Name: ウシ肝細胞における脂肪滴サイズと融合の評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-10T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: 学ぶウシ肝細胞における脂質滴サイズと融合の評価方法。Oil Red O染色とライブ細胞イメージングを用いて、脂質代謝と脂肪肝のメカニズム解明に貢献する再現性の高い手法を紹介します。

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本研究は、中国国家自然科学基金会(U1904116)の共同支援を受けて行われました。

すべての手順は、河南農業大学(中国河南省)の動物管理委員会の倫理基準に従って承認され、実行されました。
1. ウシ肝細胞培養
<ol><li>初代肝細胞細胞17 を解凍し、400 x g を室温で4分間遠心分離します。 注:初代肝細胞細胞は、以前に発表されたレポート17に従って培養および維持されました。</li>
	<li>凍結保存液をピペットで廃棄し、10%ウシ胎児血清(FBS)とダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)を含む1 mLの培地で懸濁します。次に、細胞計数チャンバーを使用してミリリットルあたりの細胞数を計算し、上記の細胞懸濁液の濃度を計算し、細胞濃度を1 x 107 細胞/ mLに調整します。<ol><li>上記の培地を3 mL入れた60 mm細胞培養皿に細胞懸濁液を加えます。細胞を培養し、37°Cおよび5%CO2 で24時間インキュベートします。</li>
	</ol></li>
	<li>細胞が80%まで成長したら、培地を廃棄し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)ですすぎ、750 μLの0.25%トリプシンを加えて細胞を消化します。細胞を37°Cで3分間インキュベートした後、同量の10%FBSで中和します。細胞懸濁液を回収し、200 x g で室温で4分間遠心分離します。</li>
</ol>2.オイルレッドO染色
<ol><li>10%FBSおよびDMEMを含む800 μLの培養液を、ガラスカバーガラスを含む24ウェル細胞培養プレートの各ウェルに加えます。50 μLの細胞懸濁液(ステップ1.3で得られた)を取り、それを950 μLのPBSに加えて混合します。細胞計数チャンバーを使用してミリリットルあたりの細胞数を計算し、次に上記の細胞懸濁液の濃度を計算します。最後に、各ウェルで細胞濃度を4 x 104/mLに調整し、37°C、5%CO2 で24時間インキュベートします。</li>
	<li>24時間後、培養液を捨て、PBSで洗浄する。1 mg/mLのウシ血清アルブミン(BSA)を含む800 μLのDMEM誘導培地で懸濁します。</li>
	<li>合計100 μLのLA( 材料表参照)を900 μLの無水エタノールに溶解し、標準溶液(100 mmol/L)を調製します。0 μmol/L、100 μmol/L、150 μmol/L、および200 μmol/L LAのグラジエントを24ウェルプレートに追加します。各治療を4回繰り返します。37°C、5%CO2 で24時間インキュベートします。</li>
	<li>培養液を取り出し、細胞をPBSで3回洗浄します。400 μLの4%パラホルムアルデヒドで20分間固定します。固定液を捨て、PBSで3回洗浄します。</li>
	<li>細胞を60%イソプロピルアルコールで5分間インキュベートし、その後廃棄します。新たに調製したオイルレッドO作業溶液( 材料表を参照)(オイルレッドO:水の3:2の比率)を20〜30分間加え、染色液を廃棄します。余分な色素溶液がなくなるまで、細胞をPBSで2〜5回洗浄します。</li>
	<li>300 μLのヘマトキシリン染色溶液(ヘマトキシリン:水比1:10)を加え、核を1〜2分間再染色します。色素溶液を捨て、細胞をPBSで2〜5回洗浄します。24ウェルプレートからガラスカバースリップを取り出し、10 μLの錠剤シーラント( 材料表を参照)をスライドに滴下した後、顕微鏡スライド(細胞を下向きにする側)に置きます。</li>
	<li>封止後、光学顕微鏡のオイルレンズの下で細胞のLDを観察し、画像化します( 材料表を参照)。cellSensソフトウェアでLDの直径を測定し、LDの数とサイズを分析します。</li>
</ol>3. LDのサイズと数の測定
<ol><li>画像のキャプチャ:コンピューターと顕微鏡スイッチを連続してオンにし、スライドをローディングプラットフォームに置き、画像分析ソフトウェア( 材料表を参照)を開き、コンピューターを接続して画像を表示します。<ol><li>低電力で画像を見つけ、イメージングスライドに適切な量の杉油を滴下します。観察係数を100倍に調整し、自動露出を設定し、適切な視野を調整して画像をキャプチャします。イメージングのために、各グループに対して3つの染色細胞スライドを選択します。</li>
	</ol></li>
	<li>直径測定:画像ごとに60個のLDをランダムに選択して直径を測定します。各画像の測定後、画像を保存し、測定結果を表に出力して、LDの平均サイズと分布比を後で分析します。</li>
	<li>量測定:染色および撮影されたスライドごとに3つの画像を選択し、各画像の数量測定用に3つのセルをランダムに選択します。セル周辺のLD数をカウントして分析し、セル内のLDの平均数を計算します。</li>
</ol>4. LD核融合の動的観測
<ol><li>手順1.1〜1.3で説明した細胞培養手順に従います。細胞が80%に成長したら、培地を捨ててPBSですすぎ、750μLのトリプシンで3分間消化します。次に、培地750 μLを添加し、200 x g で室温で4分間遠心分離し、上清を廃棄します。</li>
	<li>細胞を1 mLの培養液に懸濁し、カウントし、35 mmディッシュで細胞濃度を5 x 105 細胞/mLに調整します。37°C、5%CO2 で24時間培養します。</li>
	<li>細胞が80%まで増殖したら、培地をDMEM + 150 μmol/L LAに24時間交換し、37°C、5%CO2 のインキュベーターで培養を続け、LDを蓄積させます。</li>
	<li>24時間後、培養液を取り出す。接着細胞をPBSで洗浄し、10 μg/mL BODIPY 493/503中性蛍光プローブ( 材料表参照)とともに暗所で30分間インキュベートします。インキュベーション後、培養皿内の細胞をPBSで3回洗浄し、DMEM + 150 μmol/L LAを添加します。 注:10 μg/mL BODIPY染色中および染色後の光曝露は避けてください。1 mg/mLのボディーをPBSで希釈しました(1:100)。</li>
	<li>培養皿を生細胞ステーションの顕微鏡の溝に置き( 材料表を参照)、LDの動的変化を観察します。 開始シーケンスに従って生細胞ワークステーションの電源をオンにし、光を避けます。<ol><li>電源、透過光源、顕微鏡電源、水銀ランプ蛍光光源、電荷結合素子(CCD)カメラ電源、コンピューターホスト電源、CO2バルブ、およびCO2インキュベーターをオンにします。</li>
	</ol></li>
	<li>ローディングプラットフォームの溝に蒸留水を追加し、通気孔を越えないようにします。</li>
	<li>コンピュータの電源を入れ、「NISエレメント」を実行します。まず、4倍対物レンズで適切な視野を見つけてから、40倍対物レンズに連続して調整します。E100を選択して顕微鏡でサンプルを観察し、L100を選択してコンピューターでサンプルをプレビューして撮影します。 注意: E100とL100は、生細胞ワークステーションの顕微鏡調整ボタンであり( 材料表を参照)、それぞれ接眼レンズとコンピューター画面を表します。</li>
	<li>蛍光チャネル(例:Ph-40x、フルオレセインイソチオシアネート[FITC]、シャッター)や実験の予想撮影時間などのパラメータを設計します。2枚毎の撮影間隔を5分、合計撮影時間を6時間に含めて、撮影時間を 時間単位で設定します。 注意: 長時間の撮影では、パーフェクトフォーカスシステム(PFS)のフォーカス安定化機能を使用する必要があります。このためには、最初に視野と焦点距離を調整し、次にコンピューター画面で PFS をクリックして、最後にファインフォーカススパイラルを調整します。</li>
	<li>シングルチャンネルまたはオールの異なるチャンネルモードを選択し、別の視野を選択し、 プレビューをクリックし、視野を調整し、これらのパラメーターを設定し、[ 実行開始 ]をクリックして撮影を開始します。最初に5分間テストショットを撮ります。操作が正常になってから時間がかかる場合があります。</li>
	<li>撮影後、[ファイル]>[ 名前を付けて保存]>[ファイルの種類>avi形式 ]を選択して、データを「avi」形式のビデオにエクスポートします。「.nd2」画像形式を使用して、データプログラムを保存し、写真をエクスポートします。</li>
	<li>マシンの電源を切るには、逆の順序で電源を切ります。</li>
</ol>5.統計と結果分析
<ol><li>一元配置分散分析を使用してデータを分析します。結果を標準誤差の平均として報告±。</li>
</ol>

Oil Red OとBODIPYを用いた脂質液滴サイズのライブセルイメージングと融合

<ol><li>Fujimoto, T., Parton, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Not+just+fat%3A+the+structure+and+function+of+the+lipid+droplet%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Not just fat: the structure and function of the lipid droplet.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (3), 004838(2011).</li>
<li>Grasselli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+non-alcoholic+fatty+liver+disease+and+potential+translational+value%3A+The+effects+of+3%2C5-L-diiodothyronine%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Models of non-alcoholic fatty liver disease and potential translational value: The effects of 3,5-L-diiodothyronine.</a> Annals of Hepatology. 16 (5), 707-719 (2017).</li>
<li>Herdt, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ruminant+adaptation+to+negative+energy+balance%3A+Influences+on+the+etiology+of+ketosis+and+fatty+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Clinics+of+North+America%3A+Food+Animal+Practice%22%5BJournal%5D)">Ruminant adaptation to negative energy balance: Influences on the etiology of ketosis and fatty liver.</a> Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. 16 (2), 215-230 (2000).</li>
<li>Pino-de la Fuente, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise+regulation+of+hepatic+lipid+droplet+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Exercise regulation of hepatic lipid droplet metabolism.</a> Life Sciences. 298, 120522(2022).</li>
<li>O'Connor, D., Byrne, A., Berselli, G. B., Long, C., Keyes, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mega-stokes+pyrene+ceramide+conjugates+for+STED+imaging+of+lipid+droplets+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Mega-stokes pyrene ceramide conjugates for STED imaging of lipid droplets in live cells.</a> Analyst. 144 (5), 1608-1621 (2019).</li>
<li>Gao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+lipid+droplet+fusion+and+growth+by+CIDE+family+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29.+Molecular+and+Cell+Biology+of+Lipids%22%5BJournal%5D)">Control of lipid droplet fusion and growth by CIDE family proteins.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA). Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (10), 1197-1204 (2017).</li>
<li>Tütüncü Konyar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+changes+in+insoluble+polysaccharides+and+neutral+lipids+in+the+developing+anthers+of+an+endangered+plant+species%2C+Pancratium+maritimum%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Systematics+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Dynamic changes in insoluble polysaccharides and neutral lipids in the developing anthers of an endangered plant species, Pancratium maritimum.</a> Plant Systematics and Evolution. 304, 397-414 (2018).</li>
<li>Spangenburg, E. E., Pratt, S. J. P., Wohlers, L. M., Lovering, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+BODIPY+%28493%2F503%29+to+visualize+intramuscular+lipid+droplets+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedicine+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Use of BODIPY (493/503) to visualize intramuscular lipid droplets in skeletal muscle.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 598358(2011).</li>
<li>Mehlem, A., Hagberg, C. E., Muhl, L., Eriksson, U., Falkevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+neutral+lipids+by+oil+red+O+for+analyzing+the+metabolic+status+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Imaging of neutral lipids by oil red O for analyzing the metabolic status in health and disease.</a> Nature Protocols. 8 (6), 1149-1154 (2013).</li>
<li>Diaz, G., Melis, M., Batetta, B., Angius, F., Falchi, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophobic+characterization+of+intracellular+lipids+in+situ+by+Nile+Red+red%2Fyellow+emission+ratio%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Hydrophobic characterization of intracellular lipids in situ by Nile Red red/yellow emission ratio.</a> Micron. 39 (7), 819-824 (2008).</li>
<li>Duan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+synthesis+of+polarity-sensitive+fluorescent+dyes+based+on+the+BODIPY+chromophore%5BTitle%5D)+AND+%22Dyes+and+Pigments%22%5BJournal%5D)">The synthesis of polarity-sensitive fluorescent dyes based on the BODIPY chromophore.</a> Dyes and Pigments. 89 (3), 217-222 (2011).</li>
<li>Rumin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+fluorescent+Nile+red+and+BODIPY+for+lipid+measurement+in+microalgae%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+for+Biofuels%22%5BJournal%5D)">The use of fluorescent Nile red and BODIPY for lipid measurement in microalgae.</a> Biotechnology for Biofuels. 8, 42(2015).</li>
<li>Fam, T. K., Klymchenko, A. S., Collot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+fluorescent+probes+for+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Materials%22%5BJournal%5D)">Recent advances in fluorescent probes for lipid droplets.</a> Materials. 11 (9), 1768(2018).</li>
<li>Raboisson, D., Mounié, M., Maigné, É <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diseases%2C+reproductive+performance%2C+and+changes+in+milk+production+associated+with+subclinical+ketosis+in+dairy+cows%3A+A+meta-analysis+and+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dairy+Science%22%5BJournal%5D)">Diseases, reproductive performance, and changes in milk production associated with subclinical ketosis in dairy cows: A meta-analysis and review.</a> Journal of Dairy Science. 97 (12), 7547-7563 (2014).</li>
<li>Ospina, P. A., Nydam, D. V., Stokol, T., Overton, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associations+of+elevated+nonesterified+fatty+acids+and+%CE%B2-hydroxybutyrate+concentrations+with+early+lactation+reproductive+performance+and+milk+production+in+transition+dairy+cattle+in+the+northeastern+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dairy+Science%22%5BJournal%5D)">Associations of elevated nonesterified fatty acids and β-hydroxybutyrate concentrations with early lactation reproductive performance and milk production in transition dairy cattle in the northeastern United States.</a> Journal of Dairy Science. 93 (4), 1596-1603 (2010).</li>
<li>Campos-Espinosa, A., Guzmán, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+experimental+steatosis+in+vitro%3A+hepatocyte+cell+culture+in+lipid+overload-conditioned+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A model of experimental steatosis in vitro: hepatocyte cell culture in lipid overload-conditioned medium.</a> Journal of Visualized Experiments. (171), e62543(2021).</li>
<li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+nonesterified+fatty+acids+on+the+synthesis+and+assembly+of+very+low+density+lipoprotein+in+bovine+hepatocytes+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dairy+Science%22%5BJournal%5D)">Effects of nonesterified fatty acids on the synthesis and assembly of very low density lipoprotein in bovine hepatocytes in vitro.</a> Journal of Dairy Science. 97 (3), 1328-1335 (2014).</li>
<li>Wang, L., Liu, J. Y., Miao, Z. J., Pan, Q. W., Cao, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplets+and+their+interactions+with+other+organelles+in+liver+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Lipid droplets and their interactions with other organelles in liver diseases.</a> The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 133, 105937(2021).</li>
<li>Sanjabi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplets+hypertrophy%3A+a+crucial+determining+factor+in+insulin+regulation+by+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Lipid droplets hypertrophy: a crucial determining factor in insulin regulation by adipocytes.</a> Scientific Reports. 5, 8816(2015).</li>
<li>Saponaro, C., Gaggini, M., Carli, F., Gastaldelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+subtle+balance+between+lipolysis+and+lipogenesis%3A+a+critical+point+in+metabolic+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">The subtle balance between lipolysis and lipogenesis: a critical point in metabolic homeostasis.</a> Nutrients. 7 (11), 9453-9474 (2015).</li>
<li>Yang, A., Mottillo, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocyte+lipolysis%3A+from+molecular+mechanisms+of+regulation+to+disease+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Adipocyte lipolysis: from molecular mechanisms of regulation to disease and therapeutics.</a> Biochemical Journal. 477 (5), 985-1008 (2020).</li>
<li>Gluchowski, N. L., Becuwe, M., Walther, T. C., Farese, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplets+and+liver+disease%3A+from+basic+biology+to+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Lipid droplets and liver disease: from basic biology to clinical implications.</a> Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 14 (6), 343-355 (2017).</li>
<li>Meex, R. C. R., Schrauwen, P., Hesselink, M. K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+myocellular+fat+stores%3A+lipid+droplet+dynamics+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Regulatory%2C+Integrative+and+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Modulation of myocellular fat stores: lipid droplet dynamics in health and disease.</a> American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 297 (4), 913-924 (2009).</li>
<li>Sarnyai, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cis-and+trans-monounsaturated+fatty+acids+on+palmitate+toxicity+and+on+palmitate-induced+accumulation+of+ceramides+and+diglycerides%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Effect of cis-and trans-monounsaturated fatty acids on palmitate toxicity and on palmitate-induced accumulation of ceramides and diglycerides.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), 2626(2020).</li>
<li>Ricchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effect+of+oleic+and+palmitic+acid+on+lipid+accumulation+and+apoptosis+in+cultured+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Differential effect of oleic and palmitic acid on lipid accumulation and apoptosis in cultured hepatocytes.</a> Journal of Gastroenterology and Hepatology. 24 (5), 830-840 (2009).</li>
<li>Fei, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+phosphatidic+acid+in+the+formation+of+%26%2334%3Bsupersized%26%2334%3B+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A role for phosphatidic acid in the formation of &#34;supersized&#34; lipid droplets.</a> PLoS Genetics. 7 (7), e1002201(2011).</li>
<li>Kowada, T., Maeda, H., Kikuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BODIPY-based+probes+for+the+fluorescence+imaging+of+biomolecules+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">BODIPY-based probes for the fluorescence imaging of biomolecules in living cells.</a> Chemical Society Reviews. 44 (14), 4953-4972 (2015).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+the+fluorescent+dye+BODIPY+in+the+study+of+lipid+dynamics+of+the+rice+blast+fungus+Magnaporthe+oryzae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Application of the fluorescent dye BODIPY in the study of lipid dynamics of the rice blast fungus Magnaporthe oryzae.</a> Molecules. 23 (7), 1594(2018).</li>
</ol>

著者は、利益相反がないことを宣言します。

病理学的状態に応じて、肝LDはその大きさおよび数において途方もない変化を受ける。LDは肝細胞細胞に広く存在し、肝臓の健康と病気に重要な役割を果たします18。LDの量とサイズは、LDの生合成に関する現在の研究の基礎です19。細胞および組織のLDのサイズと数は、エネルギーを貯蔵および放出する能力を反映しています。LDの動的変化は、脂質代謝活性の安定性を維持する20,21。LDの異常な蓄積は様々な病的状態で起こり、代謝性疾患の指標となり得る22,23。このプロトコルは、脂肪酸誘導肝細胞モデルにおけるLDのサイズと量を測定し、LDの融合をより効率的かつ直感的に観察するための正確な方法を提供します。
LDのサイズと動的変化を研究することは、脂質代謝障害に関連する疾患...

肝細胞における脂肪滴(LD)の蓄積は、肝線維症および肝細胞癌に進行する可能性のある非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)の典型的な特徴です。脂肪肝疾患の最も初期の症状は脂肪症であり、肝細胞の細胞質におけるLD蓄積を特徴とすることが見出されている1。肝脂肪症は、常にLDの数の増加および/またはサイズの拡大に関連しています2。LDは、中性脂肪(TG)を核とした小胞体(ER)から生成されると考えられており、タンパク質やリン脂質に囲まれています3。TG貯蔵を担う細胞内オルガネラとして、LDは、そのサイズ、数、脂質組成、タンパク質、および他のオルガネラとの相互作用に関して異なる特徴を示し、これらはすべて細胞エネルギー恒常性に影響を与えます4。TGレベルはLDのサイズと正の相関があり、細胞内TG含有量が高いほど、より大きなLDを形成する可能性があります5。LDは、TGの局所合成、ERへの脂質の取り込み、および複数のLDの融合によってサイズが増加します6。大きなLDを含む細胞(脂肪細胞、肝細胞など)は、LD融合によって脂質貯蔵を効率的に増加させる特殊なメカニズムを持っています。LDの動的な変化は、細胞のさまざまなエネルギー代謝状態を反映しています。健常細胞と異常細胞における様々な肝LDの観察と解析を可能にする方法論を開発することが重要です。
LDの主な非蛍光色素はスーダンブラックBとオイルレッドOであり、スーダンブラックBは中性脂質、リン脂質、ステロイドを染色します7。オイルレッドOは、主に骨格筋、心筋細胞、肝臓組織、脂肪細胞などのLDの染色に使用され8、マウスおよびヒトの肝脂肪症を定量的に検出するための標準ツールと考えられています9。LDの動的変化は、主に蛍光染色によって行われる。ナイルレッドおよびBODIPYは、いずれも一般的に使用される蛍光脂質色素10、11である。ナイルレッドと比較して、BODIPYはより強い組織透過性を有し、LDs12とよりよく結合する。BODIPY標識LDは、生細胞の染色および他の細胞小器官との共局在に使用することができる13。
脂肪肝疾患の発生率は、反芻動物の方が単胃動物よりも有意に高い14。移行期間中、乳牛は負のエネルギー収支の状態を経験します3。ウシ肝細胞では、大量の非エステル化脂肪酸(パルミチン酸、オレイン酸、リノール酸など)がTGに合成され、肝機能異常を引き起こし、乳製品の品質や生産効率を大幅に低下させます15。本研究は、LDのサイズと数を解析し、LD融合ダイナミクスを監視するためのプロトコルを提供することを目的としています。我々は、肝細胞16 に異なる濃度のリノール酸(LA)を添加してLD形成モデルを構築し、LDをオイルレッドOで染色することにより、プロセス中のLDのサイズと数の変化を観察しました。さらに、LDの急速な融合の過程は、BODIPY 493/503による染色によっても観察された。

<table><tbody><tr><td>0.25% トリプシン</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td>試薬</td></tr><tr><td>4% パラホルムアルデヒド</td><td>Solarbio</td><td>P1110</td><td>試薬</td></tr><tr><td>BODIPY 493/503</td><td>invitrogen</td><td>2295015</td><td>試薬</td></tr><tr><td>杉油</td><td>Solarbio</td><td>C7140</td><td>試薬</td></tr><tr><td>細胞計数チャンバー</td><td></td><td></td><td>装置</td></tr><tr><td>細胞培養皿</td><td>コーニング</td><td>353002</td><td>材料</td></tr><tr><td>セルセンサソフトウェア&nbsp;</td><td>オリンパス IX73</td><td></td><td>ソフトウェア</td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>エッペンドルフ</td><td></td><td>装置</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>HyClone</td><td>SH30022.01</td><td>試薬</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Gibco</td><td>2492319</td><td></td></tr>試薬 <tr><td>ヘマトキシリン</td><td>DingGuo</td><td>AR0712</td><td>試薬</td></tr><tr><td>画像表示</td><td></td><td></td><td>画像分析 sodtware</td></tr><tr><td>リノール酸</td><td>Solarbio</td><td>SL8520</td><td>試薬</td></tr><tr><td>Live Cell Station</td><td>Nikon A1 HD25</td><td></td><td>装置</td></tr><tr><td>NIS-Elements&nbsp;</td><td>ニコン</td><td></td><td>ソフトウェア</td></tr><tr><td>オイルレッドO</td><td>Solarbio</td><td>G1260</td><td>試薬</td></tr><tr><td>光学顕微鏡</td>オ<td>リンパスIX73</td><td></td><td>機器</td></tr><tr><td>ペニシリン&ストレプトマイシン100&times;</td><td>NCM Biotech</td><td>CLOOC5</td><td>試薬</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>HyClone</td><td>SH30258.01</td><td></td></tr>試薬 <tr><td>ピペット</td><td>エッペンドルフ</td><td></td><td>機器</td></tr><tr><td>シーリング剤</td><td>Solarbio</td><td>S2150</td><td>試薬</td></tr></tbody></table>

ウシ肝細胞における脂肪滴サイズと融合の評価

Evaluation of Lipid Droplet Size and Fusion in Bovine Hepatic Cells

脂肪滴(LD)は、細胞内の脂質代謝および中性脂質貯蔵において重要な役割を果たす細胞小器官です。それらは、肥満、脂肪肝疾患、糖尿病などのさまざまな代謝性疾患に関連しています。肝細胞では、LDのサイズと数は脂肪肝疾患の兆候です。さらに、酸化ストレス反応、細胞オートファジー、およびアポトーシスは、LDのサイズと数の変化を伴うことがよくあります。その結果、LDの寸法と量は、LD生合成のメカニズムに関する現在の研究の基礎となっています。ここでは、脂肪酸誘導性ウシ肝細胞において、オイルレッドOを用いてLDを染色する方法と、LDのサイズと数を調べる方法について説明します。LDのサイズ分布を統計的に分析します。小さなLDが大きなLDに融合する過程は、生細胞イメージングシステムによっても観察されます。今回の研究は、異なる生理学的条件下でのLDのサイズ変化傾向を直接観察する方法を提供する。

細胞LDの染色を 図1に示す。赤い点は細胞LDを反映し、青い点は核を反映しています。LAの治療では、各写真のLDのサイズと数が異なることがわかります。
LA投与量の増加に伴い、LDの平均直径と数はLA濃度に応じて有意に増加する傾向を示しました(図2)。 図2Aに示されるように、細胞当たりのLDの数は、LAの異なる濃度と負の相関があった。細胞あたりのLD数の中央値は、100 μmol/L LA処理群で136でしたが、150 μmol/Lおよび200 μmol/L LA処理群でそれぞれ118および105に減少しました。対照群のLDの平均直径は0.72 μm、100 μmol/L LA処理群では1.38 μm、150 μmol/L LA処理群では1.51 μm、200 μmol/L LA処理群では1.64 μmでした(図2B)。
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本プロトコルでは、オイルレッドOを使用して脂肪滴(LD)を染色する方法、脂肪酸誘発脂肪肝細胞モデルでLDのサイズと数を計算する方法、およびBODIPY 493/503を使用して小さなLDが大きなLDに融合するプロセスを観察する方法について説明しますライブセルイメージングによる。

Lipid droplets (LDs) are organelles that play an important role in lipid metabolism and neutral lipid storage in cells. They are associated with a variety ...

私たちの研究は、肝細胞におけるリノール酸によって誘導される脂肪滴数とサイズに焦点を当てています。さらに、脂肪肝のメカニズムについての洞察を提供することを目指しています。この分野の研究における最近の進歩は、コリン、CCTアルファ、確立された誘導オートファジーが、ウシ肝細胞の脂肪滴サイズを調節できることを示唆しています。さらに、生細胞ワークステーションの観察により、リン脂質が脂肪滴融合にかなりの影響を与えることが示されています。現在、遺伝子支援、蛍光ピンセット、液体クロマトグラフィー、オミックス分析、シングルクロマトグラフィー、フローサイトメトリー、およびその他の技術を使用して、この分野の膨大な研究をグループ化しています。実験方法にはいくつかの制限があります。例えば、限られた場の現象は、脂肪滴場についておよび特定の廃棄物の飛行下でのみ観察することができる。Oil Red O染色は、脂肪滴蛍光染色よりも便利で安価であり、脂肪滴の見かけのサイズを測定するために広く使用されています。操作が簡単で、必要な機器も少なくて済みます。さらに、この驚異的な脂質融合を生細胞ステーションから直接観察します。本研究は、脂肪滴の大きさと融合を観察するための簡便で再現性のある方法を提供し、細胞脂質代謝研究における脂肪滴分析に広く適用することができます。今後も乳牛における脂肪滴融合のメカニズムや脂肪肝の構造変化に着目し、脂肪滴の研究を集中的に進めていきます。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

1つの細胞の脂質滴を単離するための技術）は、酵母細胞および2）ヒト胎盤が提示される。両方の手順は、液滴の中心を含有する得られた浮遊層が容易に、眼によって視覚化抽出し、純度についてウェスタンブロット分析によって定量化することができる密度勾配遠心分離である。...

細胞の脂質滴の分離：酵母細胞とヒト胎盤から2精製技術

デノボ脂質生成およびβ脂肪酸酸化は、肝細胞に脂肪肝疾患を含むいくつかの代謝障害に摂動された経路を主要な代謝経路を構成しています。ここでは、マウス初代肝細胞の単離を実証し、β - 脂肪酸の酸化および脂質生成の定量化について説明します。...

マウス初代肝細胞における脂肪酸酸化および脂質生成の決意

脂肪滴は、C型肝炎ウイルス（HCV）を含むいくつかの病原体の複製のための重要な器官です。我々は、関連するタンパク質の定量的な質量分析のための脂質滴を単離する方法を記載します。そのようなウイルス感染、環境ストレス、または薬物治療などの条件の様々な環境下で使用することができます。...

定量的質量分析のための脂肪滴の分離

このプロトコルは、脂質液滴分離と老舗の小胞体分離キットを使用して、マウス肝臓から精製法を確立します。...

老舗のオルガネラの分離キットを使用して急速な脂質液滴の隔離のプロトコル

本研究では、脂肪酸塩オレイン酸オレイン酸を用いた分化HepaRG細胞における肝小胞性脂肪症を誘導するための詳細なプロトコルを説明し、一貫性のある抗ストークスを含む脂質蓄積の検出と定量のための方法を採用する。ラマン散乱(CARS)顕微鏡、細胞フルオロメトリクス分析、オイルレッドO染色、およびqPCR。...

分化HepaRG細胞における大胞性脂肪症の誘導と特徴付け

ここでは、肝臓組織における脂肪滴の特性評価に最適化されたBODIPY...

肝脂肪症評価のための3D再構成による蛍光染色された脂肪滴の分析

この記事では、代謝機能障害に関連する脂肪性肝疾患のモデルとしてのオレイン酸誘導性HepG2細胞の使用について説明します。...

代謝機能障害関連脂肪性肝疾患における脂肪沈着のin vitroモデリング

このプロトコルにより、同期肝腫細胞を用いて有糸分裂中の脂質滴および細胞小器官の動態を再現可能にします。...

肝腫瘍細胞における有糸分裂中の脂質滴および細胞小器官の動態を視覚化する蛍光ベースの方法

初代肝細胞は、生理学的に関連する実験系の生化学的、分子生物学、代謝機能を評価するための貴重なツールを提供しています。我々は一貫してto1.0×10アップ可能な肝細胞を生成する現場肝灌流、ラットの信頼性の高いプロトコルを記述する...

ラット肝細胞の単離及び初代培養

我々は、β-ガラクトシダーゼの活性発現によりSNARE媒介膜融合事象を定量化細胞融合アッセイを開発した。...

酵素による細胞融合アッセイを使用して、SNARE媒介膜融合の解析

学ぶウシ肝細胞における脂質滴サイズと融合の評価方法。Oil Red O染色とライブ細胞イメージングを用いて、脂質代謝と脂肪肝のメカニズム解明に貢献する再現性の高い手法を紹介します。

ウシ肝細胞における脂肪滴サイズと融合の評価

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