Name: 共焦点顕微鏡によるラット生体骨格筋線維のミトコンドリア密度と縦方向分布の解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-01T13:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: 学ぶ共焦点顕微鏡を用いたラット生体骨格筋線維のミトコンドリア密度と縦方向分布の定量的解析手法。運動や肥満などの生理学的・病理学的ストレス下におけるミトコンドリア動態の理解に貢献します。

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この研究は、モンテレイ工科大学の医学部と肥満研究所の支援を受けました。 図3A は、Scientific Image and Illustrationソフトウェアで作成しました。

ラット筋ミトコンドリアの共焦点顕微鏡分析

<ol><li>Lackner, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaping+the+dynamic+mitochondrial+network%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Shaping the dynamic mitochondrial network.</a> BMC Biology. 12, 35(2014).</li>
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<li>Heinzel, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+of+T-tubules+and+reduced+synchrony+of+Ca2%2B+release+in+myocytes+from+chronically+ischemic+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Remodeling of T-tubules and reduced synchrony of Ca2+ release in myocytes from chronically ischemic myocardium.</a> Circulation Research. 102 (3), 338-346 (2008).</li>
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<li>Pérez-Treviño, P., Pérez-Treviño, J., Borja-Villa, C., García, N., Altamirano, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+T-tubules+and+sarcoplasmic+reticulum+in+ventricular+myocytes+in+early+cardiac+hypertrophy+in+a+pressure+overload+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Changes in T-tubules and sarcoplasmic reticulum in ventricular myocytes in early cardiac hypertrophy in a pressure overload rat model.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 37 (4), 1329-1344 (2015).</li>
<li>Celestino-Montes, A., Pérez-Treviño, P., Sandoval-Herrera, M. D., Gómez-Víquez, N. L., Altamirano, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relative+role+of+T-tubules+disruption+and+decreased+SERCA2+on+contractile+dynamics+of+isolated+rat+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Relative role of T-tubules disruption and decreased SERCA2 on contractile dynamics of isolated rat ventricular myocytes.</a> Life Sciences. 264, 118700(2021).</li>
<li>Song, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orphaned+ryanodine+receptors+in+the+failing+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Orphaned ryanodine receptors in the failing heart.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (11), 4305-4310 (2006).</li>
<li>Houzelle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skeletal+muscle+mitochondrial+dynamics+in+relation+to+oxidative+capacity+and+insulin+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Human skeletal muscle mitochondrial dynamics in relation to oxidative capacity and insulin sensitivity.</a> Diabetologia. 64 (2), 424-436 (2021).</li>
<li>Call, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ulk1-mediated+autophagy+plays+an+essential+role+in+mitochondrial+remodeling+and+functional+regeneration+of+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Ulk1-mediated autophagy plays an essential role in mitochondrial remodeling and functional regeneration of skeletal muscle.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 312 (6), C724-C732 (2017).</li>
<li>Fealy, C. E., Grevendonk, L., Hoeks, J., Hesselink, M. K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+mitochondrial+network+dynamics+in+metabolic+disorders+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle mitochondrial network dynamics in metabolic disorders and aging.</a> Trends in Molecular Medicine. 27 (11), 1033-1044 (2021).</li>
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<li>Schiaffino, S., Hanzlíková, V., Pierobon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relations+between+structure+and+function+in+rat+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Relations between structure and function in rat skeletal muscle fibers.</a> Journal of Cell Biology. 47 (1), 107-119 (1970).</li>
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<li>Kuznetsov, A. V., Javadov, S., Margreiter, R., Hagenbuchner, J., Ausserlechner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+function%2C+structure%2C+and+intracellular+organization+in+situ+in+cardiomyocytes+and+skeletal+Muscles%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial function, structure, and intracellular organization in situ in cardiomyocytes and skeletal Muscles.</a> International Journal of Molecular Sciences. 23 (4), 2252(2022).</li>
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著者らは、利益相反がないことを宣言します。

ミトコンドリアは、高いリモデリング能力を持つ細胞小器官です。ミトコンドリアの動態1として知られるミトコンドリアの融合と分裂のメカニズムの活性化と、ミトコンドリアの代謝回転メカニズムであるミトコンドリアの生合成と特殊なミトコンドリア分解経路(マイトファジー21,22)のバランスによって、その含有量、密度、分布を急速に変化させることができます.ミトコンドリアの含有量と形態は、細胞の種類と発生段階に応じて変化し得、異なる生理学的および病理学的刺激の下でリモデリングすることができる17,22,23,24。したがって、ミトコンドリア形態の研究は半世紀以上にわたって関連してきました25。特に、電子顕微鏡によるミトコンドリアの分析は、複数の研究で適用されている標準的な手法です26。
共焦点顕微鏡による蛍光研究は、異なる繊維深さでのミトコンドリアの生細胞イメージングの能力により、過去数年間で関連性を増しており、さまざまな適応条件および不適応条件における骨格筋におけるミトコンドリアの役割をよりよく理解するのに役立つ可能性があります27。本研究では、共焦点顕微鏡による生きた骨格筋線維中のミトコンドリア密度と分布の解析方法について述べる。生きた骨格筋線維を扱う際の主な課題の1つは、単離プロセスからミトコンドリア共焦点記録までの収縮を回避することです。この目標を達成するために、高MgおよびATPリラックス溶液17を使用して、ファイバーを少なくとも2時間弛緩させ、ファイバー単離プロセス、蛍光色素負荷、および共焦点顕微鏡によるミトコンドリアシグナルの獲得を実行するのに十分な時間を与える。プロトコルの重要なポイントは、高精度で新鮮な組織を必要とするため、繊維を機械的に入手することです。しかしながら、この以前に使用され報告された技術28を用いてラットの筋肉から生存可能な繊維束を得ることは可能である。無傷の繊維を得ることで、筋膜と細胞内環境を保存し、細胞構造間の代謝的および機能的クロストークを維持することができます28,29。
組織や固定細胞での作業とは異なり、共焦点顕微鏡による生細胞イメージング蛍光画像の取得により、さまざまな実験条件の影響をリアルタイムでモニタリングできます。本プロトコルは、ミトコンドリアの密度と分布の変化をリアルタイムで調査し、ここで紹介した細い繊維とOb由来の繊維(図3 および 図4)の例など、実験グループ間の違いを調べるために使用できます。生細胞イメージングは、細胞損傷を軽微な状態で最適な作業条件を標準化することを意味することを常に考慮する必要があります。作業時間、使用する溶液の品質、取得パラメータ、およびレーザーの露光を細かく制御する必要があります。したがって、重要な考慮事項を以下に示します。
筋線維のミトコンドリアは、線維のサイズと長時間のレーザー照射によって引き起こされる可能性のある線維の損傷のために、共焦点顕微鏡で完全に縦方向に記録することはできません。それにもかかわらず、繊維の代表的なサンプルは、この技術の下で記録される。共焦点顕微鏡ではラットの骨格筋線維の全厚さを記録することは可能ですが、これは記録時間が長くなり、レーザー光線への曝露が長くなることを意味します。対照ラットの場合、これらの記録に関する問題は発生していません。ただし、病理学的状態からの繊維は、Obラットからの繊維に見られるように、損傷を受けやすい可能性があります。したがって、異なるZ距離で得られた代表的な共焦点画像のスタックを取得することが好ましい。繊維の厚さの一部のみが記録されている場合、ミトコンドリアの分布と密度は繊維内の位置によって異なる可能性があるため、テストしたすべての繊維で同じ深さでスタックを取ることをお勧めします。IMFの代表的な共焦点画像を得るためには、15 μmを超える深さでシグナルを取得することが推奨され、周辺部に近いSSM集団は避けてください。
共焦点取得の際には、いくつかの重要な考慮事項を考慮する必要があります。まず、倍率、高NA、および液浸媒質を考慮した液浸対物レンズの選択。細胞は親水性のインキュベーション培地で維持されるため、良好なシグナルを得て組織の奥深くまでスキャンするには、インキュベーション培地と浸漬培地の屈折率が類似している必要があります。通常、水浸対物レンズを使用して達成されます。図 3 と 図 4 の共焦点画像は、20 倍、0.7 NA の水浸対物レンズで取得しました。この対物レンズでは、ファイバーの深さをすべて記録することができますが、IMFの代表的な共焦点画像は、高い蛍光強度シグナルと軽微なファイバー損傷で取得できるため、15、18、および21 μmでのスキャンを決定しました。40倍や油浸媒質など、他の倍率も検討できますが、評価する必要があります。
第2に、画像取得のための画素サイズはナイキスト定理に従って計算され、オーバーサンプル(より高いレーザー露光)およびアンダーサンプル(解像度の低下につながる)を回避する適切な画素サイズの選択を可能にする30。計算は、選択した対物レンズの特性と波長(~90 nm)によって異なります。ズームで調整できます。したがって、ズーム設定は 1 つだけで、最適なピクセル サイズ30 が得られます。それにもかかわらず、実際には、ズームは分析する標本の面積にも依存します。したがって、バランスを見つけることで、ナイキスト基準に最も近く、分析する領域にも適合するピクセルサイズで作業できます。図 3 と 図4 は、150nmと190nmのピクセルサイズで取得され、50~80μmのファイバーの全幅の分析が可能になりました。
第3に、ピンボケの光が検出器に入らないように適切なピンホール径を使用する必要があります。典型的には、1エアリーは、焦点30の平面から発信される光子の~80%の検出を可能にするので、最適なピンホールサイズと考えられる。それにもかかわらず、低い蛍光レベルを示すいくつかの染色された生物学的サンプルは、ピンホールの増加を必要とします30。図 3 と 図4 の共焦点画像は、低エアリーで低信号が撮影されたため、ピンホールサイズ3エアリーで取得されました。ピンホールサイズを大きくすることによる信号強度の上昇は、ピントの合っていない捕捉光の増加による分解能の低下につながることを考慮することが重要です。このため、できるだけ1エアリーに近いピンホールサイズを使用することをお勧めします。
適切に取得されると、共焦点画像を処理して、ミトコンドリアの密度と分布に関する定量的な情報を得ることができます。いずれにせよ、信号の定量化を改善するために、解析の前に閾値処理の重要な画像処理ステップを実行する必要があります。この重要なステップでは、ミトコンドリアの正のピクセルと背景の正のピクセルを分離する蛍光強度値が定義されます。閾値は、画像のヒストグラムが背景とミトコンドリアに対応する2つのピークを表示する場合、ミトコンドリアを表すピークのガウス近似によって定義することができる。ただし、各画像でバイモーダル分布が常に達成されるとは限らないため、他の閾値処理方法を適用する必要があります。
このプロトコルでは、2つのピークが分離されていないか、または他のピークが存在する場合に閾値を見つけるように設計されたノンパラメトリックで教師なしの方法であるOtsuの閾値化の実装が説明されています31。Otsuは、生体画像解析のためのオープンソースプラットフォームを使用して簡単に適用できます。ただし、他のしきい値処理方法をテストできます。すべての共焦点画像に同じ閾値法を適用する必要があり、共焦点画像ごとに個別に計算する必要があります。しきい値をスタック全体に適用すると、誤った結果になります。閾値処理後にバイナリ画像が得られると、ミトコンドリア密度とFFTの分析は、このプロトコルに記載されている指示に従うことで簡単に実行できます。ただし、両方の分析を行う場合は、定量誤差につながるため、核と毛細血管を含めないように注意する必要があります。密度に関しては、分析するピクセルまたは総面積からピクセル、または核または毛細血管が占める面積を差し引くだけで十分です。また、FFT解析を行う際には、ミトコンドリアのシグナルがまっすぐであることを確認する必要があります。逆に、ミトコンドリア信号が傾いていると、ミトコンドリアの縦方向分布を表さないプロファイルが生成され、誤ったFFTスペクトルデータが生成される可能性があります。さらに、前処理ステップを適用して、画像のノイズを低減することができます。このプロトコルでは、メディアンフィルタと2Dデコンボリューションを使用した2つのオプションの前処理ステップについて説明します。これらの前処理方法が画像およびミトコンドリア密度含有量に及ぼす影響を補足 図S1に示す。これらの前処理は画質を向上させることができますが、特定の画像の詳細が失われる可能性があることを考慮することが重要です。したがって、これらは注意して使用し、分析されるすべての画像に一貫して適用する必要があります。
その利点にもかかわらず、共焦点顕微鏡は、取得のための最適な条件が実装されている場合、180〜250nmの横方向の分解能(XY)によって制限されます32。ミトコンドリアの直径は~200-700 nmで、共焦点顕微鏡の回折限界に近い。したがって、サブミトコンドリア構造は適切に検出できず33 、このプロトコルに示されている密度およびFFT分析によって評価することはできません。確率的光学再構成顕微鏡法(STORM)、誘導放出枯渇法(STED)ナノスコピー法、または構造化照明顕微鏡法(SIM)などの顕微鏡の他の超解像技術を、サブミトコンドリア構造を分解するために検討することができる32。このプロトコルでは、ミトコンドリアの共焦点イメージはミトコンドリアの膜の潜在性によって決まるfluorophore TMREを使用して得られる。したがって、ミトコンドリアの蛍光強度は、膜電位に応じて変化する可能性があります。この問題を克服するために、データ分析の前にしきい値処理が実行されます。定義された閾値を超えるすべてのピクセルは、蛍光値とは無関係にミトコンドリアシグナルに対して陽性と見なされます。それにもかかわらず、膜電位が非常に低いミトコンドリアは、この技術では解決できないことに注意する必要があります。したがって、ミトコンドリアタンパク質含量の定量に関する補完的な研究が推奨されます。TMREを用いる利点は、共焦点画像をミトコンドリア膜電位解析にも使用できることですが、カルボニルシアニド-p-トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン(FCCP)などの脱共役剤による適切な制御を行う必要があります。また、ミトコンドリアの密度や分布の解析は、膜電位に関係なくミトコンドリアに負荷をかけるミトコンドリア用の緑色蛍光インジケーターを用いて行うことができますが、インキュベーション戦略や共焦点取得設定の標準化が必要です。
ミトコンドリアの構造が必須のミトコンドリアおよび細胞機能に関連していることを考えると、ここに記述されているプロトコルは病気の間にまたは特定の圧力の侮辱によって改造についての貴重な情報を提供できる。この研究は、ミトコンドリアが支配する骨格筋のエネルギー産生などの重要な機能や、ミトコンドリアが他の細胞小器官との相互作用において重要な役割を果たす(収縮と代謝の結合など)の理解を深めることに寄与する可能性がある。プロトコルの指示に従うことで、生きている骨格筋のミトコンドリア密度と分布を推定することができます。プロトコールのステップは、骨格筋束の解剖、共焦点顕微鏡スキャン、画像解析に焦点を当てた3つの主要な段階に分かれており、詳細な手順と重要な考慮事項が含まれています。特に、このプロトコルをさらに最適化して、ユーザーのニーズに応じてファイバー内の完全なミトコンドリア再構成のための追加のZステップを探索することができます。例えば、共焦点画像と解析のステップをテストして、ライブサンプルと固定サンプルのTTなど、同様の分布を持つ細胞構造を研究することができます。

ミトコンドリアは、ミトフシン1、2(Mfn1、Mfn2)、ミトコンドリア外膜と内膜の融合を調節する視タンパク質萎縮1(Opa1)などのタンパク質の発現と活性によって調節される伸長(融合)と断片化(分裂)のバランスによって制御される、非常にダイナミックなネットワークを形成しています。 それぞれ 1,2.ダイナミン関連タンパク質(Drp1)は、Ser6163でリン酸化されると、主にミトコンドリア分裂を調節します。
骨格筋では、ミトコンドリアネットワークが、異なる細胞領域(筋原線維、筋膜、核)への近接性に基づいて、構造的に明確に定義された亜集団に配置されていることが十分に確立されています4,5。筋膜の真下に位置するミトコンドリアを筋膜下ミトコンドリア(SSM)と呼び、収縮フィラメントの間に位置するミトコンドリアを筋原線維間ミトコンドリア(IMF)と呼び、核の周りのミトコンドリア亜集団を核周囲ミトコンドリアネットワーク(PMN)と呼びます。さらに、これらのミトコンドリア亜集団は領域特異的な機能を持ち、代謝的に特殊化していることが示唆されている4,5。
代謝機能や収縮機能を可能にする細胞のエネルギー恒常性の維持は、ミトコンドリアネットワークを介した特定の部位での相互作用やコミュニケーション(IMFやSSMの相互作用など)に大きく依存しています4,6。ミトコンドリアネットワークの相互作用に加えて、ミトコンドリアは他の細胞小器官と相互作用し、構造的および機能的な複合体を形成することもできます。この点に関して、IMFは、筋小胞体(SR)に隣接し、横尿細管(TT)によって形成されるCa2+放出単位(CRU)に近接して配置できることが示されている7。この事実は、ATP合成とアポトーシスの調節におけるミトコンドリアCa 2+取り込みの役割に関連しています。最近では、細胞質のCa2+トランジェントの調節における潜在的な役割も示唆されています8。
TTは、心筋細胞と骨格筋線維の縦軸に沿って周期的に分布する筋腫の陥入であり、IMF分布5と同様に9,10。TTの分布の変化は、収縮機能における役割を考えると、重要な生理学的意味合いを持っています。しかし、これらの変化は主に心筋細胞で評価されています。高速フーリエ変換(FFT)解析を使用すると、距離領域から周波数領域への周期信号の変換が可能になり、信号の周波数と規則性を示すFFTスペクトルが得られます11、12、13。骨格筋線維におけるミトコンドリアネットワークの組織化は、筋肉損傷後の再生中のように、さまざまな代謝条件への適応に不可欠であるという証拠があるが14,15、ほとんどの分析は定性的に行われる。
さらに、ミトコンドリアの機能不全は、いくつかの骨格筋関連(例えば、廃用性萎縮)2 および非筋肉疾患、特に代謝性疾患、および関連する筋肉量の減少(すなわち、萎縮)と関連していることを考えると、骨格筋におけるミトコンドリアネットワークと分布の定量的評価は関連性があります。最近、肥満群(Ob;Zucker fa/fa rats)、およびリーングループ(Lean;Zucker +/+ rats)はFFT17によって同定された。本研究は、ミトコンドリア分布の解析におけるFFTの有用性を実証した。従って、このプロトコルは蛍光性の共焦点顕微鏡検査によって得られるイメージからの生きている骨格筋線維のミトコンドリアを調査する方法論を示す。バックグラウンド閾値化によりミトコンドリア密度を定量化し、FFT解析によるミトコンドリア縦分布の解析についても記載する。ワークフロー スキームを 図 1 に示します。

<table><tbody><tr><td>アデノシン 5'-三リン酸二ナトリウム塩水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6419</td><td></td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラス カバースリップ</td><td>ワーナー・インスツルメンツ</td><td>64-0709</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡ソフトウェア ライカ アプリケーションスイート&nbsp;</td><td>Leica</td><td>2.7.3.9723</td><td></td></tr><tr><td>クレアチンホスホキナーゼ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3755</td><td></td></tr><tr><td>DeconvolutionLab2(DeconvolutionLab_2.jar)</td><td>Biomedical Imaging Group、EPFL</td><td>http://bigwww.epfl.ch/deconvolution/deconvolutionlab2/</td><td></td></tr> <tr><td>ジメチルスルホキシ</td>ド<td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DL-アスパラギン酸カリウム衛星半水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11240</td><td></td></tr><tr><td>エチレングリコール-ビス(2-アミノエチルエーテル)-N、N、N&acute;N&acute;-四酢酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>鉗子</td><td>Miltex</td><td>MH-18</td><td></td></tr><tr><td>HC PL APO 20x/ 0.7 IMM 対物レンズ&nbsp;</td><td>ライカ</td><td>506517</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>アイリスハサミ</td><td>Miltex</td><td>5-304</td><td></td></tr><tr><td>L-(-)-リンゴ酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7397</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン酸 一ナトリウム塩水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1626</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム六水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>Maxchelator</td><td>UCデービスヘルス</td><td>https://somapp.ucdmc.ucdavis.edu/pharmacology/bers/maxchelator/downloads.htm&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>マイクロハサミ</td><td>Miltex</td><td>18-1633</td><td></td></tr><tr><td>Biological-Image Analysisのためのオープンソースプラットフォーム フィジー&nbsp;</td><td>公開、Eliceiri/LOCI group、Jug group、Tomancak labが管理。フィジー</td><td>https://fiji.sc/</td><td></td></tr> <tr><td>ホスホクレアチン二ナトリウム塩水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7936</td><td></td></tr>塩化<tr><td>カリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>PSFジェネレーター (PSF_Generator.jar)</td><td>Biomedical Imaging Group、EPFL</td><td>http://bigwww.epfl.ch/algorithms/psfgenerator/&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>録音室</td><td>ワーナー・インストゥルメンツ</td><td>RC-27N</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>スプレッドシート Microsoft Excel</td><td>Microsoft&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 508</td><td></td></tr><tr><td>テトラメチルローダミン、エチルエステル</td><td>Invitrogen</td><td>T669</td><td></td></tr></tbody></table>

共焦点顕微鏡によるラット生体骨格筋線維のミトコンドリア密度と縦方向分布の解析

Analysis of the Mitochondrial Density and Longitudinal Distribution in Rat Live-Skeletal Muscle Fibers by Confocal Microscopy

ミトコンドリアは、細胞の代謝要件に応じて伸長、断片化、および再生できる細胞小器官です。ミトコンドリアネットワークのリモデリングにより、健康なミトコンドリアは細胞の要求を満たすことができます。しかしながら、この能力の喪失は、異なる病状の発症または進行に関連している。骨格筋では、運動、加齢、肥満などの生理的・病理学的条件において、ミトコンドリア密度や分布の変化が観察されます。したがって、ミトコンドリアネットワークの研究は、これらの状態に関連するメカニズムのより良い理解を提供する可能性があります。
ここでは、ラット由来の生きた骨格筋線維のミトコンドリアイメージングのプロトコルについて説明します。繊維をリラックス溶液中で手動で解剖し、ミトコンドリアの蛍光生細胞イメージングインジケーター(テトラメチルローダミンエチルエステル、TMRE)とインキュベートします。ミトコンドリアシグナルは、XYZスキャンモードを使用して共焦点顕微鏡によって記録され、筋原線維間ミトコンドリア(IMF)ネットワークの共焦点画像を取得します。その後、共焦点画像は閾値化と二値化によって処理されます。二値化された共焦点画像は、ミトコンドリアの正のピクセルを占め、ミトコンドリア密度を得るためにカウントされます。骨格筋のミトコンドリアネットワークは、T尿細管(TT)と同様の周期的な縦方向分布を持つIMF集団の高密度によって特徴付けられます。高速フーリエ変換 (FFT) は、TT の分布を評価するために実行される標準的な分析手法であり、分布頻度と組織のレベルを見つけることができます。このプロトコルでは、FFTアルゴリズムの実装は骨格筋の縦方向のミトコンドリア分布の分析のために記述されている。

本プロトコルに従って、ミトコンドリアの密度および分布の分析は生きている骨格筋で達成することができる。プロトコルは3つの主要な段階に分けられる:骨格筋束の解剖、共焦点顕微鏡検査のスキャンおよびイメージ分析。ワークフローの概要を 図 1 に示します。 図2A は、ペトリ皿内のラット腓腹筋全体を示し、繊維が得られる側頭部に印を付け、 図2B はリラックス液中の繊維束を示しています。共焦点顕微鏡では、蛍光インジケーターTMREを使用して、生きた骨格筋線維の深さに沿ってミトコンドリアを記録することができます。TMREは、ミトコンドリア膜電位20に従ってミトコンドリア内に選択的に蓄積される親油性カチオン性蛍光色素です。
IMFの最適な共焦点画像は、ファイバー内の深さ15 μmを超えるZ距離を選択することで得られます(図3A)。 図3B は、腓腹筋線維のZ距離(15〜21μm)に沿って取得したTMREをロードしたミトコンドリアの代表的なXY共焦点画像を示しています。共焦点画像を閾値処理してバイナリ画像に変換し、ミトコンドリア解析を可能にしました。 図3B (左パネル)は、運動させたリーンラットの繊維を示しています。これは、骨格筋線維ミトコンドリアの線維に沿って一貫したパターンを有するため、予想される共焦点記録を表しています。対照的に、ミトコンドリアの含有量と分布に大きな変化を示すObラット(図3B、右パネル)から繊維を選択しました。 図3C は、ミトコンドリアが占める繊維面積をミトコンドリア密度として表したもので、各二値化画像(パネル B)から得られたものです。予想通り、Ob線維はミトコンドリア密度が低かった。ミトコンドリア密度を15、18、21 μmで取得した3つの共焦点画像に適合させたスタックごとに計算した場合にも、 図3D で観察される分析したZ距離に沿って一貫して定量化しました。
ミトコンドリア密度分析と同様に、TMREなどの生細胞イメージング用の蛍光インジケーターの共焦点スキャンにより、生きた骨格筋におけるミトコンドリアの縦方向の組織を研究することができます。IMFは、TT7に近いIバンドの周期的な組織を提示し、FFTによって分析して、ミトコンドリアシグナルの周波数と組織のレベルを定量化することができる17。図4は、痩せたラットとObラットに由来する腓腹筋に見られるIMFの組織の違いと、FFTによってミトコンドリアシグナルの分布の変化を見つける方法を示しています。図4A、Bは、FFT分析のためにファイバーの中央位置と横方向の位置で選択された縦方向のROIを示しています。FFTを実行する前に、バックグラウンド減算の閾値が計算されます。次に、画像は2値化されます。これらの手順により、ミトコンドリアシグナルの蛍光強度レベルの変動が排除されます。バイナリ画像は、FFTの実行に必要な蛍光分布のプロットプロファイルを提供します。
図4C、D は、パネル A と B で選択したROIをプロットプロファイルとともに示しています(上部パネル)。プロットプロファイルから、リーンラットとオビットラットに由来する繊維間の蛍光分布の違い、および同じファイバー内のROI間の変動を観察できます。各プロットプロファイルについて、それぞれのFFTスペクトルが表示されます(下のパネル)。最大FFTスペクトルのピークは、長手方向の軸に沿ったミトコンドリアシグナル分布のFFT周波数(X軸)を示す。これは、リーンラットの外側および中央のROIで2μmに近い距離値に変換できます。特に、ピークのFFTの大きさはミトコンドリアシグナルの規則性の指標であり、この振幅の変化はミトコンドリア分布の変化を明らかにします。
図4E、Fは、側方ROIと中央ROIをそれぞれ分析したリーンファイバーとObファイバーのFFTスペクトルの違いを示しています。横方向のROI(図4E)では、ミトコンドリアの縦方向分布の頻度は、細い繊維とOb由来の繊維で類似していました。それにもかかわらず、Ob由来ファイバーの最大FFTピークの振幅は高く、これは図4Bの画像で観察された信号のより高い規則性と一致しています。それにもかかわらず、Obの中央ROI(図4F)は、ミトコンドリア分布の重要な変化が存在する場合、リーンと比較してFFTピークが有意に減少する例として観察されます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65306/65306fig01v2.jpg"> 図1:共焦点顕微鏡による骨格筋のミトコンドリア分析のスキーム。 このスキームは、プロトコルの主なステップを3つのフェーズにまとめたものです。第1段階である腓腹筋線維束の解剖は、腓腹筋の分離という3つのステップに細分化され、続いて筋肉の機械的解剖を束に分解して、最終的に実行可能なものを視覚的に選択します。第2段階では、共焦点顕微鏡による生細胞イメージングの取得を行い、蛍光色素(TMRE)と室温で20分間インキュベートしてファイバーをチャンバーに入れます。その後、顕微鏡で適切な設定を行い、共焦点画像の取得を行います。第3段階では、共焦点画像処理とデータ解析を行います。まず、画像処理では、ミトコンドリア密度の計算やFFTによるミトコンドリア分布を行うバイナリ画像を生成するための閾値が必要です。略語:TMRE =テトラメチルローダミンエチルエステル;FFT = 高速フーリエ変換。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65306/65306fig01largev2.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65306/65306fig02.jpg"> 図2:骨格筋束の解剖。(A) ラットの腓腹筋外側頭部(黒矢印)をリラックス液入りペトリ皿で解剖した。 (B) TMREローディング前のリラックス液中の腓腹筋線維束の代表画像。略語:TMRE =テトラメチルローダミンエチルエステル。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65306/65306fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65306/65306fig03.jpg"> 図3:ミトコンドリア密度分析。 (A)骨格筋線維中のIMFミトコンドリアの共焦点スキャンに推奨されるZ距離を表す図。(B)運動したZucker +/+ラット(Lean)および肥満のZucker fa/fa ラット(Ob)からZ距離(深さ15〜21μm)で記録された、骨格筋線維にTMREをロードしたミトコンドリアの一連の共焦点画像。画像は閾値処理によって処理され、バイナリ画像に変換されました。(C)パネル Bで観察された異なるZ距離で得られた共焦点スライスの計算されたマイト密度。(D)パネル Bで観察された画像によって構成されたスタックから得られたマイト密度。パネル Bの画像は65 x 50 μmです。スケールバー = 10 μm。 略語: 有糸分裂密度 = ミトコンドリア密度;IMF = 筋原線維間ミトコンドリア;ob =肥満;SSM = 筋骨下ミトコンドリア。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65306/65306fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65306/65306fig04.jpg"> 図4:FFTによるミトコンドリア分布解析 運動したZucker +/+ラット(Lean、パネル A)および肥満のZucker fa/fa ラット(Ob、パネル B)から得られた骨格筋線維の深さ21 μmで取得した蛍光指示薬TMREを装填したミトコンドリアの代表的な共焦点画像。画像は閾値処理によって処理され、バイナリ画像に変換されました。パネル A (パネル C)とパネル B (パネル D)の横方向および中央のROIと、蛍光強度(上のプロット)とFFTスペクトル(下のプロット)のそれぞれのプロットプロファイル。FFTは、パネル A の39 x 5 μmのROIサイズとパネル Bの50 x 5 μmのROIサイズに対応する幅256ピクセルのROIから計算されました。パネル E は、側方ROIにおけるリーンラット由来のミトコンドリアとObラット由来のFFTスペクトルの違いを示し、パネル F は、中央ROIのFFTスペクトルの違いを示しています。スケールバー = 10 μm。 略語: A.U. = 任意の単位;FFT = 高速フーリエ変換。ROI = 関心領域;ob = 肥満。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65306/65306fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>試薬</td>
			<td>最終濃度:100 mL</td>
			<td>株式 </td>
		</tr><tr><td>K-アスパラギン酸</td>
			<td>100ミリメートル</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>KClの</td>
			<td>20ミリメートル</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>ヘペス</td>
			<td>20ミリメートル</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>L-グルタミン酸</td>
			<td>3ミリメートル</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>リンゴ酸</td>
			<td>3ミリメートル</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>EGTAの</td>
			<td>0.1ミリメートル</td>
			<td>10ミリメートル</td>
		</tr><tr><td>MgClの2</td>
			<td>1 mM 遊離 Mg2+</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>CaCl 2 (カリウム2)</td>
			<td>0.00002 mM 遊離 Ca2+</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>クレアチンリン酸ジ-Na</td>
			<td>5ミリメートル</td>
			<td>500ミリメートル</td>
		</tr><tr><td>クレアチンホスホキナーゼ</td>
			<td>5 U/mL</td>
			<td>200 U/mLの</td>
		</tr><tr><td>MgATPの</td>
			<td>5ミリメートル</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>pH 7.3(NaOHを含む)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>表1:リラックス溶液試薬と濃度。
補足図S1:画像前処理方法の効果。 (A)運動したZucker +/+ラット(痩せた、上段)および肥満のZucker fa /fa ラット(下段)から得られた骨格筋線維中の深さ18μmで取得した蛍光指示薬TMREを装填したミトコンドリアの代表的な共焦点画像と、Otsu'閾値、メディアンフィルターおよびOtsu'閾値を用いた前処理後に得られたそれぞれの画像、 2DデコンボリューションとOtsuの閾値化。(B)異なる方法で前処理を行った後の共焦点画像(パネル A)から得られたマイト密度のプロファイルをプロットします。パネル A の画像は65 x 50 μmです。スケールバー = 10 μm。略語:2D-Decon = 2Dデコンボリューション。有糸分裂密度=ミトコンドリア密度。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65306/Supl%201-rev4.pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

ここでは、ミトコンドリアネットワークスキャン用の共焦点顕微鏡を使用した生きた骨格筋イメージングにより、ミトコンドリア密度と縦方向分布の変化を解析するプロトコルを紹介します。

The mitochondrion is an organelle that can be elongated, fragmented, and renovated according to the metabolic requirements of the cells. The remodeling of ...

ミトコンドリアネットワークのリモデリングは、生理学的ストレスと病理学的状態で行われます。しかし、骨格筋におけるミトコンドリアリモデリングの効果は、まだ完全には解明されていません。このプロトコルはミトコンドリアの変更と細胞機能間の相互作用の私達の理解を高める生きている骨格筋のミトコンドリアの変更の定量化を可能にする。生きた骨格筋での作業には、単離時の繊維の収縮や共焦点スキャン中の画像に対する感度が伴うため、課題があります。このプロトコルは、共焦点顕微鏡検査によるミトコンドリア評価のための生存筋線維の分析を可能にする、リラクゼーション溶液を使用した分離プロセスについて説明しています。私たちのプロトコルは、骨格筋線維のミトコンドリアネットワークを定量的に分析するためのワークフローの欠如に対処します。ここで説明する手順により、ユーザーは、ミトコンドリアの密度と分布の定量化を達成するために、しきい値処理と高速フーリエ分析による画像処理を使用して、共焦点顕微鏡で得られた画像をより有効に活用できます。私たちは、骨格筋の変化、特に逆境時のミトコンドリアダイナミクスとミトコンドリア構造リモデリングの研究と、運動や中間絶食などの介入を通じてそれらをどのように調節できるかに興味を持っています。

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Biology

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