Name: 線虫の世代間エピジェネティック遺伝の蛍光レポーターとクロマチン免疫沈降(ChIP)による解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-05T12:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: 学ぶRNAi遺伝とクロマチン修飾の解析法。C. elegansを用いた蛍光レポーターとChIPアッセイで、世代間エピジェネティック継承のメカニズムを解明する標準化プロトコルを紹介します。

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私たちは、ツールを開発および共有し、その研究がこの原稿で引用されている C.エレガンス コミュニティの研究室に感謝したいと思います。一部の株は、NIH Office of Research Infrastructure Programs(P40 OD010440)から資金提供を受けているCGCによって提供されました。この研究は、カナダ衛生研究所(CIHR)のA.L.S.へのプロジェクト助成金(PJT-175245)の支援を受けました。CLは、カナダ自然科学工学研究評議会(NSERC)の大学院奨学金(PGS-D)の支援を受けています。

線虫Caenorhabditis elegansにおけるエピジェネティックな遺伝とChIP

<ol><li>Alcazar, R. M., Lin, R., Fire, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+dynamics+of+heritable+silencing+induced+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Transmission dynamics of heritable silencing induced by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 180 (3), 1275-1288 (2008).</li>
<li>Ashe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piRNAs+can+trigger+a+multigenerational+epigenetic+memory+in+the+germline+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">piRNAs can trigger a multigenerational epigenetic memory in the germline of C. elegans.</a> Cell. 150 (1), 88-99 (2012).</li>
<li>Buckley, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nuclear+Argonaute+promotes+multigenerational+epigenetic+inheritance+and+germline+immortality%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A nuclear Argonaute promotes multigenerational epigenetic inheritance and germline immortality.</a> Nature. 489 (7416), 447-451 (2012).</li>
<li>Vastenhouw, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+gene+silencing+by+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Long-term gene silencing by RNAi.</a> Nature. 442 (7105), 882(2006).</li>
<li>Lee, H. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+piRNAs+mediate+the+genome-wide+surveillance+of+germline+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">C. elegans piRNAs mediate the genome-wide surveillance of germline transcripts.</a> Cell. 150 (1), 78-87 (2012).</li>
<li>Luteijn, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extremely+stable+Piwi-induced+gene+silencing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Extremely stable Piwi-induced gene silencing in Caenorhabditis elegans.</a> The EMBO Journal. 31 (16), 3422-3430 (2012).</li>
<li>Sapetschnig, A., Sarkies, P., Lehrbach, N. J., Miska, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tertiary+siRNAs+mediate+paramutation+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Tertiary siRNAs mediate paramutation in C. elegans.</a> PLoS Genetics. 11 (3), e1005078(2015).</li>
<li>Shirayama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piRNAs+initiate+an+epigenetic+memory+of+nonself+RNA+in+the+C.+elegans+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">piRNAs initiate an epigenetic memory of nonself RNA in the C. elegans germline.</a> Cell. 150 (1), 65-77 (2012).</li>
<li>Minkina, O., Hunter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+heritable+germline+silencing+directs+somatic+silencing+at+an+endogenous+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Stable heritable germline silencing directs somatic silencing at an endogenous locus.</a> Molecular Cell. 65 (4), 659-670 (2017).</li>
<li>Seroussi, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+epigenetic+regulation+by+C.+elegans+nuclear+RNA+interference+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of epigenetic regulation by C. elegans nuclear RNA interference pathways.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 127, 142-154 (2022).</li>
<li>Lev, I., Gingold, H., Rechavi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H3K9me3+is+required+for+inheritance+of+small+RNAs+that+target+a+unique+subset+of+newly+evolved+genes%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">H3K9me3 is required for inheritance of small RNAs that target a unique subset of newly evolved genes.</a> eLife. 8, e40448(2019).</li>
<li>Woodhouse, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modifiers+SET-25+and+SET-32+are+required+for+establishment+but+not+long-term+maintenance+of+transgenerational+epigenetic+inheritance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Chromatin modifiers SET-25 and SET-32 are required for establishment but not long-term maintenance of transgenerational epigenetic inheritance.</a> Cell Reports. 25 (8), 2259-2272 (2018).</li>
<li>Houri-Zeevi, L., Teichman, G., Gingold, H., Rechavi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+resets+ancestral+heritable+small+RNA+responses%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Stress resets ancestral heritable small RNA responses.</a> eLife. 10, e65797(2021).</li>
<li>Houri-Ze'evi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tunable+mechanism+determines+the+duration+of+the+transgenerational+small+RNA+inheritance+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A tunable mechanism determines the duration of the transgenerational small RNA inheritance in C. elegans.</a> Cell. 165 (1), 88-99 (2016).</li>
<li>Spracklin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNAi+inheritance+machinery+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The RNAi inheritance machinery of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 206 (3), 1403-1416 (2017).</li>
<li>Perales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenerational+epigenetic+inheritance+is+negatively+regulated+by+the+HERI-1+chromodomain+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Transgenerational epigenetic inheritance is negatively regulated by the HERI-1 chromodomain protein.</a> Genetics. 210 (4), 1287-1299 (2018).</li>
<li>Shukla, A., Perales, R., Kennedy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piRNAs+coordinate+poly%28UG%29+tailing+to+prevent+aberrant+and+perpetual+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">piRNAs coordinate poly(UG) tailing to prevent aberrant and perpetual gene silencing.</a> Current Biology. 31 (20), 4473-4485 (2021).</li>
<li>Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+GeneticsWormBook%3A+the+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Reverse GeneticsWormBook: the Online Review of C. elegans Biology.</a> WormBook. , https://www.ncbi.nim.nih.gov/books/NBK19711/ (2006).</li>
<li>Rivera Gomez, K., Schvarzstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+of+nematodes+for+live+imaging+using+an+agarose+pad+produced+with+a+Vinyl+Record%5BTitle%5D)+AND+%22microPublication+Biology%22%5BJournal%5D)">Immobilization of nematodes for live imaging using an agarose pad produced with a Vinyl Record.</a> microPublication Biology. 2018, (2018).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+The+Online+Review+of+C.+Elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. Elegans Biology. , 1-11 (2006).</li>
<li>Askjaer, P., Ercan, S., Meister, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+techniques+for+the+analysis+of+chromatin+and+nuclear+organization+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+the+Online+Review+of+C.+elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">Modern techniques for the analysis of chromatin and nuclear organization in C. elegans.</a> WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-35 (2014).</li>
<li>Gu, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplification+of+siRNA+in+Caenorhabditis+elegans+generates+a+transgenerational+sequence-targeted+histone+H3+lysine+9+methylation+footprint%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Amplification of siRNA in Caenorhabditis elegans generates a transgenerational sequence-targeted histone H3 lysine 9 methylation footprint.</a> Nature Genetics. 44 (2), 157-164 (2012).</li>
<li>Kalinava, N., Ni, J. Z., Peterman, K., Chen, E., Gu, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoupling+the+downstream+effects+of+germline+nuclear+RNAi+reveals+that+H3K9me3+is+dispensable+for+heritable+RNAi+and+the+maintenance+of+endogenous+siRNA-mediated+transcriptional+silencing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+%26+Chromatin%22%5BJournal%5D)">Decoupling the downstream effects of germline nuclear RNAi reveals that H3K9me3 is dispensable for heritable RNAi and the maintenance of endogenous siRNA-mediated transcriptional silencing in Caenorhabditis elegans.</a> Epigenetics & Chromatin. 10, 6(2017).</li>
<li>Kalinava, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((elegans+heterochromatin+factor+SET-32+plays+an+essential+role+in+transgenerational+establishment+of+nuclear+RNAi-mediated+epigenetic+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">elegans heterochromatin factor SET-32 plays an essential role in transgenerational establishment of nuclear RNAi-mediated epigenetic silencing.</a> Cell Reports. 25 (8), 2273-2284 (2018).</li>
<li>Lev, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MET-2-dependent+H3K9+methylation+suppresses+transgenerational+small+RNA+inheritance%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">MET-2-dependent H3K9 methylation suppresses transgenerational small RNA inheritance.</a> Current Biology. 27 (8), 1138-1147 (2017).</li>
<li>Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biology. 2 (1), (2001).</li>
<li>Xu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cytoplasmic+Argonaute+protein+promotes+the+inheritance+of+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A cytoplasmic Argonaute protein promotes the inheritance of RNAi.</a> Cell Reports. 23 (8), 2482-2494 (2018).</li>
<li>Grishok, A., Tabara, H., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+requirements+for+inheritance+of+RNAi+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genetic requirements for inheritance of RNAi in C. elegans.</a> Science. 287 (5462), 2494-2497 (2000).</li>
<li>Houri-Zeevi, L., Korem Kohanim, Y., Antonova, O., Rechavi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+rules+explain+transgenerational+small+RNA+inheritance+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Three rules explain transgenerational small RNA inheritance in C. elegans.</a> Cell. 182 (5), 1186-1197 (2020).</li>
<li>Burton, N. O., Burkhart, K. B., Kennedy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+RNAi+maintains+heritable+gene+silencing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Nuclear RNAi maintains heritable gene silencing in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (49), 19683-19688 (2011).</li>
<li>Mao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nrde+pathway+mediates+small-RNA-directed+histone+H3+lysine+27+trimethylation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The Nrde pathway mediates small-RNA-directed histone H3 lysine 27 trimethylation in Caenorhabditis elegans.</a> Current Biology. 25 (18), 2398-2403 (2015).</li>
<li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Research. 22 (9), 1813-1831 (2012).</li>
<li>Mukhopadhyay, A., Deplancke, B., Walhout, A. J. M., Tissenbaum, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+%28ChIP%29+coupled+to+detection+by+quantitative+real-time+PCR+to+study+transcription+factor+binding+to+DNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation (ChIP) coupled to detection by quantitative real-time PCR to study transcription factor binding to DNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Protocols. 3 (4), 698-709 (2008).</li>
</ol>

すべての著者は、開示すべき競合がないことを確認します。

このプロトコルでは、dsRNAはC.のelegans18の標準的な方法になった供給によってもたらされる。RNAi遺伝アッセイでは、給餌法により、大きなP0集団2,11,12,22,23,24,25を得る簡単な方法が提供されます。しかし、RNAi曝露のタイミングと期間は導入遺伝子サイレンシングの有効性に影響し26、RNAi細菌の濃度は遺伝性RNAiサイレンシングの持続性に影響を与える1。したがって、標準化されたRNAi細菌と線虫の増殖は、一貫したレベルのGFPサイレンシングと遺伝期間を得るために重要です。ここでは、胚をRNAiプレートに播種し、P0動物が孵化時からRNAi細菌に曝露されるようにします。別のアプローチでは、同期したL1 24,27またはL4 25ステージの動物をRNAi-NGMプレートに播種しました。さらに、飢餓やその他のストレスはRNAi遺伝の維持に影響を与えるため13、過密状態や食料供給の枯渇を防ぐためにプレートを監視する必要がある。摂食によるRNAiの開始の代替として、先駆的なC.エレガンスのRNAi遺伝研究のいくつかは、dsRNA濃度のより優れた制御を提供する生殖腺注入によってRNAiを誘導しました1,28。
このプロトコルでは、各世代は、前述のように、次亜塩素酸アルカリ処理を施した集団として継代されます16,22,23,24。次亜塩素酸塩処理は、F1世代が親環境からのRNAi細菌で汚染されないことを保証し22、潜在的な望ましくない集団のボトルネックを防ぎます。しかし、個々の動物が異なる遺伝パターンを有する場合があるため、バルク継代も制限となる可能性がある1,29。各世代を確立する別の方法は、個々の動物を選択することです1,2,9,11,25。このアプローチにより、系統内の表現型を追跡し、遺伝的交配を取り込むことができます。系統分析は、低浸透度の表現型にも有利であり得る12。
蛍光タンパク質の発現は、RNAi誘導サイレンシング2,3,4,12,14,15,16,25,30の強力で便利な読み出しです。このプロトコルに記載されているように、GFP発現は、11、12、15、16、25のONまたはOFFとして手動でスコアリングできます。手動採点は、定性的な強度レベル3、4、14を割り当てることでさらに洗練させることができます。あるいは、顕微鏡画像11、12、14、25、27の自動強度スコアリングまたは生きた動物のフローサイトメトリー蛍光測定2は、定量的でハイスループットな読み出しを提供することができる。しかし、レポーターの発現は生殖細胞系に限定されているため、自動化されたアプローチの注意点は、特に生殖細胞の発達が異常な変異体を研究に組み込んでいる場合、GFP発現がサイレンシングされている動物と生殖細胞系のない動物も区別する必要があることです。GFP蛍光の代替として、逆転写(RT)-qPCRを使用して、RNAiターゲットのpre-mRNAおよびmRNAレベルを定量できます2,16,23,24。このアプローチは、RNAを標的とするサイレンシングのより直接的な読み出しを提供し、サイレンシングによって目に見える表現型が得られない他のRNAiターゲットに特に有用です。人工GFPレポーターを用いることの限界は、外因性配列と内因性配列がトランスジェネレーションRNAiで異なるように制御されていることである11。したがって、温度感受性胚致死対立遺伝子oma-1(zu405)1,11,16,25などの内因性標的を用いた研究は、蛍光導入遺伝子レポーターの補完的なアプローチとして検討されるべきです。
RNAi遺伝アッセイにおけるChIPの解析には、処理と反復の比較が必要です。まず、サンプル間の出発物質の違いを考慮するために、ChIPシグナルは「インプットの割合」と同じ軌跡でインプットシグナルにノーマライズされます。ヒストンH3 ChIPを並行して処理することで、ヒストン修飾の変化がヌクレオソーム密度の変化に対応しているかどうかを判断するのに役立ちます。また、ChIPは多段階のプロセスであるため、サンプルによって効率が異なる場合があります。適切なポジティブコントロール遺伝子座とネガティブコントロール遺伝子座の選択は、サンプルと実験間のS/N比を評価および比較するのに役立ちます。さらに、サンプル間の比較を容易にするために、RNAiターゲットにおけるChIP DNA qPCR閾値サイクル値は、多くの場合、対照遺伝子座3,11,15,23,30,31に正規化されます。RNAi処理の効果を評価するために、治療中のChIPシグナルの比率も比較します RNAi と対照またはRNAiなしの状態。現在のアプローチの限界は、ChIPが全動物で行われるのに対し、RNAi処理に対する反応は生殖細胞系に特有である可能性があることです。この注意点を克服するアプローチは、単離された生殖細胞系核を用いてChIPを行うことです。ChIPを最適化するための追加の技術的考慮事項も、他の場所で広く議論されています32,33。
全体として、このRNAi継承およびChIPプロトコルは、他の技術と統合して世代を超えたエピジェネティックな制御をさらに探求できる、詳細で適応しやすい基盤を提供します。例えば、ChIP DNA(ChIP-seq)からハイスループットシーケンシングライブラリを構築して、RNAiターゲットの近位およびゲノムワイドスケールの両方でクロマチンランドスケープをより詳細に把握することができます。

エピジェネティック遺伝は、世代を超えて遺伝子調節情報を伝達することを可能にするため、両親の環境や経験が子孫に影響を与える可能性があります。C.エレガンスでは、外因性二本鎖RNA(dsRNA)によって開始された生殖細胞遺伝子サイレンシングは、元のトリガーに曝露されていない子孫で複数世代にわたって受け継がれる可能性があります1,2,3,4。RNA干渉(RNAi)遺伝と呼ばれるこのプロセスは、線虫の関連するエピジェネティックサイレンシング現象の1つであり、piRNAが開始する多世代サイレンシング2,5、パラミューテーション/RNAe(RNA誘導エピジェネティックサイレンシング)6,7,8、マルチコピーアレイ開始サイレンシング9などがあり、これらは重複しているが、低分子RNAとクロマチン制御機構に対する明確な要件を持っている.線虫外因性RNAiでは、dsRNAは一次アルゴノートタンパク質との複合体で作用する低分子干渉RNA(siRNA)にプロセシングされ、標的mRNAを認識します。このターゲティングにより、二次アルゴノートと結合する二次siRNAが増幅され、細胞質と核の両方のサイレンシング経路を介して標的mRNAがサイレンシングされます。生殖細胞発現RNAi標的の場合、核二次アルゴノートHRDE-1および追加の核RNAi因子は新生転写産物を標的とし、転写抑制とヒストンメチルトランスフェラーゼの動員を引き起こし、H3K9me3を含む抑制的なクロマチンマークを沈着させる10。ヒストンH3K9me3は、RNAi遺伝による生殖細胞発現緑色蛍光タンパク質(GFP)導入遺伝子の遺伝性サイレンシングの確立を促進する11,12。
このプロトコルの目的はRNAi遺伝のためのレポーターとして生殖細胞系列のGFPヒストン融合蛋白質を表現するtransgeneを使用し、chromatinのimmunoprecipitationおよび量的なポリメラーゼの連鎖反応(ChIP-qPCR)を使用してレポーターのトランスジーンの遺伝子座でヒストンの修正の変更を検定することである。このプロトコルはレポーターのサイレンシングを始めるために標準化された版ベースのRNAiの供給のアプローチを記述する。また、アルカリ性次亜塩素酸塩処理(「漂白」)によって妊娠した成体から子宮内胚を分離することにより、世代間での動物の継代に関する詳細なタイムラインも提供します。また、蛍光顕微鏡法による集団のサブセットにおけるGFPサイレンシングの頻度のモニタリング、およびヒストンH3K9me3 ChIP-qPCRの方法と代表的なデータについても説明します。レポーターベースのRNAi遺伝アッセイは、エピジェネティックな調節における遺伝的および環境的要因の役割を機能的に解剖するための非常に扱いやすいシステムを提供し13,14、そのようなレポーターを用いた遺伝子スクリーニングは、2,3,15に必要な遺伝子と、世代を超えたエピジェネティックな遺伝の持続期間を負に調節する遺伝子16,17の両方を特定しました。

<table><tbody><tr><td>アガロース</td><td>バイオショップ</td><td>AGA002</td><td></td></tr><tr><td>アンピシリン</td><td>バイオショップ</td><td>AMP201</td><td>超純水に 100 mg/mL 溶液を溶かします。フィルター滅菌し、-20°Cで保存します。</td></tr><tr><td>抗H3K9me3ウサギポリクローナル抗体</td><td>Abcam</td><td>ab8898</td><td>濃度はバッチ依存性です(0.9 - 1 mg / mL)。</td></tr><tr><td>抗ヒストンH3ウサギポリクローナル抗体</td><td>Abcam</td><td>ab1791</td><td>濃度はバッチ依存性です(0.7 - 1 mg/mL)。</td></tr><tr><td>漂白剤(6%次亜塩素酸ナトリウム)</td><td>Lavo</td><td>02358107</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans株とGFP RNAi Reporter</td><td>NA</td><td>SX1263</td>、<td>Sapetschnig et al. 2015(文献7)。ケンブリッジ大学のE.ミスカ研究室からの贈り物。</td></tr><tr><td>カルベニシリン</td><td>バイオショップ</td><td>CAR544</td>超<td>純水で25mg / mL溶液を作ります。フィルター滅菌し、-20°Cで保存します。</td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G Magnetic Beads</td><td>Invitrogen</td><td>10003D</td><td></td></tr><tr><td>E. coli HT115(DE3)</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>HT115(DE3)</td><td></td></tr><tr><td>E. coli OP50-1</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>OP50-1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0.5 M, pH 8.0)</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescenceステレオスコープ</td><td>ツァイス</td><td>アクシオ ズーム.V16</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド (37%)</td> <td>シグマ</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>グリシン</td><td>シグマ</td><td>50046</td><td>1.25 M 溶液を作り、4°Cで保存します。</td></tr><tr><td>HEPES-KOH (1 M, pH 7.5)</td><td>Teknova</td><td>H1035</td><td></td></tr><tr><td>疎水性プリントスライド、10 ウェル</td><td>VWR</td><td>100488-904</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630 (Octylphenol ethoxylate)</td><td>BioShop</td><td>NON999</td><td>超純水で 10% (v/v) 溶液を作り、室温で保存します。</td></tr><tr><td>IPTG (イソプロピル-&β;-D-チオガラクトシド)</td><td>BioShop</td><td>IPT001</td><td>超純水に0.2g/mL溶液を溶かします。フィルター滅菌し、-20°Cで保存します。</td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1725122</td><td></td></tr><tr><td>LB 寒天プレート 100 & micro;g/mL アンピシリン</td><td>NA</td><td>NA</td><td>スタンダードラボレシピ。</td></tr><tr><td>レバミゾール(塩酸テトラミソール)</td><td>シグマ</td><td>L9756</td><td>超純水で200mMの溶液を作ります。-20°Cで保管してください。</td></tr><tr><td>LiCl (8 M)</td><td>Sigma</td><td>L7026</td><td></td></tr><tr><td>M9 バッファー</td><td>NA</td><td>NA</td><td>22 mM KH2PO4、42 mM Na2HPO4、86 mM NaCl、1 mM MgSO4。</td></tr><tr><td>マグネティックセパレーター (1.5 mL チューブ)</td><td>Applied Biosystems</td><td>A13346</td><td></td></tr><tr><td>マグネティックセパレーター (0.2 mL チューブ)</td><td>Permagen</td><td>MSR812</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡カバー グラス</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12541B</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>テクノロジストチョイ</td>ス <td>LAB-037</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (5 m)</td><td>Promega</td><td>V4221</td><td>ChIPバッファー用.</td></tr><tr><td>NaOH&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>S5881</td><td>10 M溶液を調製し、室温で保存します。</td></tr><tr><td>NGM プレート</td><td>NA</td><td>NA</td><td>1.7% (w/v) 寒天、0.3% (w/v) NaCl、0.25% (w/v) ペプトン、1 mM CaCl2、5 &mu;g/mL コレステロール、25 mM リン酸カリウム pH 6.0、1 mM MgSO4、50 & micro;g / mLストレプトマイシン。.</td></tr><tr><td>正常なウサギIgG(1 mg / mL)</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>2729</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿(35 mm x 10 mm)</td><td>Sarstedt</td><td>82.1135.500</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水(10X)</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP3991</td><td></td></tr><tr><td>プラスミド-コントロールRNAi&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>L4440 (Plasmid #1654)</td><td></td></tr><tr><td>プラスミド - GFP-targetgetting RNAi&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>L4417 (Plasmid #1649)</td><td>GFPを標的とする代替のL4440由来プラスミドを使用することができます。</td></tr><tr><td>プライマーペア [-3.3 kb upstream of gfp]</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>NA</td><td>F: AAACCAAAGGACGAGAGATTCA, R: GGCTCGATCAAGTAAAATTTCG</td></tr><tr><td>Primer pair [+1.3 kb down of gfp]</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>NA</td><td>F: TCGACCAGTTCTAAAGTCACCG, R: ACGTGCGGGATCATTTCTACT</td></tr><tr><td>Primer pair [CLEC-18]</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>NA</td><td>F: TGCTCCATGACCTCAACAACA, R: AGTACAGTTCACCGATCCAGA</td></tr><tr><td>プライマーペア [gfp エクソン 1]</td><td>統合 DNA テクノロジー</td>ズ <td>NA</td><td>F:CTGGAGTTGTCCCAATTCTTGT、R:GGGTAAGTTTTTTCCGTATGTTGC</td></tr><tr><td>プライマーペア [GFP エクソン 4]</td><td>統合 DNA テクノロジー</td><td>ズ NA</td><td>F:GATGGCCCTGTCCTTACCA、R:ATGCCATGTAATCCCAGCA</td></tr><tr><td>プライマーペア [HRP-2]</td><td>統合 DNA テクノロジー</td><td>ズ</td><td>NA F:CGTCAACAGGGAGCAGCTG、R:CCTCCGAACTTTCTCTGTCCA</td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤カクテル錠</td><td>ロシュ</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>プロテイナーゼK&nbsp;</td><td>Bioline</td><td>BIO-37084</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR精製キット&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>リアルタイム PCR 解析システム</td><td>Bio-Rad</td><td>CFX96&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>RNAi-NGM プレート</td><td>NA</td><td></td><td>NA 1.7% (w/v) 寒天、0.3% (w/v) NaCl、0.25% (w/v) ペプトン、1 mM CaCl2、5 &micro;g/mL コレステロール、25 mM リン酸カリウム緩衝液 pH 6.0、1 mM MgSO4、25 &micro;g/mLカルベニシリンおよび5 mM IPTG。</td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Sigma</td><td>R4642</td><td></td></tr><tr><td>サルコシル (N-ラウロイルサルコシンナトリウム塩)</td><td>Sigma</td><td>L5777</td><td>10% (w/v) 溶液を調製し、光から保護した室温で最大 1 か月間保存してください。</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>74255</td><td>10%(w/v)溶液を調製し、室温で保存します。</td></tr><tr><td>デオキシコール酸ナトリウム</td><td>シグマ</td><td>30970</td><td>5%(w/v)溶液を作り、光から保護された室温で最大1ヶ月間保存してください。</td></tr><tr><td>超音波処理チューブエ</td><td>バーグリーン</td><td>214-3721-010</td><td></td></tr><tr><td>超音波処理チューブキャップ</td><td>エバーグリーン</td><td>300-2911-020</td><td></td></tr>超音波<tr><td>処理機</td><td>Qsonica</td><td>Q800R3-110</td><td></td></tr>スト<tr><td>レプトマイシン硫酸塩</td><td>Bioshop</td><td>STP101</td>超<td>純水で50mg / mL溶液を作ります。フィルター滅菌し、-20°Cで保存します。</td></tr><tr><td>TAEバッファー (1X)</td><td>NA</td><td></td><td>NA 40 mM Tris, 20 mM acetate, 1 mM EDTA</td></tr><tr><td>Tally counter clicker</td><td>Uline</td><td>H-7350</td><td></td></tr><tr><td>Tetracycline</td><td>Bioshop</td><td>TET701</td><td>エタノールで5 mg/mLの溶液を作り、-20°Cで保存します。</td></tr><tr><td>サーモミキサー</td><td>エッペンドルフ</td><td>05-400-205</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (1 M, pH 8.0)</td><td>Invitrogen</td><td>15568025</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>超純水に10%(v/v)溶液を作り、室温で保存してください。</td></tr></tbody></table>

線虫の世代間エピジェネティック遺伝の蛍光レポーターとクロマチン免疫沈降(chip)による解析

Analysis of Transgenerational Epigenetic Inheritance in C. elegans Using a Fluorescent Reporter and Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)

世代間エピジェネティック遺伝(TEI)は、ノンコーディングRNAやクロマチン修飾などの因子を介して、ゲノム配列を変更することなく、生殖細胞系を介して情報を伝達することを可能にします。線虫 Caenorhabditis elegans におけるRNA干渉(RNAi)遺伝の現象は、このモデル生物の短いライフサイクル、自己増殖、透明性を利用したTEIの研究に有効なモデルです。RNAi遺伝では、動物をRNAiに曝露すると、遺伝子サイレンシングと標的遺伝子座のクロマチンシグネチャーの変化が起こり、最初のトリガーがない場合に複数世代にわたって持続します。このプロトコルは生殖細胞系表現された核緑色蛍光蛋白質(GFP)のレポーターを使用して C.のelegansの RNAi遺伝の分析を記述する。レポーターサイレンシングは、GFPを標的とする二本鎖RNAを発現する細菌を動物に与えることによって開始されます。各世代では、動物は同期発生を維持するために継代され、レポーター遺伝子のサイレンシングは顕微鏡検査によって決定されます。特定の世代では、集団を収集および処理してクロマチン免疫沈降(ChIP)-定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)を行い、GFPレポーター遺伝子座でのヒストン修飾濃縮を測定します。RNAi遺伝を調査するためのこのプロトコルは、他の分析と簡単に変更して組み合わせることができ、小さなRNAおよびクロマチン経路のTEI因子をさらに調査することができます。

生殖細胞発現GFPヒストンH2B [mex-5p::gfp-h2b::tbb-2 3'UTR]7 レポーター(図2A)をGFP RNAiまたはコントロールRNAiに曝露し、摂食により、プロトコルおよび 図1に記載されているように継代しました。生殖細胞系における核内GFPシグナルは、各世代の集団のサンプルについて、蛍光解剖顕微鏡を用いて手動でスコアリングした。導入遺伝子のサイレンシングは、GFP RNAiで処理したP0およびF1のスコアリング動物で完全に浸透性でした(図2B)。F2世代では、GFPサイレンシングの遺伝を示す集団の割合は約50%でした。F5世代までに、個体群の大多数はサイレンシングの遺伝を示さず、F10世代までに、すべての動物がGFPを発現したため、遺伝は検出されませんでした。
RNAi誘導サイレンシングに対応するヒストンH3K9me3濃縮の変化を決定するために、GFP RNAiまたはコントロールRNAi処理後のF1世代動物でChIP-qPCRを実施しました。予想通り、GFP RNAi処理した集団は、コントロールRNAi処理動物と比較して、GFPターゲットおよび1.3 kbの下流領域で高いヒストンH3K9me3レベルを示しました(図2C)。ヒストンH3K9me3 ChIPの特異性は、このマークで濃縮されることが知られているポジティブコントロール遺伝子座(clec-18)での濃縮によって裏付けられていますが、近くのネガティブコントロール遺伝子座(hrp-2)では濃縮されていません。予想通り、IgGコントロール免疫沈降におけるヒストンH3濃縮およびバックグラウンド近傍濃縮も、すべてのqPCR遺伝子座で検出されました。レポーターでのChIP濃縮を clec-18 ポジティブコントロール遺伝子座に正規化すると、GFP RNAiでのヒストンH3K9me3濃縮が高いことが示されますが、ヒストンH3濃縮はコントロール処理とGFP RNAi処理でほぼ同じです(図2D)。GFP RNAiは、 clec-18 遺伝子座におけるヒストンH3K9me3またはヒストンH3の総占有率に影響を与えないと予想されるため、この標準化により、GFP RNAiサンプルとコントロールRNAiサンプル間のChIP効率の違いなどの技術的なばらつきが軽減されます。RNAi処理間のヒストンH3K9me3およびヒストンH3レベルの倍率変化は、GFP RNAi誘導サイレンシング時に、ヒストン占有率とは無関係に、GFPレポーター特異的なヒストンH3K9me3濃縮を示します(図2E)。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65285/65285fig02.jpg"> 図2:GFP RNAiによるサイレンシングは、RNAiターゲットでのH3K9me3濃縮の上昇に対応しています 。 (A)生殖細胞発現GFP RNAiレポーターmjIs134[mex-5p::gfp-h2b::tbb-2 3'UTR]の図で、qPCRアンプリコン領域を標識。(B)21°CでのRNAi処理後の世代にわたるGFP発現。 エラーバーは、2つの生物学的反復からの標準偏差を表します。(C)2つの生物学的複製から得られたF1若年成人のH3K9me3、ヒストンH3、およびIgGコントロールのChIP-qPCR。 clec-18 と hrp-2 は、それぞれH3K9me3濃縮のポジティブコントロール遺伝子座とネガティブコントロール遺伝子座です。(D) clec-18 陽性対照遺伝子座に正規化されたGFP RNAiレポーターにおけるH3K9me3およびヒストンH3の濃縮。(E)GFP RNAi処理動物とコントロールRNAi処理動物の間のH3K9me3およびヒストンH3濃縮の変化、 clec-18への正常化。点線は 1 の倍増を表します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65285/65285fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>

このプロトコルはC .のelegansのRNAi誘導されたサイレンシングおよび準のchromatinの修正のエピジェネティックな遺伝を調査するRNAの干渉およびChIPの試金を記述する。

線虫の世代間エピジェネティック遺伝の蛍光レポーターとクロマチン免疫沈降(ChIP)による解析

Transgenerational epigenetic inheritance (TEI) allows the transmission of information through the germline without changing the genome sequence, through ...

私たちの研究室では、クロマチン関連タンパク質、ヒストン修飾、および低分子RNA経路因子が、発生と世代を超えたエピジェネティックな遺伝の文脈でどのように連携するかを調べています。GFPレポーターを用いたRNA遺伝アッセイは、非常に強力なツールとなっています。このプロトコールでは、ワームの調製、スコアリング、継代、および再現性のある結果の生成に役立つChIPサンプルの調製を標準化する方法を説明しています。生殖細胞系に発現する導入遺伝子を研究する際の実験的課題の1つは、動物の生殖細胞系における影響を単離することです。現在、ChIPには全動物を用いていますが、将来的にはクロマチン、特に生殖細胞系で調べるアッセイを開発したいと考えています。当研究室では、ヒストンのメチル化と、その痕跡を認識するタンパク質に興味を持っています。今後は、導入遺伝子におけるRNAi遺伝や内因性配列の制御など、これらのクロマチンリーダーとsmall RNA経路の相互作用について調べていきたいと考えています。

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Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

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学ぶRNAi遺伝とクロマチン修飾の解析法。C. elegansを用いた蛍光レポーターとChIPアッセイで、世代間エピジェネティック継承のメカニズムを解明する標準化プロトコルを紹介します。

線虫の世代間エピジェネティック遺伝の蛍光レポーターとクロマチン免疫沈降(ChIP)による解析

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