Name: エレクトロポレーションCas9-sgRNA複合体を用いた初代骨髄由来マクロファージの高効率遺伝子破壊 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-04T14:50:00.000+00:00
Duration: 4 min 51 s
Description: 学ぶ エレクトロポレーションを用いたCas9-sgRNA複合体によるマウス初代骨髄由来マクロファージの高効率遺伝子破壊法。この手法はクローニング不要で迅速な遺伝子操作を可能にし、免疫学研究に広く応用できます。

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この研究は、NIHの助成金5R01AI144149によって資金提供されました。回路図はBioRenderで作成しました。

原発性骨髄由来マクロファージにおける精密な遺伝子破壊のガイド

<ol><li>Murray, P. J., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+and+pathogenic+functions+of+macrophage+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Protective and pathogenic functions of macrophage subsets.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).</li>
<li>Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+biology+in+development%2C+homeostasis%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Macrophage biology in development, homeostasis, and disease.</a> Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).</li>
<li>Paddison, P. J., Caudy, A. A., Hannon, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+suppression+of+gene+expression+by+RNAi+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Stable suppression of gene expression by RNAi in mammalian cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (3), 1443-1448 (2002).</li>
<li>Laugel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+isogenic+cells+deficient+for+MR1+with+a+CRISPR%2FCas9+lentiviral+system%3A+Tools+to+study+microbial+antigen+processing+and+presentation+to+human+MR1-restricted+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Engineering of isogenic cells deficient for MR1 with a CRISPR/Cas9 lentiviral system: Tools to study microbial antigen processing and presentation to human MR1-restricted T cells.</a> The Journal of Immunology. 197 (3), 971-982 (2016).</li>
<li>Andreu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+macrophages+and+J774+cells+respond+differently+to+infection+with+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Primary macrophages and J774 cells respond differently to infection with Mycobacterium tuberculosis.</a> Scientific Reports. 7, 42225(2017).</li>
<li>Roberts, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9%2B+conditionally-immortalized+macrophages+as+a+tool+for+bacterial+pathogenesis+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Cas9+ conditionally-immortalized macrophages as a tool for bacterial pathogenesis and beyond.</a> eLife. 8, e45957(2019).</li>
<li>Oberdoerffer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficiency+of+RNA+interference+in+the+mouse+hematopoietic+system+varies+between+cell+types+and+developmental+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Efficiency of RNA interference in the mouse hematopoietic system varies between cell types and developmental stages.</a> Molecular and Cellular Biology. 25 (10), 3896-3905 (2005).</li>
<li>Ma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YTHDF2+orchestrates+tumor-associated+macrophage+reprogramming+and+controls+antitumor+immunity+through+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">YTHDF2 orchestrates tumor-associated macrophage reprogramming and controls antitumor immunity through CD8+ T cells.</a> Nature Immunology. 24 (2), 255-266 (2023).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li>
<li>Cho, S. W., Kim, S., Kim, J. M., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+genome+engineering+in+human+cells+with+the+Cas9+RNA-guided+endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease.</a> Nature Biotechnology. 31 (3), 230-232 (2013).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-programmed+genome+editing+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">RNA-programmed genome editing in human cells.</a> eLife. 2, e00471(2013).</li>
<li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).</li>
<li>Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+homology-directed+human+genome+engineering+by+controlled+timing+of+CRISPR%2FCas9+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery.</a> eLife. 3, 04766(2014).</li>
<li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Research. 42 (22), e168(2014).</li>
<li>Craft, J. CRISPR-Cas9-mediated genome editing in primary murine bone marrow-derived macrophages. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22University+of+California%2C+Davis%22">University of California, Davis</a>. , Master's thesis (2022).</li>
<li>Herb, M., Farid, A., Gluschko, A., Krönke, M., Schramm, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+transfection+of+primary+macrophages+with+in+vitro+transcribed+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Highly efficient transfection of primary macrophages with in vitro transcribed mRNA.</a> Journal of Visualized Experiments. (153), e60143(2019).</li>
<li>Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+delivery+of+Cas9+protein%2FgRNA+complexes+using+lipofectamine+CRISPRMAX%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Letters%22%5BJournal%5D)">Improved delivery of Cas9 protein/gRNA complexes using lipofectamine CRISPRMAX.</a> Biotechnology Letters. 38 (6), 919-929 (2016).</li>
</ol>

著者は何も開示していません。

エレクトロポレーションCas9-sgRNA複合体を用いたゲノム編集は、BMDMの遺伝子機能を効果的に破壊することを可能にします。編集効率は、標的配列や遺伝子によって異なります。典型的には、4〜5個のsgRNAをスクリーニングして、活性の高いものを同定する。一部の遺伝子座は編集効率が低く、おそらくクロマチン構造が原因です。このような場合は、編集効率を高めるためにいくつかの変更を加えることができます。2つの活性型sgRNAを同じエクソンに共送することで、一部の遺伝子の編集が改善されます。ただし、2つのガイドを同時トランスフェクションすると、TIDEの精度が低下する可能性があることが観察されています。そのため、ウェスタンブロッティングなどの編集を評価するための代替技術が必要になる場合があります。さらに、市販のNHEJエンハンサーを含めると、編集効率が~20%向上することがよくあります(図3)。
このアプローチにはいくつかの利点があります。sgRNA-Cas9を細胞に直接送達するには、BMDMを形質導入するためのプラスミド構築やレ...

マクロファージは、組織の修復と免疫に重要な役割を果たす自然免疫細胞です1,2。マウスRAW 264.7細胞やヒトTHP-1細胞などの不死化マクロファージ細胞株は、RNA干渉またはCRISPR/Cas9 3,4用のベクターを送達することによる、堅牢な増殖や遺伝子破壊の容易さなど、いくつかの有益な特性を持っています。しかし、発がん性形質転換はそれらの生理機能を劇的に変化させ、その結果、いくつかの経路の異常な活性化と他の経路の応答の抑制が生じます5,6。初代骨髄由来マクロファージ(BMDM)は、in vivoマクロファージの生理機能をより厳密に再現しているが、これらの初代免疫細胞におけるプラスミドトランスフェクションとウイルス形質導入の両方の効率が低いため、遺伝子操作は依然として困難である7,8。したがって、遺伝子機能を破壊するためのより効率的な方法が必要です。
CRISPR/Cas9ゲノム編集は、哺乳類細胞を含むさまざまな生物学的システムにわたる遺伝子操作のための強力なツールである9,10,11,12。化膿連鎖球菌Cas9タンパク質は、配列特異的なガイドRNAと複合体を形成すると、二本鎖DNAを効率的かつ特異的に切断します。切断されたDNAの非相同末端結合(NHEJ)によるDNA修復は、フレームシフト変異を引き起こす小さな挿入または欠失(インデル)をもたらします。初期の研究では、Cas9とsgRNAはプラスミドまたはレンチウイルスベクターを介して送達され、これらは多くの細胞株に効果的な送達方法である9,10。しかし、初代細胞、特に初代免疫細胞は、トランスフェクションまたは形質導入によるベクター送達の効率が低いため、これらの方法に抵抗性を示すことがよくあります。その後、in vitroでsgRNA-Cas9複合体を作製し、エレクトロポレーションを介して送達する方法が開発され、これらの方法はさまざまな細胞タイプで高効率を達成しています13,14。この結果は、このアプローチを用いて初代マクロファージのゲノム編集を行う可能性を示唆しています。
ここでは、sgRNA-Cas9リボ核タンパク質複合体(RNP)を使用して一次BMDMでゲノム編集を行うためのプロトコルを提供します。これには、初代免疫細胞に存在する免疫センサーの活性化を緩和する手順が含まれており、最小限の毒性で標的遺伝子座で最大95%の編集が可能です。このプロトコルには、ルーチンのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)およびサンガーシーケンシングを使用して編集効率を評価するワークフローも含まれており、その後、十分に検証されたオンラインソフトウェアツールである分解によるインデルの追跡(TIDE)15によるin silico分析が行われます。

<table><tbody><tr><td>ラッセル・バンスからの</td><td>3T3-MCSF細胞株</td>ギフト 該当<td>なし</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R Cas9 エレクトロポレーション・エンハンサー</td><td>IDT</td><td>1075915</td><td></td></tr><tr><td>Ampure XP 試薬ビーズ</td><td>ベックマン・コールター</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>子牛腸内アルカリホスファターゼ</td><td>NEB</td><td>M0525S</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>NEB</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>DPBS +Ca/Mg (0.9mMCaCl2 および 0.5mM MgCl2)</td><td>Thermo Fisher</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>DPBS -Ca/Mg</td><td>Thermo Fisher</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>ExoI</td><td>NEB</td><td>M0293S</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Calf Serum (FCS)</td><td>Corning</td><td>35-015-CV</td><td></td></tr><tr><td>Herculase DNA ポリメラーゼ & バッファー</td><td>Agilent</td><td>600677</td><td></td></tr><tr><td>HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit</td><td>NEB</td><td>E2040S</td><td></td></tr><tr><td>LoBindコニカルチューブ 15 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30122216</td><td></td></tr><tr><td>LoBind Eppendorf チューブ 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22431102</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer r2.1</td><td>NEB</td><td>B6002S</td><td></td></tr><tr><td>ネオントランスフェクションシステム</td><td>サーモフィッシャー</td><td>MPK5000、MPP100、MPS100</td><td></td></tr><tr><td>ネオントランスフェクションシステム 10 uL チップ</td><td>サーモフィッシャー</td><td>MPK1025またはMPK1096</td><td></td></tr><tr><td>PBS + 1mM EDTA</td><td>ロンザ</td><td>BE02017F</td><td></td></tr><tr><td>プロテイナーゼ K</td><td>サーモフィッシャー</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>rCutSmart バッファー ExoI</td><td>NEB</td><td>B6004S</td><td></td></tr><tr><td>リボロック</td><td>サーモフィッシャー</td><td>EO0384</td><td></td></tr><tr><td>RNA ローディング色素</td><td>NEB</td><td>B0363S</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>S.pyogenes Cas9-NLS</td><td>カリフォルニア大学マクロラボ</td><td></td> 対象外 <td>UC以外の研究者は、以下の方法で入手可能です。https://qb3.berkeley.edu</td></tr><tr><td>S. pyogenes Cas9-NLS, modified 3rd Generation</td><td>IDT</td><td>1081059</td><td></td></tr><tr><td>SAP</td><td>NEB</td><td>M0371S</td><td></td></tr></tbody></table>

エレクトロポレーションcas9-sgrna複合体を用いた初代骨髄由来マクロファージの高効率遺伝子破壊

High-Efficiency Gene Disruption in Primary Bone Marrow-Derived Macrophages Using Electroporated Cas9-sgRNA Complexes

マウス由来の骨髄由来マクロファージ(BMDM)は、組織マクロファージの複雑な生物学を研究するための重要なツールです。初代細胞として、不死化マクロファージ細胞株よりもin vivo でのマクロファージの生理機能を忠実にモデル化し、すでに定義された遺伝的変化を持つマウスに由来することができます。しかし、BMDMの遺伝子機能を破壊することは、依然として技術的に困難である。ここでは、遺伝子機能を破壊するフレームシフト変異をもたらす小さな挿入および欠失(インデル)の導入を可能にする、BMDMにおける効率的なCRISPR/Cas9ゲノム編集のプロトコルを提供します。プロトコルは単一ガイドRNA (sgRNA-Cas9)を総合し、electroporationによって渡すことができる浄化されたsgRNA-Cas9のribonucleoproteinの複合体(RNPs)を形作る方法を記述する。また、ルーチンのサンガーシーケンシングと無料で入手できるオンライン分析プログラムを使用して、編集効率を監視するための効率的な方法も提供します。プロトコルは1週間以内に実施でき、プラスミド構築は必要ありません。通常、85%から95%の編集効率が得られます。

IVT テンプレートは 127 bp の PCR 産物です(図 1B)。完全長IVT産物は98 nt RNAで、70 bpの二本鎖DNA断片と同様に遊走します(図1C)。
エレクトロポレーション後、細胞は&gt;90%生存可能であり、総細胞数は開始細胞数の&gt;70%である必要があります。結果として生じる変異細胞のプールは、Cas9切断部位の近くから始まる多様なインデルのセットを持つはずです。PCRおよびサンガーシーケンシングによる標的遺伝子の解析により、Cas9切断部位の下流の各位置に複数のヌクレオチドが見られるはずです(図2)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65264/6...

このプロトコルは生体 外で 組み立てられ、electroporationによって渡されるCas9-sgRNAのribonucleoproteinの複合体を使用してマウス骨髄得られたマクロファージのゲノム編集のためのプロシージャを記述する。

エレクトロポレーションCas9-sgRNA複合体を用いた初代骨髄由来マクロファージの高効率遺伝子破壊

Bone marrow-derived macrophages (BMDMs) from mice are a key tool for studying the complex biology of tissue macrophages. As primary cells, they model the ...

当研究室では、マイコバクテリウムと結核と宿主免疫系の相互作用について、細菌とマクロファージの初期相互作用に着目して研究しています。マクロファージには、RNAi技術やCRISPR技術など、さまざまな遺伝子破壊技術が使用されています。大きな課題の1つは、マクロファージの遺伝子破壊の効率が低いことです。このプロトコルはクローニングおよびプラスミッドの構造のための必要性なしで第一次マクロファージの急速で、高性能の遺伝の処理を可能にする。これらの方法は、免疫学に広く適用でき、研究者がさまざまな研究のために一次マクロファージの遺伝子を破壊することを可能にします。

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Genetics

遺伝学

CRISPR/Cas9 を使用して、編集対象となる遺伝子は、遺伝子の生物機能の理解を促進しています。ここでは、その発癌性の活動を研究するためにサイトカイン依存性造血細胞のモデル カルレティキュリン変異に CRISPR/Cas9...

CRISPR/Cas9 を使用して遺伝子変異カルレティキュリン サイトカイン依存性造血細胞での発癌性の活動を調査する編集

高速のためのプロトコル マウスに CRISPR/Cas9 を介した遺伝子破壊とひと造血細胞はこの資料に記載されています。Cas9 sgRNA ribonucleoproteins は、sgRNAsの in vitro転写と商業 Cas9...

CRISPR/Cas9 によるマウスおよび人間の造血前駆細胞の高効率遺伝子破壊

ここでは、 Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/結合) を使用してプライマリまたは拡張された人間の自然なキラー (NK) 細胞を遺伝的に変更するためのプロトコルを提案する.このプロトコルを使用して、我々 はヒト NK 細胞 (TGFBR2) -b の成長因子受容体 2 の変換のし、ヒポキサンチン phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1)...

Cas9 Ribonucleoproteins を使用してノックアウト プライマリおよび拡張された人間の NK 細胞の生成

ここに提示されるプロトコルは、CAS9-gRNA複合体を脊髄中央管に注入し、続いてエレクトロポレーションを行うことによって、軸総便脊髄の時間および空間制限遺伝子ノックアウトを行うプロトコルである。...

CAS9タンパク質-gRNA複合体のエレクトロポレーションによるアクソロトル脊髄神経幹細胞の直接遺伝子ノックアウト

CRISPR/Cas9システムによるマウス造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)の高効率ゲノム編集のためのプロトコルは、造血系特異的遺伝子改変を用いたマウスモデルシステムを迅速に開発する。...

疾患モデルにおける血化細胞の研究のためのレンチウイルスCRISPR/Cas9媒介ゲノム編集

このプロトコルは、蛍光レポーターと細胞分類を使用して、マクロファージおよびT細胞株におけるノックイン実験を簡素化します。これらの単純なノックイン実験、すなわちCRISPR/Cas9-およびDsRed2発現プラスミドと、免疫細胞内の Rosa26...

CRISPR/Cas9による遺伝子ノックインとマクロファージおよびT細胞株における細胞分類

提示された方法は、高効率のレンチウイルス媒介遺伝子送達システムを使用して、L2HGDH遺伝子を標的とするsgRNAを安定的に発現するヒト胚性幹細胞(hESC)株H9におけるCRISPR媒介遺伝子ノックアウトの生成を説明するものです。...

フィーダーフリー条件下で培養したヒト多能性幹細胞におけるCRISPR-Cas9媒介遺伝子欠失

THP-1細胞株は、さまざまな生物学関連研究領域において、ヒト単球/マクロファージの機能を調べるためのモデルとして広く使用されています。この記事では、効率的なCRISPR-Cas9ベースのエンジニアリングとシングルセルクローン単離のためのプロトコルについて説明し、堅牢で再現性のある表現型データの生成を可能にします。...

エレクトロポレーションに基づくTHP-1細胞におけるCRISPR-Cas9媒介遺伝子ノックアウトとシングルセルクローン単離

ここでは、ヒト膵島細胞と初代筋管の概日生物発光と分泌活性を並行して監視するための設定について説明します。このために、ルシフェラーゼコアクロックレポーターのレンチウイルス遺伝子導入を採用し、続いてin...

ヒト初代細胞培養物における概日時計遺伝子発現やホルモン分泌のパラレル測定

私たちは、増幅を必要とせずに生物学的基質中の分子をバーコード化し、カウントすることにより遺伝子発現を定量化するマルチプレックスハイスループット遺伝子発現プラットフォームの使用について説明します。このプラットフォームを使用して、過敏性腸症候群の有無にかかわらず、全血中のマイクロRNA(miRNA)発現を定量しました。...

過敏性腸症候群におけるmiRNA循環の摂動は多重化ハイスループット遺伝子発現プラットフォームを使用して検出します

学ぶ エレクトロポレーションを用いたCas9-sgRNA複合体によるマウス初代骨髄由来マクロファージの高効率遺伝子破壊法。この手法はクローニング不要で迅速な遺伝子操作を可能にし、免疫学研究に広く応用できます。

エレクトロポレーションCas9-sgRNA複合体を用いた初代骨髄由来マクロファージの高効率遺伝子破壊

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