Name: エクスビボ 加齢黄斑変性症研究のためのヒトドナー眼のOCTを用いたマルチモーダルイメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: 学ぶOCTを用いたヒトドナー眼のマルチモーダルイメージングで加齢黄斑変性症の病態を詳細に可視化する手法。網膜構造の変化を捉え、治療開発に寄与する重要な知見を提供します。

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オリジナルのアイホルダーの計装と設計を提供してくれたハイデルベルクエンジニアリング、OCTベースのマルチモーダルイメージングの紹介をしてくれたRichard F. Spaide MD、臨床画像デバイスへのアクセスを容易にしてくれたChristopher Girkin MD、 図 1を提供してくれたDavid Fisherに感謝します。研究のための人間のドナーの目の回復は、国立衛生研究所(NIH)の助成金R01EY06019(C.A.C.)、P30 EY003039(ピットラー)、R01EY015520(スミス)、R01EY027948(C.A.C.、T.A.)によってサポートされました。R01EY030192(Li)、R01EY031209(スタンボリアン)、U54EY032442(スプラギンズ)、IZKFヴュルツブルク(N-304、T.A)、アラバマ州アイサイト財団、国際網膜研究財団(C.A.C.)、アーノルドとメイベルベックマン黄斑研究イニシアチブ(C.A.C.)、および失明防止AMDカタリスト(シャイ)。

AMD研究のためのヒトドナー眼のOCTベースマルチモーダルイメージング

C.A.C.はハイデルベルクエンジニアリングから研究支援を受け、アペリス、アステラス、ベーリンガーインゲルハイム、キャラクターバイオサイエンス、オザンニのコンサルティングを行っています。T.A.はノバルティスから研究支援を受け、ロシュ、ノバルティス、バイエル、ニデック、アペリスのコンサルティングを行っています。K.B.F.は、ジェネンテック、ツァイス、ハイデルベルクエンジニアリング、アラガン、バイエル、ノバルティスのコンサルタントです。

COVID以前の16か月間に集団ベースのスクリーニングアプローチを使用して、AMDで75人のドナーの目を調達することができました。すべて短いDtoPで回収し、OCTアンカーMMIを使用してステージングしました。年齢基準(>80歳)は、移植可能な角膜を対象とした組織回復の典型的な年齢範囲外です。高齢にもかかわらず、私たちの基準はAMDのすべての段階で目をもたらしました。多くのRPE表現型はすべてのAMDステージに共通しており、一部は血管新生AMD 3,46に排他的です。ex vivoイメージングとin vivoイメージングの直接比較(図7)により、トップレベルの診断分類に十分な網膜のex vivo画像を作成する上で、専門家の取り扱い(図1)とともに短いDtoPが重要な要素であり、これらのサンプルのいくつかはイメージングと組織学の直接的な相関関係に適して...

光干渉断層撮影(OCT)の指導の下で抗VEGF療法で血管新生加齢黄斑変性症(AMD)を管理してきた15年間は、視力喪失のこの一般的な原因の進行シーケンスとマイクロアーキテクチャに新しい洞察を提供しました。重要な認識は、AMDが神経感覚網膜、網膜色素上皮(RPE)、および脈絡膜を含む三次元疾患であるということです。治験患者や治療を受けた臨床患者の仲間の目のOCTイメージングの結果、何十年にもわたって臨床標準であったカラー眼底写真で見られる以上の病理の特徴が認識されるようになりました。これらには、網膜内血管新生(3型黄斑新生血管1、以前は血管腫性増殖)、網膜下ドルセノイド沈着物(SDD、網様偽ドルーゼンとも呼ばれる)2、RPE運命の複数の経路3,4、および萎縮における激しい神経膠生物ミュラー細胞5,6が含まれます。
黄斑(細胞と動物)を欠くモデルシステムは、この複雑な病気のいくつかのスライスを再現します7,8,9。AMDの負担を改善するさらなる成功は、人間の目の原発病理の発見と探索、黄斑のユニークな細胞組成の理解、それに続くモデルシステムへの翻訳からもたらされる可能性があります。このレポートは、学術研究所とアイバンクの30年間のコラボレーションを描いています。本明細書に記載の組織特性評価法の目標は、1)顕微鏡で眼底の外観と画像化シグナル源の基礎を実証することにより、進化する診断技術に情報を提供すること、2)AMD標本を標的(免疫組織化学)および非標的分子探索技術(イメージング質量分析、IMS、および空間トランスクリプトミクス)のために分類することであり、錐体のみの中心窩と桿状に富む傍中心窩および中心窩を保存します。このような研究は、アイトラッキングを通じて進行シーケンスと縦断的フォローアップが可能な臨床OCTへの翻訳を加速する可能性があります。治療効果を監視するように設計されたこの技術は、網膜血管を使用して、あるクリニック訪問から次のクリニック訪問へのスキャンを登録します。眼球追跡OCTを破壊的技術で得られた検査結果にリンクさせることは、分子所見に新しいレベルの予後価値を提供する可能性があります。
1993年、研究所は死後の眼底のカラー写真をフィルム10に撮影しました。この取り組みは、Foosらによるヒト末梢網膜の優れた顕微鏡検査と組織学11,12,13と、Sarksらによる広範なAMD臨床病理学的相関に触発されました14,15。2009年から、スペクトルドメインOCTに固定されたex vivoマルチモーダルイメージング(MMI)が採用されました。この移行は、他の人の同様の努力16,17、特にサークスによって記述された超微細構造の多くが、時間の経過とともにクリニックで3次元で利用可能であるという認識に触発されました18,19。目標は、網膜、RPE、および脈絡膜における細胞レベルの表現型の十分な検出力のある研究のために、妥当な時間枠で黄斑が付着した目を取得することでした。その意図は、「目ごと」の統計を超えて、心血管疾患の「脆弱なプラーク」の概念の影響を受けた基準である「病変タイプごと」に移行することでした20,21。
このレポートのプロトコルは、いくつかのストリームでアクセッションされた約400組のドナーアイの経験を反映しています。2011年から2014年にかけて、AMD組織病理学のプロジェクトMACULAウェブサイトが作成され、142のアーカイブされた標本からの層の厚さと注釈が含まれています。これらの眼は、高分解能エポキシ樹脂組織学および電子顕微鏡観察のために、1996年から2012年までグルタルアルデヒド-パラホルムアルデヒド固定剤で保存されました。すべてのファンディは、受け取ったときにカラーで撮影され、組織学の直前にOCTによって再画像化されました。もともと視神経研究用に設計されたアイホルダー22を使用して、中心窩を中心とした直径8mmの全層組織パンチを収容しました。中心窩の中心と2 mm上の部位を通るOCT Bスキャンは、同じレベルの組織学に対応し、カラー眼底写真をウェブサイトにアップロードしました。OCT平面の選択は、中心窩23の下のAMD病理の卓越性と、中心窩24,25よりも優れた桿体が豊富な領域でのSDDの卓越性によって決定されました。
2013年以降、生涯にOCTアンカーMMIで画像化された目は、直接的な臨床病理学的相関のために利用可能になりました。ほとんど(10人のドナーのうち7人)は、研究目的で死後に眼を提供することに関心のある患者に高度な指令レジストリを提供する網膜紹介診療所(著者:KBF)の患者に関係していました。眼は地元のアイバンクによって回収・保存され、研究所に移され、プロジェクトMACULAの目と同じ方法で準備されました。死前の臨床OCTボリュームは実験室でシームレスに読み取られ、したがって、人生の間に見られる病理学的特徴を顕微鏡下で見られる特徴と一致させた26。
2014年以降、前向き眼球採集は、病歴のないドナー眼でAMDのスクリーニングから始まりましたが、定義された制限時間(6時間)の間保存されました。この目的のために、アイホルダーは地球全体を収容するように変更されました。これにより、以前に使用されていた8 mmパンチのカットエッジの周りで剥離する可能性が減少しました。眼は免疫組織化学のために4%緩衝パラホルムアルデヒドで保存され、長期保存のために翌日1%に移されました。2016年から2017年(パンデミック前)に、90人のドナーから184の目が回復しました。このレポートの統計情報と画像は、このシリーズから生成されます。パンデミックの時代(2020年の封鎖と余波)の間、トランスクリプトミクスとIMSコラボレーションの将来の収集は、基本的に2014年の方法を使用して、ペースを下げて継続しました。
ドナーの目の評価のための他の方法が利用可能です。ミネソタグレーディングシステム(MGS)27,28は、カラー眼底写真用のAREDS臨床システムに基づいています29。この方法の限界には、萎縮性AMDと新生血管性AMDを「後期AMD」の1つの段階に組み合わせることが含まれます。さらに、MGSは、RPE脈絡膜の写真記録の前に神経感覚網膜の除去を伴う。このステップは、SDDをさまざまな程度30,31に取り除き、外側網膜とそのサポートシステムの空間的対応を取り除きます。したがって、網膜からの代謝要求とシグナル伝達をRPE脈絡膜の病理に結び付ける努力が妨げられる可能性があります。ユタシステムは、ex vivoカラー写真とOCTを使用してMMIを実装し、解剖される予定の目をRNAおよびタンパク質抽出用の領域に分類しました32。アイカップ全体の抜歯よりも好ましいが、AMD進行33,34のリスクが最も高い直径3mmの領域は、直径6mmの中心窩中心のパンチの25%に過ぎない。したがって、免疫組織化学のための連続切片化など、中心窩を参照して所見を局在化できる技術が有利である。

<table><tbody><tr><td>ビーカー、250 mL</td><td>フィッシャー</td><td>#02-540K</td><td></td></tr><tr><td>ボトル、1リットル、パイレックス&nbsp;</td><td>Fisher</td><td># 10-462-719</td><td>保存料</td></tr><tr><td>ブンゼンバーナーまたは熱源</td>の保管 <td>Eisco</td><td># 17-12-818</td><td>ワックスを溶かすには</td></tr><tr><td>カメラ、デジタル</td><td>Nikon D7200</td><td>D7200</td><td></td></tr><tr><td>コンピュータとストレージ</td><td>Apple</td><td>iMac Pro; 14 TB 外付けハードドライブ</td><td>画像保存</td></tr><tr><td>コンテナ、断熱</td><td>Fisher</td><td># 02-591-45</td><td>濡れた氷用</td></tr><tr><td>容器、ドナーあたり2個、40 mL</td><td>Fisher</td><td>Sameco Bio-Tite&nbsp; 40 mL # 13-711-86</td><td>防腐剤用</td></tr><tr><td>るつぼ、石英 30 mL</td><td>Fisher</td><td># 08-072D</td><td>写真撮影用地球儀</td></tr><tr><td>シリンダー、卒業生、250 mL</td><td>Fisher</td><td># 08-549G</td><td></td></tr><tr><td>消毒剤洗浄用品&nbsp;&nbsp;</td><td></td><td></td><td>レンズ</td></tr><tr><td>と取り付けブラケット</td><td>の接触J.メッシンジャー</td><td>jeffreymessinger@uabmc.edu</td><td>ハイデルベルクエンジニアリングオリジナルデザインの</td></tr><tr><td>フェイスプロテクションマスク</td><td>の</td>カスタム変更 https://www.cardinalhealth.com/en/product-solutions/medical/infection-control/antiseptics.html アイホルダーフィッシャー<td>#19-910-667</td><td></td></tr><tr><td>鉗子、ハーモンフィックス</td><td>Roboz&nbsp;</td><td>#RS-8247</td><td></td></tr><tr><td>鉗子、マイクロAdson</td><td>Roboz&nbsp;</td><td>#RS-5232</td><td></td></tr><tr><td>鉗子・ティッシュ</td><td>ロボズ</td><td># RS-5172</td><td></td></tr><tr><td>ガラスシャーレ・キマックス</td><td>フィッシャー</td><td>#23064</td><td></td></tr><tr><td>グローブ ダイヤグリップ</td><td>フィッシャー</td><td>#MF-300</td><td></td></tr><tr><td>ガウン ジェンプロ</td><td>フィッシャー</td><td>#19-166-116</td><td></td></tr><tr><td>画像編集ソフト</td><td>Adobe</td><td>Photoshop 2021・Creative Suite</td><td></td></tr><tr><td>キムワイプ</td><td>フィッシャー</td><td>#06-666</td><td></td></tr>ランプ<tr><td>、3つのグースネック</td><td>Schott Imaging</td><td>#A20800</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡、解</td><td>剖用</td>ステレオ<td>Nikon</td><td>SMZ 1000</td></tr>顕微鏡<tr><td>、ステレオ</td><td>オリンパス&nbsp;</td><td>SZX9</td><td>色眼底写真</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド、20%&nbsp;</td><td>EMS</td><td>#15713-S</td><td>防腐剤用、希釈して保存</td></tr><tr><td>用pHメーター</td><td>フィッシャー&nbsp;</td><td>#01-913-806</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝液、ソレンソンs、0.2 M pH 7.2&nbsp;</td><td>EMS</td><td>#11600-10</td><td></td></tr><tr><td>リングフラッシュ</td><td>B&Hフォトビデオ</td><td>Sigma EM-140 DG&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ルビービーズ、直径1mm</td>、<td>メラーオプティクス</td><td>#MRB10MD</td><td></td></tr>、<tr><td>安全メガネ、3M</td><td>フィッシャー</td><td>#19-070-940</td><td></td></tr>、<tr><td>走査型レーザー検眼鏡</td><td>、ハイデルベルクエンジニアリング</td><td>、HRA2</td><td></td></tr><tr><td>はさみ、湾曲スプリング</td><td>、ロボズ</td><td>#RS-5681</td><td></td></tr><tr><td>、シャープスコンテナ</td><td>、フィッシャー</td><td>#1482763</td><td></td></tr><tr><td>シャッターコード、リモート</td><td>ニコン</td><td>MC-DC2</td><td></td></tr><tr><td>スペクトルドメインOCTデバイス</td><td>ハイデルベルクエンジニアリング</td><td>Spectralis HRA&OCT</td><td>https://www.heidelbergengineering.com/media/e-learning/Totara-US/files/pdf-tutorials/2238-003_Spectralis-Training-Guide.pdf</td></tr><tr><td>ステンレス鋼ボールベアリング、直径25.4 mm</td><td>McMaster-Carr</td><td>#9529K31</td><td></td></tr><tr><td>組織マーキング染料、黒</td><td>色 Cancer Diagnostics Inc</td><td># 0727-1</td><td></td></tr><tr><td>組織スライサーブレード</td><td>Thomas Scientific</td><td>#6767C18</td><td></td></tr><tr><td>Trephine、18mm径</td><td>Stratis Healthcare</td><td>#6718L</td><td></td></tr><tr><td>テレビモニター(HDMI)とデジタルカメラ用コード</td><td>B&Hフォトビデオ</td><td>BH#COHD18G6PROB</td><td>ライブビューイングとリモートカメラディスプレイ機能</td></tr>ワックス<tr><td>、ピンクの歯科</td><td>用EMS&nbsp;</td><td>#72670</td><td></td></tr><tr><td>木製アプリケーター</td><td>ピューリタン</td><td>#807-12</td><td></td></tr></tbody></table>

エクスビボ 加齢黄斑変性症研究のためのヒトドナー眼のoctを用いたマルチモーダルイメージング

Ex Vivo OCT-Based Multimodal Imaging of Human Donor Eyes for Research into Age-Related Macular Degeneration

光干渉断層撮影(OCT)ベースのマルチモーダル(MMI)臨床画像から学んだ加齢黄斑変性症(AMD)の進行シーケンスは、検査所見に予後価値を追加する可能性があります。この研究では、網膜組織切片化の前に、ex vivo OCTとMMIをヒトドナーの目に適用しました。眼は80歳≥の非糖尿病白人ドナーから回収され、死亡から保存までの時間(DtoP)は≤6時間でした。グローブを現場で回収し、角膜の除去を容易にするために18 mmのトレフィンでスコアを付け、緩衝した4%パラホルムアルデヒドに浸しました。前眼部摘出後,解剖スコープと一眼レフカメラを用いてトランス照明,エピ照明,フラッシュ照明を3倍率で撮影した。グローブは、60ジオプターレンズを備えたカスタム設計のチャンバー内のバッファーに配置されました。スペクトルドメインOCT(30°黄斑立方体、30 μm間隔、平均= 25)、近赤外反射率、488 nmの自家蛍光、および787 nmの自家蛍光で画像化しました。AMDの目は、網膜色素上皮(RPE)の変化を示し、ドルーゼンまたは網膜下ドルセノイド沈着物(SDD)、新生血管形成の有無にかかわらず、および他の原因の証拠はありませんでした。2016年6月から2017年9月の間に、右眼94個、左眼90個が回復した(DtoP:3.9±1.0時間)。184眼のうち、40.2%がAMDを有し、初期中期(22.8%)、萎縮性(7.6%)、血管新生(9.8%)AMDを含み、39.7%が目立たない黄斑を有していた。ドルーゼン、SDD、過反射性病巣、萎縮、および線維血管瘢痕はOCTを使用して特定されました。 アーティファクトには、組織の混濁、剥離(細菌、網膜、RPE、脈絡膜)、中心窩嚢胞性変化、起伏のあるRPE、および機械的損傷が含まれていました。凍結切片をガイドするために、OCTボリュームを使用して、中心窩と視神経乳頭のランドマークと特定の病状を見つけました。ex vivoボリュームは、アイトラッキングのための参照機能を選択することによって、in vivoボリュームに登録されました。インビボで見られる病状の生体外での可視性は、保存品質に依存します。16か月以内に、AMDのすべての段階で75の迅速なDtoPドナーの眼が回復し、臨床MMI法を使用して病期分類されました。

表1は、2016年から2017年の間に、94人の白人の非糖尿病ドナー&gt;80歳からの184の眼が回復したことを示しています。平均死亡から保存までの時間は3.9時間(範囲:2.0〜6.4時間)であった。レビューされた184の目のうち、75(40.2%)が特定のAMDを持っていました。次のカテゴリーが特定されました:目立たない(39.7%)、疑わしい(11.4%)、早期中期AMD(22.8%)、萎縮性(7.6%)、血管新生(9.8%)、その他(8.7%)、および不明/記録されていない/評価できない(&lt;1%)。図2、図3、図4、および図5は、このシリーズの非常によく保存された目のマルチスケール、マルチモーダルex vivoイメージングを示しています。眼は網膜疾患専門の眼科医(J.A.K.)と共同でレビューした。一部の目は他の目よりも個々の特徴をよ...

ラボアッセイでは、加齢黄斑変性症(AMD)の縦断的光干渉断層撮影(OCT)ベースのマルチモーダルイメージングから得られた予後値を活用できます。AMDの有無にかかわらず、ヒトドナーの眼は、組織切片作成の前に、OCT、カラー、近赤外反射率スキャンレーザー検眼鏡、および2つの励起波長での自家蛍光を使用して画像化されます。

エクスビボ 加齢黄斑変性症研究のためのヒトドナー眼のOCTを用いたマルチモーダルイメージング

A progression sequence for age-related macular degeneration (AMD) learned from optical coherence tomography (OCT)-based multimodal (MMI) clinical imaging ...

このプロトコルは、加齢黄斑変性症またはAMDの新しい治療と予防を可能にします。これは中枢神経変性を伴う最大の疾患ですが、目の正確な構造と網膜の細胞レベルの臨床画像の利用可能性のために、最も親しみやすいと考えています。AMDの基礎疾患の血管新生合併症は、AMDを患っている患者の15%で15年間正常に治療されています。最近、FDAは基礎疾患の末期段階の最初の薬を承認しました。シングルセルRNAシーケンシングにより、網膜とそれを支える脈絡膜血管系における100種類以上の細胞型の分子レパートリーが明らかになりました。眼追跡光干渉断層撮影法(OCT)により、クリニックでの詳細な細胞レベルの進行シーケンスを垣間見ることができました。AMD研究用の既存の細胞および動物モデル・システムは、ヒトの病理および進行リスクを予測できません。これは、新しい治療法や予防法の開発を妨げます。私たちの研究室は、暗視に必要な幅広い光受容体の早期喪失など、AMDに関する多くのトップレベルの発見に貢献しました。また、神経感覚網膜が付着したより保存状態の良い黄斑は、臨床OCTイメージングに直接関連していることも観察されました。AMD病理の多くの部分は、網膜と脈絡膜の断面図を示す臨床OCTで見えるようになりました。ヒトドナー眼のOCT結果は、臨床画像における所見と直接比較することができる。ラボがOCTを使用して、アッセイ前の目や遺伝子発現やプロテオミクスなどのラボ所見を特徴付け、臨床画像の縦断的なタイムラインを活用して最も有益なリスク指標に焦点を当てることで、臨床画像基準をエミュレートできるとしたら。

ex-vivo-oct-based-multimodal-imaging-human-donor-eyes-for-research

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

尾静脈注射によって行われるインドシアニングリーン血管造影（またはICGA）は、マウス脈絡膜の異常を特徴付けるために、高品質のICGA経時画像を提供する。...

経時インドシアニングリーン血管造影による加齢黄斑変性症のマウスモデルにおける脈絡膜血管系の異常を検出する

人間の目でブルッフ膜に特異的に関連するタンパク質を特定することは、加齢黄斑変性症などの眼疾患の背後にある生化学的メカニズムを理解するための重要なステップです。このプロトコルは、下流の生化学的分析のためにこの細胞外マトリックスのシートを濃縮する方法を説明しています。...

ヒトドナー目からブルッフ膜の濃縮

網膜への遺伝子治療薬の配達をお手伝いし、その地域の範囲を評価する視細胞活力を特徴付ける高分解能スペクトル領域光干渉断層法 (HR-SD-OCT)...

超高解像度マウス光コヒーレンストモグラフィー網膜遺伝子治療研究における眼内注入を支援するために

本研究の目的は、間質血管の一部に含まれている脂肪由来幹細胞と血小板由来血小板豊富な血しょう Limoli 網膜修復技術の視細胞移植が視力を改善できるかどうかを評価するためには、乾燥 -...

乾燥 - 加齢黄斑変性症の視細胞の細胞移植による再生療法:体内の予備的なレポート

網膜色素上皮細胞は乾燥加齢による黄斑変性症の高度なフォームのセル置換療法として役立つことができます。このプロトコルでは、地理的な萎縮の目の大きいモデルと病気のこのモデルにヒト胚性幹細胞由来網膜色素上皮細胞の網膜下移植の世代について説明します。...

地図状委縮の目の大きいモデルにヒト胚性幹細胞由来網膜色素上皮細胞の網膜下移植

このプロトコルの目的は、高齢者や病気にかかった人間ブルッフ膜の網膜色素上皮 (RPE) 細胞の培養を示すことです。このメソッドは、侵害された細胞外のマトリックスの RPE...

高齢者人間ブルッフ膜のEx Vivoモデルの網膜色素上皮細胞の培養

ここでは、スペクトル領域光干渉断層撮影(SD-OCT)を用いて、網膜変性、緑内障、糖尿病性網膜症、近視のモデルにおいて、in...

光コヒーレンストモグラフィーを用いたげっ歯類モデルにおける眼疾患のin vivo構造評価

大脳皮質の発達における遺伝子の機能の迅速な評価を行うために、我々は関与する方法を説明...

神経形態形成の研究のための方法：<em&gt;エキソビボ</em胎児マウス大脳皮質&gt; RNAiのエレクトロポレーション

この資料では、1つは、模倣することができるようにする方法について説明します。...

全体の開発、 ショウジョウバエの脳のex vivoで培養

ここでは、のために必要なツールを開発...

ex vivoでマウス神経上皮における単一細胞分裂のライブイメージング

学ぶOCTを用いたヒトドナー眼のマルチモーダルイメージングで加齢黄斑変性症の病態を詳細に可視化する手法。網膜構造の変化を捉え、治療開発に寄与する重要な知見を提供します。

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