Name: HeLa細胞におけるライブイメージングを用いたミトコンドリア膜電位およびスーパーオキシドレベルの蛍光ベースの定量 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: 学ぶHeLa細胞を用いたライブイメージングによるミトコンドリア膜電位とスーパーオキシドレベルの蛍光定量法。神経変性疾患におけるミトコンドリア機能異常のメカニズム解明と治療戦略開発への貢献が期待されます。

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この原稿に対する思慮深いフィードバックを提供してくれたEvansラボのメンバーに感謝します。この研究は、デュークホワイトヘッド奨学生、デューク科学技術奨学生、およびハワードヒューズ医学研究所(HHMI)ハンナグレイフェローシップによってサポートされています。 図1A は BioRender.com を用いて作製した。

ミトコンドリア膜電位およびスーパーオキシドレベルの定量化

<ol><li>Spinelli, J. B., Haigis, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multifaceted+contributions+of+mitochondria+to+cellular+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism.</a> Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).</li>
<li>West, A. P., Shadel, G. S., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+in+innate+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Mitochondria in innate immune responses.</a> Nature Reviews. Immunology. 11 (6), 389-402 (2011).</li>
<li>Seth, R. B., Sun, L., Ea, C. K., Chen, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+MAVS%2C+a+mitochondrial+antiviral+signaling+protein+that+activates+NF-kappaB+and+IRF+3%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of MAVS, a mitochondrial antiviral signaling protein that activates NF-kappaB and IRF 3.</a> Cell. 122 (5), 669-682 (2005).</li>
<li>Tait, S. W. G., Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+and+cell+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mitochondria and cell signalling.</a> Journal of Cell Science. 125, 807-815 (2012).</li>
<li>Antico Arciuch, V. G., Elguero, M. E., Poderoso, J. J., Carreras, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+regulation+of+cell+cycle+and+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+and+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial regulation of cell cycle and proliferation.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 16 (10), 1150-1180 (2012).</li>
<li>Grunewald, A., Kumar, K. R., Sue, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+complex+role+of+mitochondria+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">New insights into the complex role of mitochondria in Parkinson's disease.</a> Progress in Neurobiology. 177, 73-93 (2019).</li>
<li>Borsche, M., Pereira, S. L., Klein, C., Grunewald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+and+Parkinson%27s+disease%3A+clinical%2C+molecular%2C+and+translational+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Parkinson%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Mitochondria and Parkinson's disease: clinical, molecular, and translational aspects.</a> Journal of Parkinson's Disease. 11 (1), 45-60 (2021).</li>
<li>Ou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+trends+in+the+incidence%2C+prevalence%2C+and+years+lived+with+disability+of+Parkinson%27s+disease+in+204+countries%2Fterritories+from+1990+to+2019%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Global trends in the incidence, prevalence, and years lived with disability of Parkinson's disease in 204 countries/territories from 1990 to 2019.</a> Frontiers in Public Health. 9, 776847(2021).</li>
<li>Martinez-Vicente, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+mitophagy+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal mitophagy in neurodegenerative diseases.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 64(2017).</li>
<li>Youle, R. J., Narendra, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of mitophagy.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 12 (1), 9-14 (2011).</li>
<li>Villa, E., Marchetti, S., Ricci, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((No+Parkin+zone%3A+mitophagy+without+Parkin%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">No Parkin zone: mitophagy without Parkin.</a> Trends in Cell Biology. 28 (11), 882-895 (2018).</li>
<li>Geisler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PINK1%2FParkin-mediated+mitophagy+is+compromised+by+PD-associated+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">The PINK1/Parkin-mediated mitophagy is compromised by PD-associated mutations.</a> Autophagy. 6 (7), 871-878 (2010).</li>
<li>Kane, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINK1+phosphorylates+ubiquitin+to+activate+Parkin+E3+ubiquitin+ligase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">PINK1 phosphorylates ubiquitin to activate Parkin E3 ubiquitin ligase activity.</a> The Journal of Cell Biology. 205 (2), 143-153 (2014).</li>
<li>Koyano, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+is+phosphorylated+by+PINK1+to+activate+parkin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin is phosphorylated by PINK1 to activate parkin.</a> Nature. 510 (7503), 162-166 (2014).</li>
<li>Ordureau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+roles+of+PARKIN+and+ubiquitin+phosphorylation+by+PINK1+in+mitochondrial+quality+control+using+a+ubiquitin+replacement+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Defining roles of PARKIN and ubiquitin phosphorylation by PINK1 in mitochondrial quality control using a ubiquitin replacement strategy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (21), 6637-6642 (2015).</li>
<li>Ordureau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomics+reveal+a+feedforward+mechanism+for+mitochondrial+PARKIN+translocation+and+ubiquitin+chain+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomics reveal a feedforward mechanism for mitochondrial PARKIN translocation and ubiquitin chain synthesis.</a> Molecular Cell. 56 (3), 360-375 (2014).</li>
<li>Kitada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+parkin+gene+cause+autosomal+recessive+juvenile+parkinsonism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mutations in the parkin gene cause autosomal recessive juvenile parkinsonism.</a> Nature. 392 (6676), 605-608 (1998).</li>
<li>Valente, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARK6+is+a+common+cause+of+familial+parkinsonism%5BTitle%5D)+AND+%22Neurological+Sciences%22%5BJournal%5D)">PARK6 is a common cause of familial parkinsonism.</a> Neurological Sciences. 23, S117-S118 (2002).</li>
<li>Matsuda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINK1+stabilized+by+mitochondrial+depolarization+recruits+Parkin+to+damaged+mitochondria+and+activates+latent+Parkin+for+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">PINK1 stabilized by mitochondrial depolarization recruits Parkin to damaged mitochondria and activates latent Parkin for mitophagy.</a> The Journal of Cell Biology. 189 (2), 211-221 (2010).</li>
<li>Sriram, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Familial-associated+mutations+differentially+disrupt+the+solubility%2C+localization%2C+binding+and+ubiquitination+properties+of+parkin%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Familial-associated mutations differentially disrupt the solubility, localization, binding and ubiquitination properties of parkin.</a> Human Molecular Genetics. 14 (17), 2571-2586 (2005).</li>
<li>Vives-Bauza, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINK1-dependent+recruitment+of+Parkin+to+mitochondria+in+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">PINK1-dependent recruitment of Parkin to mitochondria in mitophagy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (1), 378-383 (2010).</li>
<li>Wong, Y. C., Holzbaur, E. L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optineurin+is+an+autophagy+receptor+for+damaged+mitochondria+in+parkin-mediated+mitophagy+that+is+disrupted+by+an+ALS-linked+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Optineurin is an autophagy receptor for damaged mitochondria in parkin-mediated mitophagy that is disrupted by an ALS-linked mutation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (42), E4439-E4448 (2014).</li>
<li>Bertolin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkin+maintains+mitochondrial+levels+of+the+protective+Parkinson%27s+disease-related+enzyme+17-beta+hydroxysteroid+dehydrogenase+type+10%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Parkin maintains mitochondrial levels of the protective Parkinson's disease-related enzyme 17-beta hydroxysteroid dehydrogenase type 10.</a> Cell Death and Differentiation. 22 (10), 1563-1576 (2015).</li>
<li>Crowley, L. C., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+mitochondrial+transmembrane+potential+by+TMRE+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Measuring mitochondrial transmembrane potential by TMRE staining.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (12), (2016).</li>
<li>Kuznetsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+ROS+production+under+cellular+stress%3A+comparison+of+different+detection+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial ROS production under cellular stress: comparison of different detection methods.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 400 (8), 2383-2390 (2011).</li>
<li>Moore, A. S., Holzbaur, E. L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+recruitment+and+activation+of+ALS-associated+TBK1+with+its+target+optineurin+are+required+for+efficient+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Dynamic recruitment and activation of ALS-associated TBK1 with its target optineurin are required for efficient mitophagy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (24), E3349-E3358 (2016).</li>
<li>Evans, C. S., Holzbaur, E. L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation+of+engulfed+mitochondria+is+rate-limiting+in+Optineurin-mediated+mitophagy+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Degradation of engulfed mitochondria is rate-limiting in Optineurin-mediated mitophagy in neurons.</a> eLife. 9, e50260(2020).</li>
<li>Jacobsen, L. B., Calvin, S. A., Colvin, K. E., Wright, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FuGENE+6+Transfection+Reagent%3A+the+gentle+power%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">FuGENE 6 Transfection Reagent: the gentle power.</a> Methods. 33 (2), 104-112 (2004).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Mitra, K., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+dynamics+and+functions+using+imaging+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial dynamics and functions using imaging approaches.</a> Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 4, Unit 4.25 1-21 (2010).</li>
<li>Lin, H. C., Liu, S. Y., Lai, H. S., Lai, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+mitochondria+infusion+mitigates+ischemia-reperfusion+injury+of+the+liver+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Isolated mitochondria infusion mitigates ischemia-reperfusion injury of the liver in rats.</a> Shock. 39 (3), 304-310 (2013).</li>
<li>Kholmukhamedov, A., Schwartz, J. M., Lemasters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+mitochondria+infusion+mitigates+ischemia-reperfusion+injury+of+the+liver+in+rats%3A+mitotracker+probes+and+mitochondrial+membrane+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Isolated mitochondria infusion mitigates ischemia-reperfusion injury of the liver in rats: mitotracker probes and mitochondrial membrane potential.</a> Shock. 39 (6), 543(2013).</li>
<li>Thorn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+fluorescent+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded fluorescent tags.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 848-857 (2017).</li>
<li>Pavel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contact+inhibition+controls+cell+survival+and+proliferation+via+YAP%2FTAZ-autophagy+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Contact inhibition controls cell survival and proliferation via YAP/TAZ-autophagy axis.</a> Nature Communications. 9 (1), 2961(2018).</li>
<li>Rossignol, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+substrate+modulates+mitochondrial+structure+and+oxidative+capacity+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Energy substrate modulates mitochondrial structure and oxidative capacity in cancer cells.</a> Cancer Research. 64 (3), 985-993 (2004).</li>
<li>Schornack, P. A., Gillies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+cell+metabolism+and+H%2B+diffusion+to+the+acidic+pH+of+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Contributions of cell metabolism and H+ diffusion to the acidic pH of tumors.</a> Neoplasia. 5 (2), 135-145 (2003).</li>
<li>Christensen, M. E., Jansen, E. S., Sanchez, W., Waterhouse, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+based+assays+for+the+measurement+of+apoptosis-associated+mitochondrial+membrane+depolarisation+and+cytochrome+c+release%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry based assays for the measurement of apoptosis-associated mitochondrial membrane depolarisation and cytochrome c release.</a> Methods. 61 (2), 138-145 (2013).</li>
<li>Muller, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+extracellular+flux+analysis+for+determining+mitochondrial+function+in+mammalian+oocytes+and+early+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Application of extracellular flux analysis for determining mitochondrial function in mammalian oocytes and early embryos.</a> Scientific Reports. 9 (1), 16778(2019).</li>
<li>Connolly, N. M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+on+experimental+methods+to+assess+mitochondrial+dysfunction+in+cellular+models+of+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Guidelines on experimental methods to assess mitochondrial dysfunction in cellular models of neurodegenerative diseases.</a> Cell Death and Differentiation. 25 (3), 542-572 (2018).</li>
<li>Demine, S., Renard, P., Arnould, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+uncoupling%3A+a+key+controller+of+biological+processes+in+physiology+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial uncoupling: a key controller of biological processes in physiology and diseases.</a> Cells. 8 (8), 795(2019).</li>
<li>Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkin+is+recruited+selectively+to+impaired+mitochondria+and+promotes+their+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy.</a> The Journal of Cell Biology. 183 (5), 795-803 (2008).</li>
<li>Kwak, S. H., Park, K. S., Lee, K. U., Lee, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+metabolism+and+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Diabetes+Investigation%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial metabolism and diabetes.</a> Journal of Diabetes Investigation. 1 (5), 161-169 (2010).</li>
<li>Reddy, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+mitochondria+in+neurodegenerative+diseases%3A+mitochondria+as+a+therapeutic+target+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22CNS+Spectrums%22%5BJournal%5D)">Role of mitochondria in neurodegenerative diseases: mitochondria as a therapeutic target in Alzheimer's disease.</a> CNS Spectrums. 14 (8), 8-13 (2009).</li>
<li>Wang, W., Zhao, F., Ma, X., Perry, G., Zhu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+dysfunction+in+the+pathogenesis+of+Alzheimer%27s+disease%3A+recent+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">Mitochondria dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer's disease: recent advances.</a> Molecular Neurodegeneration. 15 (1), 30(2020).</li>
<li>Baloyannis, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+alterations+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Alzheimer%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial alterations in Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 9 (2), 119-126 (2006).</li>
<li>Wallace, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Mitochondria and cancer.</a> Nature Reviews. Cancer. 12 (10), 685-698 (2012).</li>
<li>Middleton, P., Vergis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+and+liver+disease%3A+role%2C+relevance%2C+and+potential+for+therapeutic+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Therapeutic+Advances+in+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction and liver disease: role, relevance, and potential for therapeutic modulation.</a> Therapeutic Advances in Gastroenterology. 14, 17562848211031394(2021).</li>
</ol>

著者には、宣言する競合する利益はありません。

ここで概説するワークフローは、蛍光ベースのイメージングを用いて、ミトコンドリア膜電位およびスーパーオキシドレベルを堅牢かつ再現性よく定量するために使用することができる30。これらの実験を設計する際に考慮すべき重要な技術的制限があります。HeLa細胞を、空のYFPベクター、YFP-パーキンWT、またはYFP-パーキンT240Rでトランスフェクトした。空のYFPベクターを対照として使用し、実験所見がパーキンに特異的であることを確認した。一過性トランスフェクションでは、DNAとトランスフェクション試薬の質量比を1:3と実験的に決定し、トランスフェクション率が最も高いようにし、各コンストラクトに2 μgのプラスミドDNAを使用しました28。蛍光タンパク質は生来の輝度が異なるため、すべてのコンストラクトでYFPタグを一定に保つことが重要でした31,32。複数の蛍光タンパク質タグを使用する必要が...

ミトコンドリアネットワークは、エネルギー生産1、自然免疫2,3、および細胞シグナル伝達4,5において重要な役割を果たす一連の相互接続された細胞小器官です。ミトコンドリアの調節不全は、パーキンソン病(PD)などの神経変性疾患と関連しています6,7。PDは、黒質のドーパミン作動性ニューロンに影響を与える進行性の神経変性疾患であり、世界中で約1,000万人が罹患しています8。PDは、損傷したミトコンドリアを選択的に除去する細胞の恒常性を維持するために必要なミトコンドリアの品質管理経路であるマイトファジーと遺伝的に関連しています9,10。研究により、1(FUNDC1)を介したマイトファジーを含むFUN14ドメイン、Bcl-2相互作用タンパク質3(BNIP3)促進マイトファジー、NIX依存性マイトファジー、および十分に特徴付けられたPTEN誘導キナーゼ1(PINK1)/パーキン調節マイトファジー10,11を含む複数の独立したマイトファジー経路が特定されています。PINK1(推定されるキナーゼ)とパーキン(E3ユビキチンリガーゼ)は連携して働き、損傷したミトコンドリアをリン酸ユビキチン化し、損傷した細胞小器官を飲み込み、リソソームと融合して分解を開始するオートファゴソームの形成を促進します12,13,14,15,16。パーキンの変異は、ドーパミン作動性ニューロンの喪失を介した神経変性などのPD結合表現型と関連しています17,18。
ここでは、子宮頸がん由来の不死化細胞であるHeLa細胞を使用して、ミトコンドリアネットワークの健康を維持する上でのパーキンの役割を調査するプロトコルについて説明します。HeLa細胞はごくわずかなレベルの内因性パーキンを発現するため、外因性パーキン発現が必要です19。ミトコンドリアネットワークの健康におけるパーキンの役割を研究するために、HeLa細胞を野生型パーキン(パーキンWT)、パーキン変異体(パーキンT240R)、または空のコントロールベクターのいずれかでトランスフェクトします。パーキンT240Rは、パーキンE3リガーゼ活性に影響を及ぼす常染色体劣性若年性パーキンソニズム変異であり、マイトファジー経路20の効率を著しく低下させる。HeLa細胞は、ミトコンドリア脱共役剤であるカルボニルシアン化物m-クロロフェニルヒドラゾン(CCCP)の軽度(5 μM)または重度(20 μM)濃度にさらされます。高濃度のCCCPによる処理は、HeLaおよびCOS-7細胞などの様々な細胞株においてパーキン媒介マイトファジーを誘導するために日常的に使用されている21、22、23。
治療後、プロトコルは、現在利用可能な2つのミトコンドリア標的蛍光色素を使用したミトコンドリアネットワークのライブイメージングを使用します。テトラメチルローダミン、エチルエステル、過塩素酸塩(TMRE)は、ミトコンドリア膜電位24に基づいて蛍光を発するカチオン色素であり、MitoSOXは、蛍光強度がスーパーオキシド濃度25の関数であるミトコンドリアスーパーオキシドインジケーターです。最後に、概説したプロトコルは、蛍光ベースの定量とシンプルなワークフローを使用して、ユーザーのバイアスの範囲を最小限に抑えながら、ミトコンドリア膜電位とスーパーオキシドレベルを効果的に定量します。このプロトコルは、HeLa細胞のミトコンドリア機能を研究するために設計されましたが、ミトコンドリアネットワークの健全性を定量的に特徴付けるために、追加の細胞株および初代細胞タイプに適合させることができます。

<table><tbody><tr><td>化学品、ペプチド、および組換えタンパク質</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCCP(シアン化カルボニルm-クロロフェニルヒドラゾン)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2759</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1x) with 4.5 g/L glucose</td><td>Gibco</td><td>11-965-084</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, Anhydrous</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Hyclone</td><td>SH3007103</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE 6 (Tranfection Reagent)</td><td>Promega</td><td>E2691</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX 100x (L-Glutamine Solution)&nbsp;</td><td>ギブコ&nbsp;</td><td>35-050-061</td><td></td></tr><tr><td>Hoescht 33342</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>MitoSOX&nbsp;赤&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>M36008</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker ディープレッド</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>M7514</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM (Redued Serum media)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>テトラメチルローダミン、エチルエステル、過塩素酸塩 (TMRE)&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>T669</td><td></td></tr><tr><td>Experimental models: Organisms/Strains</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HeLa-M (Homo sapiens)</td><td>A. Peden (Cambridge Institute for Medical Research)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant DNA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EYFP Empty Vector</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>YFP-Parkin T240R</td><td>この論文</td>は<td>、YFP-Parkin</td><td></td></tr><tr><td>YFP-Parkin WT</td> Addgeneからの部位特異的突然変異誘発によって生成されました<td>。PMID:19029340</td><td>RRID:Addgene_23955</td><td></td></tr><tr><td>Software and Algorithms</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adobe Illustrator</td><td>Adobe Inc.</td><td>https://www.adobe.com/products/illustrator</td><td>(Schindelin, 2012)</td></tr><tr><td>Excel (表計算ソフト)</td><td>Microsoft Office&nbsp;</td><td></td><td></td>https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel</tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td>https://imagej.net/software/fiji/</td><td></td></tr> <tr><td>Leica Application Suite (LAS X)</td><td>Leica</td><td>https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/</td><td></td></tr> <tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft Office</td><td>https://www.microsoft.com/excel</td><td></td></tr><tr><td>Prism9 (統計)解析ソフト)</td><td>GraphPad ソフト</td><td>https://www.graphpad.com</td><td></td></tr><tr><td><ストロング>その他<・ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>35mmディッシュ No.1.5 カバースリップ ガラス径20mm ノンコート</td><td>マットテック</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td></td></tr><tr><td>ケージインキュベーター(環境チャンバー)</td><td>オコラボ</td><td>https://www.oko-lab.com/cage-incubator</td><td></td></tr><tr><td>DMiL 倒立顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ライトニング デコンボリューションソフトウェア</td><td>ライカ</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>STELLARIS 8 共焦点顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

hela細胞におけるライブイメージングを用いたミトコンドリア膜電位およびスーパーオキシドレベルの蛍光ベースの定量

Fluorescence-Based Quantification of Mitochondrial Membrane Potential and Superoxide Levels Using Live Imaging in HeLa Cells

ミトコンドリアは、ATP合成 を介して エネルギー産生を制御することにより、代謝恒常性に不可欠な動的オルガネラです。細胞の代謝をサポートするために、さまざまなミトコンドリアの品質管理メカニズムが連携して、健康なミトコンドリアネットワークを維持します。そのような経路の1つはマイトファジーであり、PTEN誘導キナーゼ1(PINK1)と損傷したミトコンドリアのパーキンホスホユビキチン化は、オートファゴソームの隔離とその後のリソソーム融合 による 細胞からの除去を促進します。マイトファジーは細胞の恒常性にとって重要であり、パーキンの変異はパーキンソン病(PD)に関連しています。これらの発見により、ミトコンドリアの品質管理の分子メカニズムとダイナミクスを理解するために、ミトコンドリアの損傷と代謝回転の研究に大きな重点が置かれてきました。ここでは、生細胞イメージングを使用してHeLa細胞のミトコンドリアネットワークを視覚化し、ミトコンドリア脱共役剤であるカルボニルシアン化m-クロロフェニルヒドラゾン(CCCP)で処理した後のミトコンドリア膜電位とスーパーオキシドレベルを定量化しました。さらに、パーキン依存性マイトファジーを阻害するパーキンのPD結合変異(パーキンT240R)を発現させ、変異発現が野生型パーキンを発現する細胞と比較してミトコンドリアネットワークにどのように影響するかを決定しました。ここで概説するプロトコルは、ミトコンドリア膜電位とスーパーオキシドレベルを効果的に定量するための蛍光ベースのアプローチを使用した簡単なワークフローを説明しています。

このプロトコルでは、蛍光ベースの定量を使用して、CCCP処理後のミトコンドリアネットワークの膜電位とスーパーオキシドレベルを測定しました(図1)。このワークフローでは、子宮頸がん由来の不死化細胞株であるHeLa細胞を使用しました。HeLa細胞は、ミトコンドリア生物学の研究に日常的に使用されており、比較的平坦であるため、顕微鏡を使用してミトコンドリアネットワークを簡単に視覚化できます。ミトコンドリアネットワークの健康維持におけるパーキンの役割を調べるために、HeLa細胞に空のコントロールベクターであるパーキンWTまたはパーキンT240R (マイトファジーを破壊する変異体)を一時的にトランスフェクトしました21。HeLa細胞を35mmのガラス底イメージングディッシュに播種し、コンフルエントが~50%-60%に達したらトランスフェクトしました(図1A)。HeLa細胞は急速に分裂するため、これは通常、細胞をイメージングディッシュにプレー...

この手法では、蛍光ベースのライブイメージングを使用して、HeLa細胞内のミトコンドリア膜電位とスーパーオキシドレベルを視覚化し、定量的に測定するための効果的なワークフローについて説明します。

HeLa細胞におけるライブイメージングを用いたミトコンドリア膜電位およびスーパーオキシドレベルの蛍光ベースの定量

Mitochondria are dynamic organelles critical for metabolic homeostasis by controlling energy production via ATP synthesis. To support cellular metabolism, ...

本研究では、神経変性疾患におけるミトコンドリアの調節不全に着目しています。この研究は、パーキンソン病やALSなどの神経変性疾患との闘いの治療法につながる可能性のある疾患発症の潜在的な原因を理解するために使用できると考えています。STEDやSIMなどの超解像顕微鏡や膨張顕微鏡などの技術により、個々の細胞小器官内のタンパク質分布と細胞全体のミトコンドリア分布を正確に理解する能力が向上しました。この手法の結果は、パーキンソン病に関連する突然変異がミトコンドリアの代謝回転に及ぼす影響を研究し、神経細胞の健康を維持するために活性酸素種レベルとミトコンドリア膜電位を調節することの重要性を理解するための出発点として使用できます。私たちの研究室では、個々のミトコンドリアの品質管理経路を機械的に特徴づけ、これらの経路間の相互作用を理解することを目指しています。経路のダイナミクスに関する洞察を得ることで、ミトコンドリアがどのように維持され、ミトコンドリアの調節不全が神経変性疾患の発症にどのように寄与するかを理解することができます。

fluorescence-based-quantification-mitochondrial-membrane-potential

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このプロトコルは、蛍光イメージングによるミトコンドリアのカルシウムフラックスのリアルタイム測定のための方法を説明します。方法は、選択的にミトコンドリアで発現する循環permutated YFPベースのデュアル励起レシオメトリックカルシウムセンサー（レシオメトリックpericam -...

遺伝的にコードされたカルシウムのセンサを用いたアポトーシス時のミトコンドリア内カルシウム濃度の動的変更の監視

共焦点走査顕微鏡は、生きた動物における灌流心臓または骨格筋​​におけるミトコンドリアの単一のイベントを画像化するために適用される。スーパーオキシドが点滅し、膜電位の変動などの単一ミトコンドリアのプロセスのリアルタイム監視は、生理学的に関連するコンテキストでかつ病理学的摂動の間、ミトコンドリア機能の評価が可能。...

シングルミトコンドリアスーパーオキシド無傷ハートや点滅の共焦点イメージングインビボ

ミトコンドリアは、それらが細胞内の細胞質ゾルのCa 2+シグナル伝達を形成することができ、カルシウム（Ca 2+）隔離する彼らの内膜（ΔΨm）を横切って電気化学ポテンシャルを利用することができます。我々は、同時に、蛍光色素、共焦点顕微鏡を使用して、生細胞中のミトコンドリアの Ca 2+取り込みおよびΔΨmを測定するための方法を記載します。...

蛍光顕微鏡による生細胞内のミトコンドリアのカルシウムとミトコンドリア膜電位の同時測定

この論文は、細胞透過性蛍光レポーター分子5-（および - ）を使用して、生存接着細胞において、細胞内ROSレベル、ならびにミトコンドリア膜電位および形態（ミトコンドリア形態機能とも併せて参照される）の同時定量化のための、 6） - クロロメチル-2 '、7'-ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート、アセチルエステル（CM-H 2 DCFDA）およびテトラメチルローダミンメチルエステル（TMRM）。...

ハイコンテンツ顕微鏡を用いた細胞レドックスプロファイリング

この研究では、ステップバイステップのプロトコルを説明し、サンプル調製、画像取得、データ解析など、生細胞のミトコンドリアの形態学的特性を決定するための重要な詳細を強調します。この方法は、さまざまな条件を研究するためにミトコンドリアの形態を調べるために一般的に使用されます。...

共焦点顕微鏡法を用いた生細胞のミトコンドリア形態の決定

生細胞におけるストア作動性カルシウムエントリの蛍光ベースの測定：培養癌細胞から骨格筋線維に

細胞の生存率は、タンパク質のミスフォールディングのタイムリーかつ効率的な管理に依存します。包有物中のフォールディング、劣化、または隔離：ここでは、ミスフォールドタンパク質の異なる潜在的運命を可視化するための方法を説明します。我々はUbc9、折り畳みセンサーの使用方法を示してい...

生細胞中のタンパク質凝集の4Dイメージング

ここでは、アポトーシス細胞のクリアランスのダイナミクスを研究するための効果的な方法を説明...

アポトーシス細胞のクリアランスのイメージング中に生きる<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚

生体顕微鏡は、生きた動物の様々な生物学的プロセスを画像化可能にする強力なツールです。この記事では、生きたマウスの唾液腺では、このような分泌顆粒として細胞内構造のダイナミクスを画像化するための具体的な方法を提示する。...

蛍光タンパク質を発現する生きたマウスでのイメージング細胞内の構造物の生体顕微鏡

この資料では、プラズマまたは哺乳類細胞における地上州枯渇 (GSD) 超解像顕微鏡法を用いた細胞膜タンパク質の検出のためのプロトコルについて説明します。ここでは、我々...

哺乳類細胞における地上州枯渇超解像イメージング

学ぶHeLa細胞を用いたライブイメージングによるミトコンドリア膜電位とスーパーオキシドレベルの蛍光定量法。神経変性疾患におけるミトコンドリア機能異常のメカニズム解明と治療戦略開発への貢献が期待されます。

HeLa細胞におけるライブイメージングを用いたミトコンドリア膜電位およびスーパーオキシドレベルの蛍光ベースの定量

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