリングハサミ - 8mm</td><td>FST</td><td>15024-10</td><td>頭蓋組織切開用ハサミ</td></tr><tr><td>スプリングハサミ - 8mm</td><td>FST</td><td>15024-10</td><td>初期切開</td></tr><tr><td>標準パターン鉗子</td><td>FST</td><td>11000-12</td><td>大型鋸歯状鉗子</td></tr><tr><td>外科用ハサミ-鋭く鈍い</td><td>FST</td><td>14001-12</td><td>各種</td></tr><tr><td>外科用ハサミ-タフカット</td><td>FST</td><td>14054-13</td><td>各種</td></tr><tr><td>四極管組立ステーション</td><td>ニューラリンクス</td><td>四極管組立ステーション</td><td>テトロード</td></tr><tr><td>組立 テロードスピナー 2.0</td><td>Neuralynx</td><td>四極管スピナー 2.0</td><td>四極管アセンブリ</td></tr><tr><td>2 液性エポキシ</td><td>ゴリラ ブランド</td><td>4200102</td><td>さまざまなステップ</td></tr></tbody></table>

幼若マウスにおける慢性四尾行記録のための軽量駆動インプラント

A Lightweight Drive Implant for Chronic Tetrode Recordings in Juvenile Mice

in vivo 電気生理学は、無傷の脳のサブセカンドレベルの回路ダイナミクスに関する比類のない洞察を提供し、ヒト神経精神障害のマウスモデルを研究する上で特に重要な方法を表しています。しかし、そのような方法は、しばしば大きな頭蓋インプラントを必要とし、初期の発達時点でマウスには使用できません。そのため、自由に行動する乳児または幼若マウスでは、この重要なウィンドウで神経学的発達をよりよく理解することで、自閉症や統合失調症などの加齢依存性発達障害に関する独自の洞察が得られる可能性が高いにもかかわらず、 in vivo 生理学の研究は事実上行われていません。ここでは、マイクロドライブ設計、外科的移植手順、および術後の回復戦略について説明し、マウスが生後20日目(p20)から生後60日目(p60)以降、2歳から成人期までの人間の年齢にほぼ対応する時間枠で、複数の脳領域からの慢性フィールドおよび単一ユニットの記録を同時に可能にします。記録電極と最終記録部位の数は簡単に変更および拡張できるため、発生全体にわたる行動または疾患に関連する脳領域の in vivo モニタリングの柔軟な実験制御が可能になります。

上記のプロトコルは、マウスにおいて複数の脳領域からの局所電界電位信号および単一単位を同時に記録するために使用され、p20からp60までの同じマウスにおいて毎日の記録が行われた。ここで報告されているのは、2匹のマウスからの代表的な電気生理学的記録と、最終的な記録場所を示す実験後の組織学です。
p20マウスへのマイクロドライブの外科的移植 マイクロドライブ(図1)を構築し(図2)、上記のようにp20マウスに外科的に移植した。手術の直後に、マウスをカウンターバランスシステム(図2G−I)に取り付け、回復させた。マウスが完全に可動になると、マイクロドライブを in vivo 電気生理学記録システムに接続しました。マイクロドライブと記録機器を接続するケーブルは、マウスの上に吊り下げられました。電気生理学的記録(32kHz)は、マウスがホームケージ内で自然に行動している間に、すべてのチャネルで1時間取得されました。記録後、マウスは記録システムからプラグを抜かれ、カウンターバランスシステムに再び取り付けられ、水とチャウチャウに自由にアクセスできる状態でビバリウムに戻されました。
神経活動の毎日の記録 電気生理学的記録を数週間毎日取得して、p20-p60の重要な発達ウィンドウ全体で同じ脳領域の慢性モニタリングを可能にしました。慢性記録全体からのサンプル生の局所電界電位(LFP)を 図3A、Cに示します。単離された単一ユニットは、複数のテトロードから同時に得られた(図3B)。類似した波形を持つユニットが複数の日にわたって識別されましたが(図3B、中央および右)、記録電極の電位ドリフトのため、同じユニットが日にわたって識別されていると明確に主張することはできませんでした。p20で移植され、数週間毎日記録された別のマウスにおいて、背部領域CA1を標的とする四極管で神経活動を調べた。大振幅のリップルと十分に絶縁された単一ユニットが、記録の各日に確認されました(図4)。これらのデータは、安定した高品質の in vivo 電気生理学的記録が、発生初期にわたって同じマウスから得られた可能性があることを示しています。
記録部位の組織学的確認と慢性着床の発生影響 最終記録日に続いて、マウスをイソフルラン麻酔 で 完全に麻酔し、続いてペントバルビタールナトリウムを致死的に注射し、電極先端に電流を流して記録部位に小さな病変を生じさせた。実験後のマウス脳の組織学的切片作成により、最終的な記録部位の視覚化が可能になりました(図5A、B)。別のコホートにおいて、3匹の雄および3匹の雌マウスを、上記のようにp20で外科的に移植した。同数の同腹仔が移植されずに放置され、同一の住居条件で維持された。マウスをp62(移植コホートの術後6週間)で屠殺した。頭蓋骨を注意深く洗浄し、ブレグマからラムダまでの距離(図5C、左上)とラムダでの外部最大頭蓋骨幅(図5C、右上)を外部測定しました。頭蓋骨の正中線に沿って切開し、頭蓋骨の半分を切除して、質量測定のために脳を切除しました(図5C、右下)。ブレグマでの頭蓋骨腔の高さは、無傷の頭蓋骨の半分から測定されました(図5C、左下)。移植コホートと非移植コホートの間で有意差はなく(Wilcoxonランクサム検定)、p20から始まる長期移植は頭蓋骨の自然な発達または脳容積に重大な影響を及ぼさないことを示しています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65228/65228fig01.jpg"> 図1:マイクロドライブのコンポーネント。 (A)マイクロドライブ本体、(B)カニューレ、(C)コーン、(D)蓋、(E)ネジアタッチメント、(F)四極管前進スクリューの3次元レンダリング。各コンポーネントの重要な機能が示されています。測定の詳細は、https://github.com/Brad-E-Pfeiffer/JuvenileMouseMicroDrive/ で入手可能なモデルファイルから抽出できます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65228/65228fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65228/65228fig02.jpg"> 図2:マイクロドライブ構造 。 (A)上部と下部のネジアタッチメントが接続された四極方向前進ネジの側面図と(B)上面図。(C)側面および(D)本体とカニューレを取り付け、各カニューレ穴を貫通し、カニューレの底部にトリミングした大きなポリイミドチューブを備えたマイクロドライブの上面図。(E)ネジと小さなポリイミドチューブを取り付けたマイクロドライブの側面図。小さなポリイミドチューブの上部は、四極管装填の直前にトリミングされます。(F)固定装置に取り付けられた完成したマイクロドライブ。通常はマイクロドライブを囲む保護コーンは、視覚化のために取り外されています。なお、ネジ留め具の一部は、このマイクロドライブ用に黒色の樹脂で印刷されています。(G)カウンターバランス支援システム。(H)(I)カウンターバランスサポートシステムが取り付けられたマウスケージの側面および上面図。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65228/65228fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65228/65228fig03.jpg"> 図3:代表的な電気生理学的記録。 p20マウスに、上記のようにマイクロドライブを移植した。p21から開始し、その後2週間毎日、マウスを記録装置に取り付け、神経活動を少なくとも1時間記録した。 (A)両側からの生の局所電界電位(LFP)記録(L =左;R=右)前帯状皮質(ACC)、海馬野CA3(CA3)、海馬野CA1(CA1)。データは毎日収集されました。わかりやすくするために、奇数日のデータのみが表示されます。すべての痕跡は、ホームケージで不動の期間中に撮影されました。スケールバー:1mV、2秒。 (B)海馬野CA3(左)とCA1(右)から分離されたパネル Aの記録のための代表的な単一ユニット。各電極上のすべての生の波形は黒で示されています。平均は赤で表示されています。スケールバー: 50 μV、0.2 ms (C)p20で移植された2匹目のマウスについて、p60での最終記録日までの10日ごとの代表的な生LFPトレース。データは毎日収集されました。わかりやすくするために、10 日ごとのデータのみが表示されます。すべての痕跡は、ホームケージで不動の期間中に撮影されました。スケールバー:1 mV、2秒 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65228/65228fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65228/65228fig04.jpg"> 図 4.慢性的な録音の安定性。 p20マウスに、上記のようにマイクロドライブを移植した。p21から開始し、その後4週間、マウスを記録装置に取り付け、神経活動を少なくとも1時間記録した。示されているのは、背側海馬CA1を標的とする四極管からのデータです。(A)p21、p30、およびp40で特定されたリップルイベントの生(上)およびリップルフィルタリング(下)LFP。リップルイベントを特定するために、生のLFPを125Hzから300Hzの間でバンドパスフィルタリングし、リップルイベントは、平均より3標準偏差を超えるリップルバンドパワーの一時的な増加として特定されました。各リップルの開始と終了は、リップルバンドパワーが平均に戻ったポイントとして定義されました。識別された波紋は赤で表示されます。スケールバー: 100 ms, 上から下: 1,000 μV, 140 μV, 1,800 μV, 180 μV, 9,000 μV, 1,200 μV, 10,000 μV, 1,000 μV. (B)パネル Aの記録のためのCA1ターゲット四極管からの毎日の代表的な単一ユニット。各電極上のすべての生の波形は黒で示されています。平均は赤で表示されています。スケールバー 0.2 ms、上から下へ: 50 μV、100 μV、100 μV。 (C) パネル Bの単一ユニットのすべてのスパイクのオートコレログラム。これらのデータは、数週間にわたって海馬錐体層内に安定した電極配置を示しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65228/65228fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65228/65228fig05.jpg"> 図5:代表的な組織学と頭蓋骨の発達への影響。 p20マウスに、上記のようにマイクロドライブを移植した。p60の最終記録日に続いて、記録部位に電解病変が生じ、脳に4%パラホルムアルデヒドが灌流されました。記録部位を特定するために、50μmの切片を作製した。(A)海馬のCA1およびCA3の病変。矢印はCA3記録サイトを示します。二重矢印はCA1記録サイトを示します。スケールバー:0.5ミリメートル。 (B)両側ACCの病変。矢印はACC記録サイトを示します。スケールバー:0.5ミリメートル。 (C)p20でマイクロドライブを移植したp62マウス(灰色)および移植されていない同腹仔(白)の頭蓋骨サイズと脳質量の測定。ウィルコクソン順位和検定の p値は、測定ごとに報告されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65228/65228fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

ここでは、生後20日目(p20)から生後60日目(p60)以降の重要な発達ウィンドウにわたって、幼若および青年マウスの複数の脳領域からの慢性フィールドおよび単一ユニット記録を同時に可能にするマイクロドライブ設計、外科的移植手順、および術後回復戦略について説明します。

In vivo electrophysiology provides unparalleled insight into the sub-second-level circuit dynamics of the intact brain and represents a method of ...

私たちは、脳がネットワークレベルでどのように機能するかを理解することに興味があります。この方法は、自閉症、統合失調症、双極性障害などの加齢依存性疾患の発達変化を特定するための脳ネットワークの開発を探求する試みです。シリコンプローブ技術は、in vivoでのネットワーク活動を記録するためのよりシンプルで一貫性のある方法を提供します。しかし、それにもかかわらず、慢性テトラ記録は、脳領域のより広い空間分布にわたって同時に記録するなど、シリコンプローブに比べていくつかの利点を提供します。慢性記録は、記録部位の神経膠症、経時的な記録部位の移動、または付着方法の失敗など、いくつかの要因により、in vivo電気生理学に独特の課題をもたらします。私たちの最近の研究は、動物の活発な動きの間に海馬のシータ振動によってコード化されたスイープが100ミリ秒程度ごとに繰り返し前進し、将来の可能性のある状態を前向きに評価し、以前の行動を遡及的に評価することを実証しました。幼若マウスでこれらのin vivo記録を行うことは、マウスのサイズが小さいこと、それらの相対的な弱さ、および頭蓋骨の発達の欠如のために、いくつかの工学的課題をもたらす。私たちの方法論はこれらの限界を克服し、発達中のマウスの脳におけるネットワークレベルの活動を毎日慢性的に記録することを可能にします。幼若マウスで慢性的に記録することに加えて、私たちの方法は、それらの領域の空間的関係に関係なく、最大16の異なる両側脳領域から記録することを可能にします。これらの開発により、健康な脳と自閉症スペクトラム障害などの神経発達障害のマウスモデルの両方で、ネットワークが開発間で機能的コミュニケーションをどのように確立するかを特定できます。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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このプロトコルでは、ラットの慢性的な電気生理学的記録のために設計されたマイクロドライブアレイで使用するためのtetrodesを作製し、条件する方法を示しています。さらに、我々は、インストールのアース線と保護円錐を含むマイクロドライブアレイの建設、最終段階を示しています。...

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ここでは、現在最大10の分布した脳領域に同時に対称的な両側ワイヤー電極記録が可能なTD Driveという、ラット用のユニークな3Dプリント可能なインプラントを紹介します。...

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急性海馬スライスにおけるシナプス誘発アストログリアとニューロン活動の二重の電気生理学的記録

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鳴禽類には聴覚フィードバックを操作するための軽量、ヘッドフォンベースのシステム

学ぶ軽量マイクロドライブを用いた幼若マウスの慢性四尾行記録法。脳ネットワークの発達と神経発達障害のメカニズム解明に貢献し、最大16の両側性脳領域から同時記録が可能です。

幼若マウスにおける慢性四尾行記録のための軽量駆動インプラント

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