エレクトロポレーションCas9-sgRNA複合体を用いた初代骨髄由来マクロファージの高効率遺伝子破壊
2023年8月4日
このプロトコルは生体 外で 組み立てられ、electroporationによって渡されるCas9-sgRNAのribonucleoproteinの複合体を使用してマウス骨髄得られたマクロファージのゲノム編集のためのプロシージャを記述する。
当研究室では、マイコバクテリウムと結核と宿主免疫系の相互作用について、細菌とマクロファージの初期相互作用に着目して研究しています。マクロファージには、RNAi技術やCRISPR技術など、さまざまな遺伝子破壊技術が使用されています。大きな課題の1つは、マクロファージの遺伝子破壊の効率が低いことです。
このプロトコルはクローニングおよびプラスミッドの構造のための必要性なしで第一次マクロファージの急速で、高性能の遺伝の処理を可能にする。これらの方法は、免疫学に広く適用でき、研究者がさまざまな研究のために一次マクロファージの遺伝子を破壊することを可能にします。
完全なトランスクリプトを表示し、数千本の科学動画にアクセス
概要
本プロトコルでは、Cas9-sgRNAリボ核タンパク質複合体を用いた、マウス骨髄由来マクロファージにおけるゲノム編集の手法について概説します。このアプローチにより、初代マクロファージにおける遺伝子操作の効率を高めることができます。
研究の主要構成要素
科学分野
- 免疫学
- 遺伝子工学
- マクロファージ生物学
背景
- マクロファージは免疫応答において極めて重要な役割を果たしています。
- マクロファージの機能を研究する上で、遺伝子破壊技術は不可欠です。
- 従来の手法は、効率が低いことが多いという課題があります。
- 本プロトコルでは、高効率な遺伝子操作を可能にすることで、これらの課題を解決します。
研究目的
- 初代マクロファージにおける遺伝子破壊効率を向上させること。
- クローニングなしで迅速な遺伝子操作を可能にすること。
- さまざまな免疫学的研究に適用可能な手法を提供すること。
使用した手法
- Cas9-sgRNAリボ核タンパク質複合体のin vitroでのアセンブリ。
- エレクトロポレーションによるこれらの複合体の導入。
- エレクトロポレーションの特定パラメータ（例：1,900 volts、20 milliseconds）の設定。
- マウス一次骨髄由来マクロファージへの適用。
主な結果
- マクロファージにおける極めて高い遺伝子破壊効率を実証した。
- プラスミドを必要としない迅速な遺伝子操作を可能にした。
- さまざまな免疫学的研究への幅広い適用性を示した。
結論
- 本プロトコルは、マクロファージにおける遺伝子操作のための信頼性の高い手法を提供する。
- 本手法は、従来の遺伝子破壊効率における課題を解決している。
- 研究者は、免疫学における多様な研究に本手法を活用することができる。
よくある質問
業界における重要性
骨髄由来マクロファージ（BMDMs）における効率的な遺伝子破壊は、疾患に関連する一次細胞において迅速かつ信頼性の高い機能ゲノミクスを可能にすることで、免疫学に焦点を当てた創薬における重大なボトルネックを解消します。本プロトコルの高い編集効率と合理化されたワークフローは、初期創薬の重要な局面における堅牢なターゲット検証およびメカニズムのリスク低減を支援します。このアプローチは、ポートフォリオの優先順位付けに対する予測信頼性を高め、遺伝学的な知見を実効性のある治療仮説へと変換することを加速させます。
バイオ製薬R&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 初代マクロファージにおける遺伝子機能を直接的に検証することが可能となり、メカニズムのデリスキングを支援します。
- 生理学的に適切なシステムにおいて、治療標的の迅速なバリデーションを促進します。
- パスウェイの解明に向けた、信頼性の高い機能喪失（loss-of-function）研究をサポートします。
- 後続のポートフォリオ決定における予測価値を向上させます。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- ダウンストリームの表現型スクリーニングに向けた、検証済みの一次細胞系を調製します。
- アッセイの標準化のために、再現性のある定量的な遺伝子破壊出力を提供します。
- 反復的なスクリーニングキャンペーンに適した、スケーラブルでプラスミドフリーのワークフローを可能にします。
- 編集済みマクロファージにおける化合物の影響を信頼性高く評価することをサポートします。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 疾患に関連するマクロファージ生物学と遺伝子操作を整合させ、トランスレーショナルな連続性を確保します。
- 定義された遺伝子編集を施した初代細胞を用いて、前臨床モデルの開発を促進します。
- 初代細胞系において探索と前臨床検証を橋渡しすることで、生物学的リスクを低減します。
- 免疫学パイプラインにおけるバイオマーカーの探索およびメカニズム研究を支援します。
パイプラインおよびワークフローの統合
このエレクトロポレーションを用いたCRISPRワークフローは、初期の探索およびターゲット検証段階に組み込まれ、免疫学に焦点を当てたパイプラインにおけるリード化合物の同定および前臨床研究へのシームレスな移行を可能にします。
- 探索生物学：初代マクロファージにおける仮説検証およびパスウェイ解析を支援します。
- スクリーニング：アッセイへの適用に向けた、再現性のある定量的な遺伝子破壊を実現します。
- 分析：サンガーシーケンシングに基づいた編集効率の測定により、条件間の比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：遺伝学的研究に初代細胞を使用することで、疾患との関連性を維持します。
- エンタープライズでの再利用：免疫学プロジェクト全般に適用可能な、標準化され汎用性の高い遺伝子操作プロトコルを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： ターゲットバリデーションにおける予測の信頼性を高め、メカニズム上の曖昧さを軽減します。
- 運用の価値： 高い効率性と再現性を備え、プラスミド構築が不要なため、ワークフローを合理化します。
- 戦略的価値： より迅速なゴー/ノーゴーの判断と、資本効率の高いリソース配分を可能にします。
- ポートフォリオへの影響： リスク調整後の優先順位付けと、免疫学資産の推進をサポートします。
実施上の検討事項
- 初代細胞のハンドリングおよびCRISPR RNPアセンブリに関する専門知識が必要です。
- エレクトロポレーション機器およびサンガーシーケンシングのインフラへのアクセスが必要です。
- 多施設共同研究における再現性を確保するため、チーム間での標準化が求められます。
- 他の初代細胞種または種への適応が必要な場合があります。
- 編集効率および生存率は、各標的遺伝子について経験的に検証される必要があります。
