Name: プラズモニックDNAオリガミナノアンテナによる1分子表面増強ラマン散乱測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-21T12:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: 学ぶ プラズモニックDNAオリガミナノアンテナを用いた1分子SERS測定法。AFMとラマン分光の相関により、ナノ粒子間ホットスポットでの単一分子検出とリアルタイム追跡を実現する技術です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この研究は、欧州研究会議(ERC、統合助成金番号772752)の支援を受けました。

1. DNAオリガミフォークアセンブリ
<ol><li>DNAオリガミ構造をワンポットで自己組織化します。まず、15 mM MgCl 2バッファーを添加した1x TAE(トリス[ヒドロキシメチル]アミノメタン[トリス]、酢酸、エチレンジアミン酢酸[EDTA])に、2.5 nMの円形足場鎖M13mp18(7,249ヌクレオチド、材料表を参照)と100 nMの201個の短いオリゴヌクレオチド(表1)を追加します。その後、超純水を用いて全量を100μLに調整します。</li>
	<li>続いてサーモサイクラーで温度勾配によって溶液をアニールし、最初に80°Cに急速に加熱し、次に1°C/12分で80°Cから20°Cに冷却し、次に1°C/6分で20°Cから16°Cに冷却し、続いて16°Cから8°Cに急速に冷却する。</li>
	<li>100 kDa分子量カットオフ(MWCO)アミコンフィルター( 材料表を参照)を使用して、余分なステープルから混合物を精製します。<ol><li>DNAオリガミ溶液100 μLをアミコンフィルターに加え、超純水400 μLを加え、6,000 x g で室温(RT)で8分間遠心分離します。</li>
		<li>フィルターを取り外し、チューブを裏返してシンクのウォッシュアウトを取り除き、フィルターに400μLの超純水を加えて再度遠心分離してろ液を廃棄します。この手順をもう一度繰り返します。</li>
		<li>精製されたナノ構造溶液を回収するには、新しいチューブでフィルターを逆さまにして、製造元の指示に従って遠心分離機(1,000 x g、2分、RT)します( 材料表を参照)。この溶液は、8°Cの冷蔵庫で最大2週間保存できます。 注:アミコンフィルター精製ステップでは、安定性が低下し、得られるDNA折り紙フォークの濃度が低下するため、超純水の代わりに1x TAEバッファーまたは1x TAEに15 mM MgCl2 バッファーを添加したものを使用してください。単一色素分子測定の場合、DNAステープル鎖混合物は、5'末端にTAMRA色素を含む修飾鎖混合物に置き換えられます。この修飾された鎖は、ナノフォークブリッジの中央にあります(表2)。</li>
	</ol></li>
</ol>2.金ナノ粒子(AuNP)コーティング
注:Liuら23プロトコルの修正版を使用してAuNPをコーティングし、コーティングプロセスにはAuNP-DNA溶液の凍結が含まれていました。
<ol><li>遠心分離機(3,500 x g、5分、RT)400 μLの直径60 nmのAuNP溶液(市販品; 材料表参照)を加え、ピペットを用いて、上清を除去した。その後、ペレットを25μLの超純水に再可溶化します。AuNPの最終濃度は~0.3 nMです。</li>
	<li>100 mM トリス-(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)溶液1 μLをチオール修飾DNA(製造元提供の100 μM、 材料表参照)に添加し、RTで10分間インキュベートします。</li>
	<li>インキュベーション後、5 μLの混合物を濃縮AuNP溶液に加え(ステップ2.1)、5秒間ボルテックスし、-20°Cで少なくとも2時間凍結します。</li>
	<li>RTで解凍した後、混合物を遠心分離機(3,500 x g、5分、RT)で、過剰に添加したコーティングDNAを除去した。ピペットを用いて上清を除去し、ペレットを10 μLの水に再溶解します。 注:ナノフォーク上の各AuNPには2つのコーティングストランドがあります(表2)。ステップは、DNAコーティング鎖の配列を除いて同じである。粒子がコーティングされると、それらは非常に安定しています。彼らは冷蔵庫に何ヶ月もそのままとどまることができ、冷凍することさえできます。完全にコーティングされた色素AuNPの場合、コーティングDNA鎖は内部にTAMRA色素を有する。</li>
</ol>3. ドナアセンブリ
<ol><li>コーティングされたAuNP溶液をナノフォーク溶液に、濃度モル比1.5:1で加えます。</li>
	<li>50 mM MgCl2 ストック溶液を使用して、MgCl2を終濃度 4 mM まで添加します。超純水を使用して最終容量を20μLに調整します。</li>
	<li>サーモサイクラー内の温度勾配を用いてDONAをハイブリダイズする。まず、40°Cまで急速に加熱し、次に1°C / 10分で40°Cから20°Cまで冷却し、次に20°Cから8°Cまで急速に冷却します。</li>
</ol>4. ゲル電気泳動
注:DONA溶液中の未結合ナノ粒子は、アガロースゲル電気泳動によって除去されます。
<ol><li>1%アガロースゲルを調製する。このために、0.8 gのアガロースを5 mM MgCl2を添加した80 mLの1x TAEに溶解します。</li>
	<li>2.25 μLのローディングバッファー(30%グリセロール、13 mM MgCl 2、材料の表を参照)を18 μLのDONA溶液に加え、ステップ3.2の4 mMから5 mM MgCl2の最終濃度に到達します。また、ローディングバッファーは、サンプルがゲルのポケット内に留まることを保証します。</li>
	<li>ゲルを氷水浴中で70 Vで60分間流します。ランニングバッファーは、5 mM MgCl 2 を添加した 1x TAE です。</li>
	<li>目的のバンドを切り取り、パラフィンプラスチックフィルムで包んだ顕微鏡スライドに置き、次に2番目のパラフィンプラスチックフィルムで包まれた顕微鏡スライドを使用して溶液を絞り出します。ピペットを使用して、圧搾した液体を500 μLのチューブに集めます。</li>
</ol>5. AFMとラマン測定の共局在化
<ol><li>シリコンチップ( 材料表を参照)を10分間プラズマ処理した後、10 μLの精製DONA溶液と10 μLの100 mM MgCl2 をチップ上で3時間インキュベートします。次に、エタノールと水の1:1混合物(体積比)でチップを2回洗浄し、圧縮空気でブロードライします。次に、チップを磁気ディスクにテープで留め、イメージングのために機器に挿入します。 注意: 測定を開始する前に、ラマン励起レーザーの位置がAFMプローブチップの上になるように調整します。本研究では、HORIBA LabRAM HR Evolution ラマン顕微鏡と HORIBA オメガスコープ AFM を併用した。機器は、ソフトウェアLabSpecとAISTを使用して制御されます。</li>
	<li>AFM測定には、タッピングモード(ACモード)とACCESS-NC-A(共振周波数:300kHz、スプリング定数:45N/m)チップ24を使用してください。ACモードは、1Hzに設定されたスキャンレートを除くすべてのパラメータを自動的に制御します。 注意: AFMイメージングに続いて、AFMチップはラマンレーザーの経路にないように引き出されます。これは、システムにプログラムされたマクロ機能「プローブアウェイ」を使用して行われます。このようにして、AFM画像内の任意の選択されたポイントについて、レーザーはAFMと比較してオフセットなしで同じ位置になります。</li>
	<li>これらのパラメータはすべて測定サンプルに依存するため、ラマン測定に必要なレーザー波長、出力、および蓄積時間を選択してください。<ol><li>完全にコーティングされたTAMRA AuNP測定には、前述のパラメータ(633 nmレーザー、100 μW出力、および1秒の積分時間)を使用してください。</li>
		<li>1回のTAMRA測定には、633 nmレーザー、400 μWの出力、4秒の積分時間など、前述のパラメータを使用してください。</li>
	</ol></li>
	<li>パラメータを調整した後、AFM画像内の目的のDONAの上にカーソルを置きます。ソフトウェアの「カーソルの移動」機能はこれを行います。その後、ラマン測定を開始する。 注:スペクトルを取得するためのさまざまなモードがあります:単一ポイント測定-1次元時間マッピング-単一ポイントが時間25にわたって測定されます。2次元XYエリアマッピングであって、電動ステージがレーザの下を移動して、XYグリッド26内の点のアレイからスペクトルを取得する。</li>
</ol>

プラズモニックDNA折り紙ナノアンテナによる1分子SERS測定

<ol><li>Heck, C., Kanehira, Y., Kneipp, J., Bald, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placement+of+single+proteins+within+the+SERS+hot+spots+of+self-assembled+silver+nanolenses%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%22%5BJournal%5D)">Placement of single proteins within the SERS hot spots of self-assembled silver nanolenses.</a> Angewandte Chemie. 57 (25), 7444-7447 (2018).</li>
<li>Dey, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+origami%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Methods+Primers%22%5BJournal%5D)">DNA origami.</a> Nature Reviews Methods Primers. 1 (1), 13(2021).</li>
<li>Tasciotti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smart+cancer+therapy+with+DNA+origami%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Smart cancer therapy with DNA origami.</a> Nature Biotechnology. 36 (3), 234-235 (2018).</li>
<li>Ijäs, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+interaction+between+doxorubicin+and+DNA+origami+nanostructures+for+customizable+chemotherapeutic+drug+release%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Unraveling the interaction between doxorubicin and DNA origami nanostructures for customizable chemotherapeutic drug release.</a> Nucleic Acids Research. 49 (6), 3048-3062 (2021).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+origami-enabled+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">DNA origami-enabled biosensors.</a> Sensors. 20 (23), 6899(2020).</li>
<li>Kabusure, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+characterization+of+DNA+origami-shaped+silver+nanoparticles+created+through+biotemplated+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Optical characterization of DNA origami-shaped silver nanoparticles created through biotemplated lithography.</a> Nanoscale. 14 (27), 9648-9654 (2022).</li>
<li>Kershner, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placement+and+orientation+of+individual+DNA+shapes+on+lithographically+patterned+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Placement and orientation of individual DNA shapes on lithographically patterned surfaces.</a> Nature Nanotechnology. 4 (9), 557-561 (2009).</li>
<li>Dutta, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+states+and+spin+crossover+of+hemin+studied+by+DNA+origami+enabled+single-molecule+surface-enhanced+Raman+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Molecular states and spin crossover of hemin studied by DNA origami enabled single-molecule surface-enhanced Raman scattering.</a> Nanoscale. 14 (44), 16467-16478 (2022).</li>
<li>Langer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Present+and+future+of+surface-enhanced+Raman+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Present and future of surface-enhanced Raman scattering.</a> ACS Nano. 14 (1), 28-117 (2020).</li>
<li>Jones, R. R., Hooper, D. C., Zhang, L., Wolverson, D., Valev, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+techniques%3A+fundamentals+and+frontiers%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale+Research+Letters%22%5BJournal%5D)">Raman techniques: fundamentals and frontiers.</a> Nanoscale Research Letters. 14 (1), 231(2019).</li>
<li>Blackie, E. J., Le Ru, E. C., Etchegoin, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+surface-enhanced+Raman+spectroscopy+of+nonresonant+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Single-molecule surface-enhanced Raman spectroscopy of nonresonant molecules.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (40), 14466-14472 (2009).</li>
<li>Sepúlveda, B., Angelomé, P. C., Lechuga, L. M., Liz-Marzán, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LSPR-based+nanobiosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Today%22%5BJournal%5D)">LSPR-based nanobiosensors.</a> Nano Today. 4 (3), 244-251 (2009).</li>
<li>Kelly, K. L., Coronado, E., Zhao, L. L., Schatz, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+optical+properties+of+metal+nanoparticles%3A+The+influence+of+size%2C+shape%2C+and+dielectric+environment%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">The optical properties of metal nanoparticles: The influence of size, shape, and dielectric environment.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 107 (3), 668-677 (2003).</li>
<li>Funston, A. M., Novo, C., Davis, T. J., Mulvaney, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmon+coupling+of+gold+nanorods+at+short+distances+and+in+different+geometries%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Plasmon coupling of gold nanorods at short distances and in different geometries.</a> Nano Letters. 9 (4), 1651-1658 (2009).</li>
<li>Niu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+origami-based+nanoprinting+for+the+assembly+of+plasmonic+nanostructures+with+single-molecule+surface-enhanced+Raman+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%22%5BJournal%5D)">DNA origami-based nanoprinting for the assembly of plasmonic nanostructures with single-molecule surface-enhanced Raman scattering.</a> Angewandte Chemie. 60 (21), 11695-11701 (2021).</li>
<li>Fang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantizing+single-molecule+surface-enhanced+Raman+scattering+with+DNA+origami+metamolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Quantizing single-molecule surface-enhanced Raman scattering with DNA origami metamolecules.</a> Science Advances. 5 (9), (2019).</li>
<li>Zhan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+origami+directed+assembly+of+gold+bowtie+nanoantennas+for+single-molecule+surface-enhanced+Raman+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%22%5BJournal%5D)">DNA origami directed assembly of gold bowtie nanoantennas for single-molecule surface-enhanced Raman scattering.</a> Angewandte Chemie. 57 (11), 2846-2850 (2018).</li>
<li>Choi, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+surface-enhanced+Raman+scattering+as+a+probe+of+single-molecule+surface+reactions%3A+promises+and+current+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Single-molecule surface-enhanced Raman scattering as a probe of single-molecule surface reactions: promises and current challenges.</a> Accounts of Chemical Research. 52 (11), 3008-3017 (2019).</li>
<li>Liu, N., Liedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-assembled+advanced+plasmonic+architectures%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">DNA-assembled advanced plasmonic architectures.</a> Chemical Reviews. 118 (6), 3032-3053 (2018).</li>
<li>Acuna, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+enhancement+at+docking+sites+of+DNA-directed+self-assembled+nanoantennas%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fluorescence enhancement at docking sites of DNA-directed self-assembled nanoantennas.</a> Science. 338 (6106), 506-510 (2012).</li>
<li>Shen, B., Kostiainen, M. A., Linko, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+origami+nanophotonics+and+plasmonics+at+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">DNA origami nanophotonics and plasmonics at interfaces.</a> Langmuir. 34 (49), 14911-14920 (2018).</li>
<li>Tapio, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+DNA+origami-based+plasmonic+nanoantenna+for+label-free+single-molecule+surface-enhanced+Raman+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">A versatile DNA origami-based plasmonic nanoantenna for label-free single-molecule surface-enhanced Raman spectroscopy.</a> ACS Nano. 15 (4), 7065-7077 (2021).</li>
<li>Liu, B., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freezing-driven+DNA+adsorption+on+gold+nanoparticles%3A+tolerating+extremely+low+salt+concentration+but+requiring+high+DNA+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Freezing-driven DNA adsorption on gold nanoparticles: tolerating extremely low salt concentration but requiring high DNA concentration.</a> Langmuir. 35 (19), 6476-6482 (2019).</li>
<li>Aliano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AFM%2C+tapping+mode%5BTitle%5D)+AND+%22Encyclopedia+of+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">AFM, tapping mode.</a> Encyclopedia of Nanotechnology. , 99(2012).</li>
<li>Recording Raman spectral images and profiles. Horiba Scientific. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.horiba.com/int/scientific/technologies/raman-imaging-and-spcetroscopy/recording-spectral-images-and=profiles/">https://www.horiba.com/int/scientific/technologies/raman-imaging-and-spcetroscopy/recording-spectral-images-and=profiles/</a> (2023).</li>
<li>Raman Images Explained. Renishaw. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.renishaw.com/en/raman-images-explained-25810">https://www.renishaw.com/en/raman-images-explained-25810</a> (2023).</li>
<li>Kogikoski, S., Tapio, K., von Zander, R. E., Saalfrank, P., Bald, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+enhancement+of+nanoparticle+dimers+self-assembled+using+DNA+origami+nanotriangles%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Raman enhancement of nanoparticle dimers self-assembled using DNA origami nanotriangles.</a> Molecules. 26 (6), 1684(2021).</li>
<li>Heck, C., Kanehira, Y., Kneipp, J., Bald, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amorphous+carbon+generation+as+a+photocatalytic+reaction+on+DNA-assembled+gold+and+silver+nanostructures%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Amorphous carbon generation as a photocatalytic reaction on DNA-assembled gold and silver nanostructures.</a> Molecules. 24 (12), 2324(2019).</li>
</ol>

著者には、競合する金銭的利益またはその他の利益相反はありません。

SM SERSは、研究者がサンプル1内の個々の分子の挙動と相互作用を研究することを可能にする強力なツールです。このような技術は、前例のないレベルの感度でシステムの分析を可能にし、単一分子の基本的な挙動と分子の集合体にわたる化学的または物理的特性の分布に関する新しい洞察を提供し、化学プロセスに関連する中間体を特定するのに役立ちます。ただし、ホットスポットに単一の分子を配置しながら、ホットスポットに十分な表面強調があることを確認するには、非常に困難な場合があります27。このプロトコルに記載されているDONAは、1011倍の表面増強を確実にしながら、2つの金ナノ粒子間のホットスポットに単一の分子を正確に配置することができます。
ナノ粒子間のギャップは、DONAアセンブリがSM SERS研究に必要な表面増強に到達するために重要です。DONAは、60〜80nmのサイズの球状ナノ粒子用に最適化されています。さらに、ナノ粒子の品質は、ナノ粒子とDNAオリガミフォークとのハイブリダイゼーションに大きな影響を与える可能性があります。コーティング工程で使用されるナノ粒子が6ヶ月以上経過すると、ハイブリダイゼーションの効率が低下し始める。
プロトコルのもう一つの重要な側面は、コンポーネント間の正確な比率を必要とするステップに正確に従わなければならないということです、さもなければDONAは正しく形成されません。DNAオリガミフォークは、温度上昇プロトコルに非常に敏感であり、変化は構造の完全性に影響を与えたり、フォークの形成を妨げたりします。
アモルファス炭素の生成は、そのピークが通常、多くの分子の指紋領域(1,200-1,700 cm-1)と同じ範囲にあるため、SERS測定中に重要な問題になります。形成はまだ完全には理解されていませんが、通常、高いレーザー出力または長い積分時間に関連しています28。予防措置として、可能な限り低いレーザー出力と最短の統合時間を使用する必要があります。ただし、目的のSERS信号を取得することとアモルファスカーボンの生成を回避することのバランスをとる必要があるため、これは簡単には達成できません。
DONAは、銀球、金の花、星など、使用できるさまざまな種類と形状のナノ粒子に関するSMシステムとして非常に用途が広いです。さらに、調査中の分子は、手順を変更することなく、ブリッジの中央にあるDNA鎖のみを変更することで簡単に置き換えることができます。シトクロムCのようなタンパク質への切り替えは、架橋にピリジン修飾DNA捕捉鎖を有することによって行うことができ、シトクロムCに結合し、SM SERS測定のホットスポットにあることを保証します22。これはまた、照射するレーザーを柔軟に選択し、潜在的に最大限の強化を与えるレーザーを使用することにつながります。
要約すると、この方法は、DONA構造を組み立て、それらを単一分子表面増強ラマン分光法測定に使用するのに信頼性があります。

DNAオリガミは、DNA鎖を特定の形状やパターンに折りたたむことを含むナノテクノロジー技術です。ナノスケールで精密に制御された構造を作成できることは、DNAオリガミ1の重要な利点の1つです。このような小さなスケールで物質を操る能力は、医学、電子工学、材料科学など幅広い分野に革命を起こす可能性を秘めています2。例えば、DNAオリガミ構造は、癌細胞に直接薬物を送達するために使用されてきた3,4、病気を検出するためのナノスケールセンサー5,6の作成、および材料の表面に複雑なパターンの作成6,7。さらに、DNAオリガミを使用して複雑なナノスケール構造を作成する能力は、ナノスケール8で基本的な生物学的プロセスを研究するための新しい機会を生み出しました。
表面増強ラマン散乱(SERS)は、極めて低濃度の分子を検出および同定する堅牢な分析技術です9。これは、散乱光10の波長の変化であるラマン効果に基づいています。SERSは、吸着された分子のラマンシグナルを増強するためにプラズモニック金属基板を必要とする。この増強は、従来のラマン分光法で測定された同じ分子から得られるシグナルの最大10 11 倍になる可能性があり、SERSは微量の物質を分析するための高感度な方法になります11。
ナノ粒子のラマンシグナル増強は、局在型表面プラズモン共鳴(LSPR)12の励起に基づく電磁増強に大きく起因しています。この現象では、金属ナノ粒子内の電子は、光入射時に金属ナノ粒子の表面の周りで集合的に振動します。これにより、表面プラズモンと呼ばれる電子の定在波が生成され、入射光と共鳴することができます。LSPRは粒子の表面近くの電界を大幅に増強し、粒子の光吸収はプラズモン共鳴周波数で最大になります。表面プラズモンのエネルギーは、金属ナノ粒子の形状およびサイズ、ならびに周囲の媒体13の特性に依存する。プラズモニックカップリングによって、例えば、2つのナノ粒子が直径長の約2.5倍以下の距離で互いに接近している場合など、より高い増強がさらに達成され得る14。近接により、両方のナノ粒子のLSPRが互いに相互作用し、粒子間のギャップ内の電場が数桁増加し、単一のナノ粒子の増強をはるかに超える15、16、17。増強の大きさはナノ粒子間の距離に反比例する。距離が短くなると、単一分子(SM)を検出するのに十分な増強が重要なポイントが現れます18。
DNAオリガミは、プラズモニックナノ粒子を効率的に配置してプラズモニックカップリングを利用および最適化できる重要な技術です19。同時に、目的の分子を光学検出が最も効率的な場所に正確に配置できます。これは、蛍光検出用のDNA折り紙ベースのプラズモニックナノアンテナ20を用いて実証されている。蛍光標識の検出とは対照的に、SERSは分子の直接的な化学的フィンガープリントを検出する可能性を提供するため、単一分子SERSは、化学反応のモニタリングや機構研究だけでなく、センシングにも非常に魅力的です。DNAオリガミは、明確に定義された形状21を有するプラズモニックナノ構造を作製するためのマスクとしても使用することができるが、標的分子をホットスポットに正確に位置決めする可能性は失われる。
共局在原子間力顕微鏡(AFM)とラマン測定を使用して、単一のDNAオリガミナノアンテナ(DONA)からラマンスペクトルを取得することができ、信号増強が最も高い位置に配置された場合は、場合によっては単一の分子からラマンスペクトルを取得できます。DONAは、DNAオリガミフォークと正確に配置された2つのナノ粒子で構成され、DNAオリガミに結合した延長ステープル鎖に相補的なDNAで完全にコーティングされています。DNAハイブリダイゼーションの際、ナノ粒子は、ナノ粒子表面22間に1.2〜2.0nmのギャップを有するDNAオリガミフォークに結合される。このような集合は、有限差分時間領域(FDTD)シミュレーション22から計算されるように、最大1011倍の信号増強を有するナノ粒子間にホットスポットを作成し、したがってSM SERS測定を可能にする。しかしながら、最も高い増強の体積は小さく(1〜10nm3の範囲)、したがって、標的分子をこのホットスポットに正確に配置する必要がある。DNAオリガミフォークは、DNAフォークブリッジと適切なカップリングケミストリーを使用して、2つのナノ粒子間の単一分子の位置決めを可能にします。それにもかかわらず、ラマンスペクトルでそのようなSMを観察することは非常に困難です22。あるいは、ナノ粒子をTAMRA色素などの標的分子で完全にコーティングして、より高いSERS強度21での単一のDONA測定を可能にすることができます。この場合、TAMRAはDNAコーティング鎖に共有結合します(図1)。

<table><tbody><tr><td>100 kDa MWCO Amicon フィルター、0.5 mL</td><td>Merck</td><td>UFC5100BK</td><td></td></tr><tr><td>10x TAE バッファー (0.4 M Tris、0.2 M 酢酸、0.01 M EDTA)</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>T9650</td><td></td></tr><tr><td>60 nm 金球、裸 (クエン酸)</td><td>NanoComposix</td><td>AUCN60</td><td></td></tr><tr><td>ACCESS-NC-A AFM プローブ</td><td>SCHAEFER-TEC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>アガロース粉末</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>AuNP DNAコーティングストランド</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AuNP DNAコーティングストランド(TAMRA)</td><td>SIGMA Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>ヘレウスフレスコ17遠心分離機</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HORIBA OmegaScope with a LabRAM HR evolution</td><td>HORIBA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>7786-30-3</td><td></td></tr><tr><td>Nanofork DNA bridge strand (TAMRA)</td><td>Metabion</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanofork DNA staple strands</td><td>SIGMA Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ParafilmM</td><td>Carl Roth</td><td>CNP8.1</td><td></td></tr><tr><td>Primus 25 Thermocycler</td><td>Peqlab/VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silicon wafer</td><td>Siegert wafer</td><td>BW14076</td><td></td></tr><tr><td>一本鎖足場DNA、p7249型(M13mp18)</td><td>Tilibit nanosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TCEPソリューション</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>51805-45-9</td><td></td></tr></tbody></table>

プラズモニックdnaオリガミナノアンテナによる1分子表面増強ラマン散乱測定

Single-Molecule Surface-Enhanced Raman Scattering Measurements Enabled by Plasmonic DNA Origami Nanoantennas

表面増強ラマン散乱(SERS)は、高い電界増強が必要とされる単一分子を検出する能力を有する。単一分子(SM)SERSは、個々の分子に関する分子固有の分光情報を提供できるため、他のSM検出技術よりも詳細な化学情報が得られます。同時に、バルク材料のラマン測定では隠されているSM測定からの情報を解明する可能性があります。このプロトコルは、原子間力顕微鏡(AFM)およびラマン分光法と組み合わせたDNAオリガミナノアンテナ(DONA)を使用したSM SERS測定の概要を示しています。DNAオリガミフォーク構造と2つの金ナノ粒子を組み合わせてDONAを形成し、それらの間に1.2〜2.0nmのギャップがあります。これにより、最大10個の11倍SERSシグナル増強が可能になり、単一分子の測定が可能になります。このプロトコルはさらに、SERSホットスポットへの単一の分析物分子の配置、AFMイメージングのプロセス、およびその後のラマンイメージングのオーバーレイにより、単一のDONA内の分析物を測定することを実証しています。

プロトコルに従って、DNAオリガミフォークが正しく組み立てられていることを確認する必要があります。フォークの構造を調べるための好ましい方法はAFMイメージングです。ほとんどのフォークは、腕が折れていない、しっかりしていると予想されます。一方、アーム間のブリッジは、直径が小さく柔軟性が高いため、画像化が困難です。また、非常に鋭いAFMチップも必要です(図2)。
AuNPコーティングプロセスの各ステップでの溶液の色の変化は、すべてが正しく機能することを示しています。色はAuNPだけで濃い赤から始まりますが、DNAが追加されるとすぐに濃い紫がかった赤に変わります。凍結すると色が紫色に変わり、解凍後、濃い赤に戻ります(図3A)。 図3B は、裸のAuNPおよびDNAでコーティングされたAuNPの吸光度スペクトルを示しています。
その後、DONAの組み立てステップでは、プロセス全体を通して色が濃い赤のままです。アガロースゲル精製中、サンプル内で最も速く走るバンドである遊離AuNPバンドの上に二量体バンドが現れます。この二量体バンドはDONAに対応し、その後切り取られて圧搾され、サンプルが抽出されます(図4)。
最後に、共局在測定のために、DONAを求めてサンプルのAFMイメージングが実行されます(図5)。その後、単一のDONAからのラマンスペクトルを収集して比較し、得られたスペクトルがTAMRA分子からのものであることを確認します(図6)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65310/65310fig01.jpg"> 図1:DNAオリガミフォークと完全に組み立てられたDONAの概略図 。 (A)90ヌクレオチド長のブリッジを有するDNAオリガミフォークの寸法。(B)2つのAuNPとDNA折り紙フォークを間に挟んだ、組み立てられたDONAの概略的な側面図。(C)ブリッジの中央にあるSMの配置位置を示す組み立てられたDONAの概略上面図。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65310/65310fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65310/65310fig02.jpg"> 図2:組み立て後のDNA折り紙フォークのAFM画像。 フォークは整形式で、一部のフォークに橋が見えます。フォークの高さは1.5〜2 nmです。スケールバー= 500 nm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65310/65310fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65310/65310fig03.jpg"> 図3:AuNPの発色と吸光度スペクトル 。 (A)異なるステップでのAuNP溶液の色を示すチューブ。(1)裸のAuNP溶液の深赤色。(2)AuNPにコーティングDNAを添加した後の暗紫がかった赤色。(3)コーティングDNA-AuNP混合物を凍結した後の紫色。(4)解凍後、色は濃い赤に戻ります。(B)60 nmのAuNPsの吸光度スペクトル、裸のAuNPs(チューブ1)からDNAコーティングされたAuNPs(チューブ4)への吸光度ピークのシフトを示す。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65310/65310fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65310/65310fig04.jpg"> 図4:DONA溶液のアガロースゲル。 両方のレーンに同じサンプルがあり、ダイマーバンド(DONA)とフリーAuNPバンドの両方がはっきりと見えます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65310/65310fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65310/65310fig05.jpg"> 図5:DONAのAFM画像。 (A)画像は複数のDONA構造を示しています。このAFM画像は、共局在測定に使用されます。(B)丸で囲んだDONAの拡大画像とDONAの垂直断面。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65310/65310fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65310/65310fig06.jpg"> 図6:完全にコーティングされたTAMRA AuNPと単一のTAMRA分子を備えたDONAのSERSスペクトル。 垂直のグリッド線は、TAMRAの主なピークを示しています。主なタムラピークは、完全にコーティングされたタムラAuNPに見られます。SM TAMRAスペクトルの信号対雑音比は低いですが、主なピークは識別可能です:1,360 cm-1:C-Cストレッチ。1,509 cm-1:C = Cストレッチ;1,536 cm-1:C = Cストレッチ;1,654 cm-1:C=Oストレッチ。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65310/65310fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
表1:DNA折り紙フォークステープルのリスト。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65310/65310_Table%201_Nanofork%20staple%20%20strands%20list.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
表2:修飾DNA鎖のリスト。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65310/65310_Table%202_DNA%20modified%20%20strands.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

このプロトコルは、DNAオリガミナノアンテナ(DONA)と共局在原子間力顕微鏡(AFM)およびラマン測定を組み合わせた単一分子表面増強ラマン散乱(SERS)測定を実証します。

プラズモニックDNAオリガミナノアンテナによる1分子表面増強ラマン散乱測定

Surface-enhanced Raman scattering (SERS) has the capability to detect single molecules for which high field enhancement is required. Single-molecule (SM) ...

私たちの研究は、表面増強ラマン散乱またはソースによって単一分子を検出するための新しいツールを開発することを目的としています。これは、分子の化学的フィンガープリントを提供し、単一分子を検出するのに十分な感度を持つ唯一の技術です。このようにして、化学反応に関する詳細な機構情報を得ることができる。DNAオリガミナノ構造は、プラズモニックナノ粒子と標的分子の両方を正確に位置決めするために使用されています。そして、これが必要なのは、増強されたラマン散乱は、ホットスポットと呼ばれるナノ粒子間の小さなナノメートル体積に由来するためです。そして今、私たちはまさにこの目的のために、新しいプラズモニックDNAオリガミナノアンテナを作成しました。主な課題は、2つのナノ粒子間のホットスポットに標的分子を配置し、正確に1つのナノアンテナ構造からラマンデータを収集することです。大量のデータを収集し、原子間力顕微鏡間の効率的な相関を収集するには、ラマン分光法を行う必要があります。プラズモニックDNAオリガミナノアンテナは、標的分子がホットスポット内のナノ粒子間に正確に配置されている多数のプラズモニック二量体の再現性のある生成を可能にします。また、AFMデータとラマンデータの相関関係により、検出される分子が1つだけであることを確認できます。色素分子やタンパク質などの単一分子をリアルタイムで追跡し、ホットスポットでの挙動や環境中の化学変化に対する反応を追跡できるようになりました。例えば、単一のヒト分子のスピン状態の変化が最近モニターされた。将来的には、化学反応を単一分子レベルでモニタリングし、その反応機構の研究を目指しています。さらに、この技術を使用して、医学的に関連する生体分子を非常に高い感度で検出することができます。

single-molecule-surface-enhanced-raman-scattering-measurements

Research

JoVE Journal

Chemistry

化学

私たちは、固定化されたタンパク質やアプタマーとナノ構造基板と対峙するナノ生物学的システムの作製と特性評価について説明します。ナノ構造基板のリソグラフィー作製、バイオ機能化、表面増強ラマン分光法(SERS)の特性評価を含む関連する実験ステップが報告されています。表面固定化タンパク質のSERS検出、およびタンパク質-リガンドおよびアプタマー-リガンド結合のプローブが実証されています。...

表面EBL作製したナノ構造基板を用いた生体分子のラマン分光検出の強化

ベンチトップRCA洗浄や酸化ケイ素の誘導体化など、DNAオリガミ研究で使用される基質の再現性のある洗浄プロセスが説明されています。表面調製、DNA折り紙の堆積、乾燥パラメータ、および簡単な実験セットアップのプロトコルが示されています。...

DNA折り紙解析と実験のためのマイカとシリコン基板の作製

金ナノロッドの DNA 折り紙ベース アセンブリに強いキロプティカル特性をもつキラル プラズモニック metamolecules の詳しいプロトコルについて述べる。プロトコルは、キラル構成に限定されない、様々 なプラズモニック...

DNA 折り紙テンプレートを用いたカイラル プラズモニック Metamolecules に金ナノロッドのアセンブリ

ここでは、DNA折り紙形状を誘導テンプレートとして用いて基質上に離散的で正確な無機ナノ構造を作成するプロトコルについて述べた。この方法は、透明基板(サファイア)上にプラズモニックゴールド弓形アンテナを作成することによって実証されています。...

センシング用途のための無機構造のDNA折り紙媒介基板ナノパターニング

本研究では、ラベルフリーの生細胞バイオイメージングを示し、2つの細菌株を検出するために、良好な生体適合性を有する低コストの表面増強ラマン散乱(SERS)ベースの指紋ナノプローブを開発し、非破壊法で生細胞のSERSスペクトルを取得する方法を詳細に示した。...

Au@Carbonドットナノプローブに基づくラベルフリー表面増強ラマン散乱バイオアナリシス

我々は、ポリエチレングリコール（PEG）を用いてガラス表面を不動態化するための方法を記載している。このプロトコルは、表面洗浄、表面機能化、およびPEGコーティングをカバーしています。私たちは、既存の方法に比べて不動態の優れた品質が得られ2回のラウンドでのPEG分子で表面を処理するための新たな戦略を、ご紹介します。...

単一分子タンパク質研究のための表面パッシベーション

DNAオリガミは、DNA分子の自己組織化をプログラムすることにより、精密なナノスケールの物体を製造するための強力な方法です。ここでは、DNAオリガミからの生体応答型ロボットのフォールディング、その精製、および透過型電子顕微鏡イメージング(TEM)のためのネガティブ染色のプロトコルについて説明します。...

DNA折り紙からバイオ応答ロボットの折りたたみとキャラクタリゼーション

ここでは、強力な磁気モーメントと強い近赤外（NIR）吸光度磁気プラズモニックナノ粒子の合成のためのプロトコルを記述します。このプロトコルはまた、分子特異的な標的化を必要とするさまざまな生物医学アプリケーションのためのFc部分を介してナノ粒子への抗体結合が含まれています。...

Immunotargeted磁気プラズモニックナノクラスターの合成

製造や化学汚染物質（ すなわち、農薬フェルバムと抗生物質アンピシリン）の検出のためのラマン分光（SERS）アッセイ強化フィルタベースの表面を実行するための手順が提示されています。...

化学汚染物質の迅速検出のためのラマン分光アッセイ強化フィルターベースの表面

二酸化炭素(CO2)誘起ゲル化による生体高分子ベースのエアロゲルの新しい製造方法が示されています。この技術は、加圧二酸化炭素(5 MPa)をバイオポリマーハイドロゲルの製造に利用し、超臨界CO2(12...

グリーン溶剤を使用したバイオポリマーエアロゲルの調製

学ぶ プラズモニックDNAオリガミナノアンテナを用いた1分子SERS測定法。AFMとラマン分光の相関により、ナノ粒子間ホットスポットでの単一分子検出とリアルタイム追跡を実現する技術です。

プラズモニックDNAオリガミナノアンテナによる1分子表面増強ラマン散乱測定

さらに動画を探す