Name: 高度に分極されたヒト網膜色素上皮培養におけるリポフスチンモデルの改善と外セグメント食能力の定量化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: 学ぶ 高度に分化したヒト網膜色素上皮培養におけるリポフスチン蓄積モデルの構築と、外節食作用総消費能アッセイによる貪食能の定量化手法。加齢黄斑変性の病態理解と治療標的発見に貢献します。

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この研究は、硝子体網膜外科財団(VRSF)、ファイト・フォー・サイト(FFS)、および国際網膜研究財団(IRRF)からの助成金によって部分的にサポートされています。J.M.L.M.は現在、国立眼科研究所からのK08助成金(EY033420)によってサポートされています。HFTの研究に連邦資金は使用されていません。さらなる支援は、Dry AMDのためのJames Grosfeld Initiativeと、次の民間ドナーであるBarbara DunnとDee & Dickson Brownからのものです。

レチナール色素上皮食作用とリポフスチン蓄積の定量化

著者は開示するものは何もありません。

RPEリポフスチンは何十年にもわたって研究されてきましたが、その毒性は議論されています2,9,16,42。動物モデル11からのリポフスチンの毒性についての曖昧さを考えると、ヒトRPEを用いたin vitroモデルは貴重です。さまざまなin vitroリポフスチン蓄積モデルが記載されているが、OS摂食と高度に成熟および分化したヒトRPE培養の両方を利用したものはありません。この組み合わせは、OS給餌がin vivoでのリポフスチン蓄積の方法を要約し、高度に成熟したヒトRPE培養がin vivoでのRPE挙動を最もよく再現するため、理想的なモデルを表しています。興味深いことに、高度に分化したhfRPE培養を利用した場合、反復給餌後でも、日常的なOS曝露はリポフスチン様物...

網膜色素上皮(RPE)は、感光体の外側セグメントの先端または断片の毎日の取り込みおよび分解を含む、上にある光受容体に対する重要なサポートを提供する(このプロトコル全体を通して、略語OSは、外側セグメント全体ではなくOSの先端または断片を表す)。有糸分裂後のRPEにおけるこの毎日の取り込みは、最終的に食性ソソーム能力を過負荷にし、リポフスチンと呼ばれる難消化性の自己蛍光性細胞内物質の蓄積につながります。興味深いことに、いくつかの研究はまた、RPEリポフスチンがOS貪食なしに蓄積できることを実証しています1,2。リポフスチンは、視覚周期レチノイドに由来する架橋付加物を含む多くの成分を有しており、80歳以上のRPE細胞体積のほぼ20%を占めることができる3。
リポフスチンが有毒であるかどうかは熱く議論されています。スターガルト病は、光受容体とRPEの常染色体劣性変性であり、ABCA4の変異が光受容体の外側セグメントに含まれる視覚周期レチノイドの不適切な処理を引き起こします。不適切なレチノイド処理は、異常な架橋と、ビス-レチノイドN-レチニリデン-N-レチニルエタノールアミン(A2E)を含むビス-レチノイド種の形成につながります。研究は、A2E毒性の複数のメカニズムを示しています4,5。リポフスチンは臨床イメージング中の眼底自己蛍光シグナルに寄与し、Stargardtの患者と動物モデルの両方が網膜変性の前に眼底自家蛍光の増加を示し、リポフスチンレベルと毒性との相関関係を示唆しています6,7。しかし、年齢とともに、リポフスチンはRPE変性を引き起こすことなくすべての人間に蓄積します。さらに、RPE変性が高齢患者にのみ起こる加齢黄斑変性症(AMD)では、初期および中間型の疾患を有する患者は、年齢を一致させた非疾患のヒトよりも眼底自己蛍光シグナルが少ない8。これらの臨床所見は、組織学的レベルでも検証されています9,10。
RPEリポフスチン蓄積の動物モデルも、リポフスチン毒性についていくつかの曖昧さを残しています。ABCA4ノックアウトマウスは、色素沈着した背景に網膜変性を示しませんが、アルビノの背景または青色光にさらされた場合に現れます11,12。さらに、ABCA4ノックアウトを介して誘導されるリポフスチンの毒性は、AMD13に見られるように、自然な老化に伴って生じるよりゆっくりと蓄積するリポフスチンとは異なる可能性があります。
リポフスチン蓄積のin vitroモデルは、RPEの健康に対するリポフスチン蓄積の影響を研究する代替手段を提供します。このようなモデルは、単一のレチノイド成分の給餌からOSの給餌まで、リポフスチン成分を操作することを可能にし、動物RPEではなくヒトでの研究を可能にする。過去数十年で、培養中のRPEリポフスチンをモデル化するための複数の方法が開発されてきました。他のグループとともに、ボールトン博士のグループは、4〜85歳のドナーからの継代4〜7個のヒト初代RPE細胞で最大3か月間、ウシOSを毎日給餌しました14。あるいは、オートファジーの阻害は、継代3〜7初代ヒトRPE培養物15におけるリポフスチン蓄積ももたらしている。しかし、高度に分化した継代1、初代ヒト出生前RPE(hfRPE)培養における亜致死的リソソーム阻害は、毎日OSを繰り返し添加してもリポフスチンを誘導できなかった16。
より還元主義的なアプローチとして、他の人は単一のリポフスチン成分、特にビスレチノイドA2E 4,17を培養物に与えました。このような研究は、個々のリポフスチン成分に対する毒性の潜在的な直接的なメカニズムを定義するという点で貴重であり、例えば、リソソームコレステロールおよびセラミド恒常性18を示唆する。同時に、A2E19の毒性については議論があり、それを細胞に直接供給することは、光受容体OSの食作用を伴うリポフスチン蓄積の典型的な経路を回避する。リポフスチンの全成分をRPE培養物に送達しようとして、ボールトンおよびマーシャルは、ヒトの目からリポフスチンを精製し、これを胎児および高齢のヒトドナーの両方に由来する継代4〜7ヒト一次RPE培養物に供給した20。この方法は革新的ですが、繰り返し実験するための限られたリポフスチン源を表しています。
RPE培養物へのOSの反復給餌は多くの系でリポフスチンを産生するが、高度に分化した初代RPE培養ではそうしない16。光酸化OSは、生体内のリポフスチン形成中に自然に起こるビスレチノイド形成のような架橋反応を誘導します。これは、高度に分化し、リポフスチン蓄積に耐性を有するものであっても、RPE培養系におけるリポフスチン様顆粒形成を加速することができる16。ここでは、高分化型hfRPEおよびヒトiPSC-RPEにおけるリポフスチン様顆粒蓄積を誘導する方法が紹介され、Wihlmarkの公開プロトコル21から改変される。この方法は、生体内のリポフスチン生成に対して起こるのと同じソース(視細胞OS)および経路(ファゴリソソームOS取り込み)を用いてリポフスチン様顆粒を誘導するという利点を有する。さらに、インビボでヒトRPEを複製するために、高度に分化され、複数の研究で検証されたヒトRPE培養で行われます22、23、24。 これらのリポフスチン様顆粒は、難消化性自己蛍光物質(UAM)と呼ばれ、UAMをin vivoリポフスチンと比較するこのプロトコルのデータと考察を提供します。 高度に分化したヒトRPEにおけるUAMを含む培養物の構築と評価の方法とともに、RPE OSの食作用を評価するための最新の方法も紹介されています。OS食作用を定量化するための複数の優れたパルスチェイス法が導入されており、ウェスタンブロッティング、免疫細胞化学、FACS25,26,27などが含まれています。しかし、OSパルスチェイスの早い段階では、OSの取り込み不良につながる条件と、内部化されたOSの急速な劣化を促進する条件が混同される可能性があります。ここで紹介する方法は、RPEによって完全に消費/低下された導入OSの総量(「総消費容量」)を測定し、このあいまいさを排除するのに役立ちます。「総消費容量」法によるOS貪食率への影響など、これらのプロトコルを活用したリポフスチン毒性に関する知見は、生体内でのリポフスチンの毒性を明らかにするために利用されることが期待されます。

<table><tbody><tr><td>100 mm Cell Culture dish</td><td>Corning</td><td>#353003</td><td>その他も使用</td></tr><tr><td>24-well Transwells</td><td>Corning</td><td>#3470</td><td></td></tr><tr><td>Anti-LC3 antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td> <td>#4801S</td><td>1:1000 希釈</td></tr><tr><td>Anti-rhodopsin antibody 1D4</td><td>Abcam</td><td>#5417</td><td>1:1000 希釈。エピトープはC端子です。</td></tr><tr><td>抗ロドプシン抗体 4D2</td><td>EnCor Biotech</td><td>MCA-B630</td><td>ウェスタンブロット用1:5000希釈、免疫染色用1:1000希釈。エピトープはN末端です。</td></tr><tr><td>自家蛍光クエンチャー</td><td>Biotium</td><td>#23007</td><td>TrueBlack リポフスチン 自家蛍光クエンチャー</td></tr><tr><td>自家蛍光クエンチャー</td><td>Vector Laboratories</td><td>SP-8400</td><td>Vector TrueVIEW 自家蛍光クエンチングキット</td></tr><tr><td>Bodipy 493/503</td><td>Life Technologies</td><td>D3922</td><td></td></tr><tr><td>コレステロールエステラーゼ&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>A12216キット</td><td></td>より</tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>ライカステラリス SP8 ファルコンモジュール</td><td></td></tr><tr><td>暗順適応ウシ網膜</td><td>W. L. ローソン社</td><td>暗順ウシ網膜(解剖済み)</td><td>連絡先: https://wllawsoncompany.com/ (402) 499-3161 stacy@wllawsoncompany.com</td></tr><tr><td>Filipin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4767</td><td></td></tr><tr><td>フローサイトメーター</td><td>Thermo Fisher</td><td>Attune NxT</td><td></td></tr><tr><td>フローサイトメーター解析ソフトウェア&nbsp;</td><td>BD</td><td>FlowJo</td><td></td></tr><tr><td>ハンドヘルドUVライト&nbsp;</td><td>Analytik Jena US</td><td>UVGL-55</td><td></td></tr><tr><td>ヒト MFG-E8</td><td>Sino Biological</td><td>10853-H08B</td><td></td></tr><tr><td>ヒト精製タンパク質</td><td>S 酵素研究所</td><td>HPS</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli サンプルバッファー</td><td>サーモフィッシャー</td><td>J60015-AD</td><td></td></tr><tr><td>LDHアッセイ Promega</td><td></td><td>J2380</td><td>LDH-Glo 細胞毒性アッセイ</td></tr><tr><td>封入剤</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td>Prolong Gold 退色防止試薬</td></tr><tr><td>Nile red</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#72485</td><td></td></tr><tr><td>ポリテトラフルオロエチレンコーティングスライド</td><td>Tekdon</td><td>カスタマイズ</td><td>仕様: 次の「カットアウト」を備えたPTFEマスク -&nbsp; 3つのガラス長方形、それぞれ17 mm x 9 mm、17 mmの辺がスライドの上部から4 mm、スライドの下部から4 mmになるように配置されています。 標準的な顕微鏡スライドを 25 mm x 75 mm と仮定します。各長方形は、他の長方形やスライドの端から少なくとも 6 mm 離して配置されています。スライドのラベリングを可能にするために、片面にすりガラスが付いているスライドにPTFEマスクを印刷します。</td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤&nbsp;</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#5872</td><td></td></tr><tr><td>Protein assay</td><td>Bio-Rad</td><td>#5000122 RC DC Protein assay</td><td></td></tr><tr><td>TEER electrode</td><td>World Precision Instruments</td><td>STX3</td><td></td></tr><tr><td>Trans-epithelial electrical resistance (TEER) meter</td><td>World Precision Instruments</td><td>EVOM3</td><td></td></tr><tr><td>Ultraviolet crosslinker device</td><td>Analytik Jena US</td><td>UVP CL-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

高度に分極されたヒト網膜色素上皮培養におけるリポフスチンモデルの改善と外セグメント食能力の定量化

Improved Lipofuscin Models and Quantification of Outer Segment Phagocytosis Capacity in Highly Polarized Human Retinal Pigment Epithelial Cultures

網膜色素上皮(RPE)による視細胞外側セグメントの毎日の食作用は、リポフスチンと呼ばれる細胞内老化色素の蓄積に寄与する。リポフスチンの毒性は、最も一般的な遺伝性網膜変性症であるスターガルト病で十分に確立されていますが、先進国における不可逆的な失明の主な原因である加齢黄斑変性症(AMD)ではより物議を醸しています。ヒトにおけるリポフスチン毒性を決定することは困難であり、Stargardtの動物モデルは毒性が限られている。したがって、in vivoでヒトRPEを模倣するin vitroモデルは、リポフスチンの生成、クリアランス、および毒性をよりよく理解するために必要です。これまでの細胞培養リポフスチンモデルの大部分は、細胞株内にあったか、またはRPEに光受容体外周セグメント全体の断片/先端ではなく、複雑なリポフスチン混合物の単一成分を供給し、より完全で生理学的なリポフスチンモデルを生成します。ここに記載されているのは、高度に分化した初代ヒト出生前RPE(hfRPE)および人工多能性幹細胞(iPSC)由来RPEにおいてリポフスチン様物質(難消化性自己蛍光物質、またはUAMと呼ばれる)の蓄積を誘導する方法である。UAMは、RPEが取り込んだ紫外線処理されたOSフラグメントを食作用によって繰り返し摂食することにより、培養物に蓄積されました。UAMがin vivoでリポフスチンに近似し、異なる主な方法についても説明します。リポフスチン様蓄積のこのモデルに伴い、UAM顆粒の広範な自家蛍光スペクトルを同時抗体染色と区別するためのイメージング方法が導入されています。最後に、RPE食作用能力に対するUAMの影響を評価するために、外側セグメントの断片/ヒントの取り込みと分解を定量化するための新しい方法が導入されました。「総消費能力」と呼ばれるこの方法は、従来の外部セグメント「パルスチェイス」アッセイに固有のRPE食作用能力の潜在的な誤解を克服します。ここで紹介するモデルと技術は、リポフスチンの生成とクリアランス経路、および推定毒性を研究するために使用できます。

OSの光酸化のセットアップを図1Aiに示します。ポリテトラフルオロエチレンコーティングされたスライドにより、スライドの残りの部分に広がることなく、開いた長方形ごとに大量の溶液中のOSをロードできます。OS付きのスライドは、蓋を外した滅菌ペトリ皿内に含まれ、図1Aiiに示すようにUVランプがスライドの上に置かれます。あるいは、スライドは、図1Aiiiに示すようにUV架橋剤装置に配置することができる。光酸化後、顕微鏡とフローサイトメトリーの両方で評価されるように、OSの自家蛍光は有意に増加します(図1B)。光酸化後のタンパク質架橋の程度は、ドミナントタンパク質バンド(単量体ロドプシン)の高次凝集体および塗抹標本への変換として示される、クマシー染色を用いたSDS-PAGEによって評価することができる(図1C)。ハンドヘルドUVランプによる光酸化(図...

このプロトコルでは、高度に分化および分極されたヒト網膜色素上皮(RPE)培養におけるリポフスチン蓄積モデルと、RPEの総OS消費/分解能力を検出するための改良された外部セグメント(OS)食作用アッセイについて説明します。これらの方法は、以前のリポフスチンモデルおよび古典的なパルスチェイス外セグメント食作用アッセイの限界を克服します。

The daily phagocytosis of photoreceptor outer segments by the retinal pigment epithelium (RPE) contributes to the accumulation of an intracellular aging ...

リポフスチンは加齢とともにRPEに普遍的に蓄積しますが、その毒性を識別することは困難でした。ここでは、高度に分極された成熟したRPE培養でリポフスチン様蓄積を発生させて、RPE生理学に対するリポフスチンの影響を識別するのに役立つプロトコルを開発します。ヒトにおけるリポフスチン毒性の研究は、RPEが死ぬにつれてリポフスチンが減少するという事実によって交絡している。リポフスチン毒性の動物モデルは、広く異なる結果をもたらしました。リポフスチン毒性の研究を容易にするために、リポフスチン様物質蓄積のin vitroモデルを慎重に作成しました。私たちのモデルの成功の鍵は、高度に分化した培養を維持しながら、in vivoでリポフスチンをトリガーするのと同じプロセス、つまり光受容体外節の食作用を介してリポフスチン発生を誘導することです。当社のin vitroプロトコルは、リポフスチン様物質が高度に分化したRPE培養物に蓄積し、in vivoでRPEを忠実に模倣するという点で独特です。このような状況において、RPE培養はリポフスチン蓄積およびリポフスチンによる毒性作用に対して高い耐性を有することを見出した。さらに、RPE培養におけるリポフスチン様蓄積によって誘導される表現型をアッセイする過程で、総消費能力と呼ばれる新しいタイプの食作用アッセイを作成しました。このアッセイにより、古典的なパルスチェイス食作用アッセイに伴う交絡解釈の一部を回避しながら、外側セグメントを食作用させるRPEの全能力を決定することができます。リポフスチン様物質蓄積のこのモデルを利用して、RPEストレッサーが通常不活性なリポフスチンをRPE細胞死においてより病理学的な役割に取り込む可能性があることをよりよく理解できることを嬉しく思います。

improved-lipofuscin-models-quantification-outer-segment-phagocytosis

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

この記事では、ホモジナイゼーションとショ糖勾配遠心分離を用いたブタ/ウシ網膜からの超遠心分離による光受容体外側セグメント断片(POS)の精製のためのプロトコルについて説明します。このプロトコルにより、標識付きまたは標識なしのPOSアリコートを大量に調製し、-80°Cで保存することができます。...

網膜色素上皮細胞に貪食アッセイのためにブタまたはウシの感光体外側セグメントの大規模精製

網膜色素上皮(RPE)は、リポフスチンとして蓄積する視覚サイクル副産物のリサイクルを通じて感覚網膜をサポートします。これらの製品は自家蛍光性であり、in...

網膜疾患の評価のための定量的眼底自己蛍光

このプロトコルは、2016年1年にフェルナンデス・ゴディーノらによって報告されたもので、トランスウェルプレート上で1週間以内に機能的で偏極したRPE単層を形成するマウスRPE細胞を効率的に単離および培養する方法を説明している。手続きには約3時間かかります。...

一次マウス網膜色素上皮細胞の効率的解離と培養

眼の網膜色素上皮層に影響を及ぼす変性眼疾患は、単一遺伝子および多遺伝子起源を有する。いくつかの疾患モデルとソフトウェアアプリケーションであるLipidUNetは、疾患のメカニズムと潜在的な治療介入を研究するために開発されました。...

LipidUNet-機械学習に基づくiPS細胞由来網膜色素上皮を用いた脂質沈着物のキャラクタリゼーション・定量法

この記事では詳細はマイクロインジェクション法を用いて偏光上皮細胞における低分子量GTPaseの過剰発現と解析に関わる手順を。...

偏上皮細胞へのプラスミドのマイクロインジェクションによる低分子量GTPaseの機能を解析する

Chirpが長い非コードRNAのゲノム結合部位（lncRNAs）をマッピングするための新規かつ迅速な手法である。メソッドは、lncRNAバインドされたゲノムサイトの列挙を許可するアンチセンスタイルオリゴヌクレオチドの特異性を利用しています。...

RNA精製によってクロマチンの単離（チャープ）

ゲインまたは機能喪失を媒介するためにレンチウイルスを用いて、毛包の再生モデルの組織特異的分析。...

髪の再生の間に上皮間葉シグナル伝達の迅速遺伝子解析

マイクロRNA（miRNAを）人為-多能性幹（IPS）細胞（IPS-RPE）、および胎児RPE由来のヒト誘起多能性幹（IPS）細胞、網膜色素上皮（RPE）のプロファイルは、比較した。...

ヒトiPS細胞のマイクロRNA発現プロファイル、IPから派生網膜色素上皮、および胎児の網膜色素上皮

網膜色素上皮細胞は乾燥加齢による黄斑変性症の高度なフォームのセル置換療法として役立つことができます。このプロトコルでは、地理的な萎縮の目の大きいモデルと病気のこのモデルにヒト胚性幹細胞由来網膜色素上皮細胞の網膜下移植の世代について説明します。...

地図状委縮の目の大きいモデルにヒト胚性幹細胞由来網膜色素上皮細胞の網膜下移植

網膜色素上皮 (RPE) は目の多機能上皮です。ここでマウスの網膜色素上皮から派生した一次電池文化を確立するためのプロトコルを提案する.

マウス網膜色素上皮からの一次電池文化

学ぶ 高度に分化したヒト網膜色素上皮培養におけるリポフスチン蓄積モデルの構築と、外節食作用総消費能アッセイによる貪食能の定量化手法。加齢黄斑変性の病態理解と治療標的発見に貢献します。

高度に分極されたヒト網膜色素上皮培養におけるリポフスチンモデルの改善と外セグメント食能力の定量化

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