Name: 有機金属骨格の毒性プロファイルのリアルタイム評価のための電気セル-基板センシング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 53 s
Description: 学ぶ電気セル-基板インピーダンスセンシング（ECIS）による有機金属骨格の毒性評価法。ヒト肺上皮細胞へのリアルタイム・ハイスループットモニタリングで、時間依存性・用量依存性の細胞応答を解析し、生物医学応用への安全性評価に貢献します。

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この研究の一部は、国立総合医学研究所(NIGMS)のT32プログラム(T32 GM133369)と国立科学財団(NSF 1454230)によって資金提供されました。さらに、WVU共有研究施設と応用生物物理学の支援とサポートが認められています。

電気セル基板センシングによるMOFによる細胞挙動変化の評価

著者らは、この研究における利益相反はないと報告している。

以前の分析では、ECISを使用して、分析物(すなわち、カーボンナノチューブ35、薬物43、またはナノクレイ16)にさらされた細胞の挙動を評価できることが示されました。さらに、Stueckleらは、ECISを使用して、ナノクレイとその副産物に曝露されたBEAS-2B細胞の毒性を評価し、細胞の挙動と付着がそのような材料の物理化学的特性に依存することを発見しました42。ここでは、MOFへの曝露に応答してBEAS-2B細胞の変化の可能性を決定し、in vitroの細胞系に対するZIF-8の有害な影響をすべてハイスループットかつリアルタイムで区別することを目的とした知識体系に貢献することを提案しました。
分析は、最初にフレームワーク特性の評価を可能にし、したがって、細胞挙動の変化を試験されたMOFの物理化学的特性に関連付けるのを助ける44...

金属有機構造体(MOF)は、有機溶媒中で金属イオンと有機リンカー1,2の組み合わせによって形成されるハイブリッドである。このような組み合わせの多様性により、MOFは構造の多様性3、調整可能な多孔性、高い熱安定性、および高い表面積4,5を備えています。このような特性により、ガス貯蔵6,7から触媒作用8,9まで、および造影剤10,11から薬物送達ユニット12,13まで、さまざまな用途で魅力的な候補となります。ただし、このようなアプリケーションへのMOFの実装により、ユーザーと環境の両方に対する安全性に関する懸念が生じています。予備的な研究では、例えば、細胞がMOF合成に使用される金属イオンまたはリンカーにさらされると、細胞機能と成長が変化することが示されています1,14,15。例えば、Tamames-Tabarらは、ZnベースのMOFであるZIF-8 MOFが、ZrベースおよびFeベースのMOFと比較して、ヒト子宮頸がん細胞株(HeLa)およびマウスマクロファージ細胞株(J774)においてより多くの細胞変化をもたらしていることを実証した。このような効果は、おそらくZIF-8の金属成分(すなわち、Zn)によるものであり、フレームワークの崩壊およびZnイオン放出時に細胞のアポトーシスを誘発する可能性がある1。同様に、Gandara-Loeらは、CuベースのMOFであるHKUST-1が、10 μg/mL以上の濃度で使用された場合、マウス網膜芽細胞腫細胞の生存率を最も低下させることを実証しました。これはおそらく、このフレームワークの合成中に取り込まれたCu金属イオンによるものであり、一度放出されると、露出した細胞15に酸化ストレスを誘発する可能性がある。
さらに、分析は、異なる物理化学的特性を有するMOFへの曝露が、曝露された細胞の異なる応答につながる可能性があることを示した。例えば、Wagnerらは、不死化ヒト気管支上皮細胞の曝露に使用されるZIF-8およびMIL-160(Alベースのフレームワーク)が、フレームワークの物理化学的特性、すなわち疎水性、サイズ、および構造特性に依存する細胞応答をもたらすことを実証しました16。補完的に、Chenらは、ヒト正常肝細胞(HL-7702)に曝露された160 μg/mLの濃度MIL-100(Fe)が、おそらくこの特定の骨格の金属成分(すなわちFe17)に起因する細胞生存率の最大の損失を引き起こすことを実証した。
これらの研究は、物理化学的特性と曝露濃度に基づいて細胞系に対するMOFの有害な影響を分類しているため、特に生物医学分野でのフレームワークの実装に関する潜在的な懸念が生じていますが、これらの評価のほとんどは単一時点の比色アッセイに基づいています。例えば、(3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド)テトラゾリウム(MTT)および水溶性テトラゾリウム塩(WST-1)アッセイを使用した場合、これらの生化学的試薬は、細胞も曝露された粒子との相互作用時に偽陽性につながる可能性があることが示されました18。テトラゾリウム塩と中性赤色試薬は、粒子の表面への高い吸着または結合親和性を有することが示され、その結果、薬剤信号干渉が生じた19。さらに、MOFに曝露された細胞の変化を評価するために使用されることが以前に示されたフローサイトメトリーなどの他のタイプのアッセイ20,21では、粒子の有害な影響の実行可能な分析を検討するには、大きな問題を回避する必要があることが示されました。特に、粒子のサイズの検出範囲、特にMOFによって提供されるものや、細胞が変化する前にキャリブレーションに使用される粒子の参照によって提供されるような混合集団では、対処する必要があります22。また、このようなサイトメトリーアッセイのための細胞標識中に使用される色素も、細胞が曝露されたナノ粒子を妨害する可能性があることが示された23。
この研究の目的は、リアルタイムのハイスループット評価アッセイを使用して、選択したMOFへの曝露時の細胞挙動の変化を評価することでした。リアルタイム評価は、曝露のウィンドウに関連する時間依存の影響に関する洞察を提供するのに役立ちます16。さらに、それらは、細胞-基質相互作用、細胞形態、および細胞-細胞相互作用の変化、ならびにそのような変化が目的の材料の物理化学的特性および曝露時間にそれぞれどのように依存するかに関する情報を提供する24,25。
提案されたアプローチの有効性と適用性を実証するために、ヒト気管支上皮(BEAS-2B)細胞、ZIF-8(ゼオライトイミダゾレート16の疎水性フレームワーク)、および電気細胞-基質インピーダンスセンシング(ECIS)を使用しました。BEAS-2B細胞は肺曝露のモデルであり26、以前は、ナノクレイとその熱分解副産物への細胞の曝露時の変化を評価するために使用されてきました26、27、28、および単層カーボンナノチューブ(SWCNT)18などのナノ材料の毒性を評価します。さらに、このような細胞は、肺上皮機能のモデルとして30年以上にわたって使用されている29。ZIF-8は、触媒作用30におけるその幅広い実装、およびバイオイメージングおよび薬物送達32のための造影剤31として、したがってそのような用途中の肺曝露の拡張の可能性のために選択された。最後に、非侵襲的なリアルタイム手法であるECISは、以前は、分析対象物(材料と薬物の両方)とばく露された細胞との間のさまざまな相互作用の結果として、細胞の接着、増殖、運動性、および形態の変化を評価するために使用されていました16,26.ECISは、交流(AC)を使用して、金電極に固定化されたセルのインピーダンスを測定し、インピーダンスの変化により、セル-金基板界面での抵抗と静電容量の変化、セル-セル相互作用によって誘発されるバリア機能、およびそのような金電極のセル層被覆率に関する洞察が得られます33、34。ECISを使用すると、ナノスケールの分解能で非侵襲的でリアルタイムの方法で定量的な測定が可能になります26,34。
この研究では、MOFによる細胞挙動の変化をリアルタイムで評価することの単純さと容易さを、シングルポイントアッセイ評価と比較します。このような研究は、関心のある他の粒子への曝露に応答して細胞プロファイルを評価するためにさらに外挿することができ、したがって、安全な設計による粒子試験とその後の実装の支援を可能にします。さらに、この研究は、単一点評価である遺伝的および細胞アッセイを補完する可能性があります。これは、細胞集団に対する粒子の有害な影響について、より多くの情報に基づいた分析につながる可能性があり、そのような粒子の毒性をハイスループット方式でスクリーニングするために使用することができる16,35,36。

<table><tbody><tr><td>&nbsp;4-[3-(4-イドフェニル)-2-(4-ニトロフェニル)-2H-5-テトラゾリオ]-1,3-ベンゼンジスルホン酸(WST-1アッセイ)&nbsp;</td><td>Roche</td><td>5015944001</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA (1x)</td><td>Gibco</td><td>25255-056</td><td></td></tr><tr><td>100 mm プレート</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>1300 シリーズ A2 バイオフュームフード</td><td>Thermo Scientific</td><td>323TS</td><td></td></tr><tr><td>2510 ブランソン バス超音波処理装置</td><td>プロセス機器 &サプライ社&nbsp;</td><td>251OR-DTH</td><td></td></tr><tr><td>2-メチルイミダゾール、97%</td><td>Alfa Aesar</td><td>693-98-1</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 滅菌マイクロチューブ</td><td>Argos Technologies</td><td>T2076S-CA</td><td></td></tr><tr><td>50 mL&nbsp; チューブ&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>96W10idf ウェルプレート</td><td>Applied Biophysics&nbsp;</td><td>96W10idf PET</td><td></td></tr><tr><td>96ウェルプレート</td><td>フィッシャーブランド</td><td>FB012931</td><td></td></tr><tr><td>Biorender</td><td>Biorender</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Countess cell counting chamber slides</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL automated cell counter</td><td>Life Technologies</td><td>C0916-186A-0303</td><td></td></tr><tr><td>Denton Desk V sputter and carbon coater</td><td>Denton Vacuum</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ジメトリースルホキシド&nbsp;</td><td>コーニング</td><td>25-950-CQC</td><td></td></tr><tr><td>DPBS /修正</td><td>Cytiva</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコの修正イーグル ミディアム</td><td>コーニング</td><td>10-014-CV</td><td></td></tr><tr><td>ECIS-Z&シータ;</td><td>応用生物物理学&nbsp;</td><td>ABP 1129</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>Version 2301</td><td></td></tr><tr><td>Falcon tubes (15 mL)</td><td>Corning</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>Fetal wevine serum</td><td>Gibco</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td>FLUOstar OPTIMA plate reader</td><td>BMG LABTECH</td><td>413-2132</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism Software (9.0.0)</td><td>GraphPad Software, LLC</td><td>Version 9.0.0</td><td></td></tr><tr><td>HERAcell 150i CO2インキュベーター</td><td>Thermo Scientific</td><td>50116047</td><td></td></tr><tr><td>Hitachi S-4700 エネルギー分散型X線を搭載した電界放出形走査電子顕微鏡&nbsp;</td><td>日立ハイテクノロジーズ株式会社</td><td>S4700・EDAX TEAM 解析ソフト</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td>National Institutes of Health</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>不死化ヒト気管支上皮細胞</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRL-9609</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp freezer</td><td>フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>メタノール、99%</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>パラフィルムシーリングフィルム</td><td>ラボデポ</td><td>HS234526A</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ステプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend X1R遠心分離機&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004220</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall T 6000B</td><td>DU PONT</td><td>&nbsp;T6000B</td><td></td></tr><tr><td>トリパン ブルー、PBS</td><td>MP Biomedicals、LLC</td><td>1691049</td><td></td></tr><tr><td>真空チャンバー</td><td>Belart</td><td>999320237</td><td></td></tr><tr><td>硝酸亜鉛六水和物、98% 超純度</td><td>Acros Organic</td><td>101-96-18-9</td><td></td></tr> の 0.4% 溶液</tbody></table>

有機金属骨格の毒性プロファイルのリアルタイム評価のための電気セル-基板センシング

Electric Cell-Substrate Sensing for Real-Time Evaluation of Metal-Organic Framework Toxicological Profiles

金属有機構造体(MOF)は、有機溶媒中で金属イオンと有機リンカーが配位して形成されるハイブリッドです。生物医学および産業用途でのMOFの実装は、その安全性に関する懸念につながっています。本明細書において、選択されたMOF、ゼオライトイミダゾールフレームワークのプロファイルを、ヒト肺上皮細胞への曝露時に評価した。評価のためのプラットフォームは、リアルタイム技術(すなわち、電気セル基板インピーダンスセンシング[ECIS])でした。この研究では、曝露された細胞に対する選択されたMOFの有害な影響のいくつかを特定し、議論します。さらに、この研究は、包括的な細胞評価のために他の生化学的アッセイと比較してリアルタイム法を使用することの利点を示しています。今回の研究では、観察された細胞挙動の変化は、異なる物理化学的特徴を持つMOFへの曝露と、使用されているそれらのフレームワークの投与量によって誘発される可能性のある毒性を示唆している可能性があると結論付けている。細胞の挙動の変化を理解することにより、物理化学的特性を具体的に調整することにより、生物医学的アプリケーションに使用されるMOFのセーフバイデザイン戦略を改善する能力が予測されます。

この研究は、一般的な in vitro モデル細胞株39 (BEAS-2B)を使用して、実験室で合成されたMOFへの曝露時の細胞挙動の変化を評価するためのECISの実現可能性と適用性を実証することを目的としていました。これらの変化評価は、従来の比色アッセイによる分析によって補完されました。
フレームワークの物理化学的特性は、採用された方法の再現性、得られた結果の妥当性、およびそのような結果の適切な議論を保証するために最初に評価されました。たとえば、ZIF-8の表面形態の分析はSEMを介して行われました。画像は、フレームワークが菱形十二面体の形態40を示し、平均サイズが62.87nm±9.61nmであることを示しました(図1A)。MOFの元素組成は、EDX分光法によって決定されました。その結果、ZIF-8の主な組成はC、N、Zn(すなわち、イミダゾレートリンカーと金属イオンZn<sup clas...

以下の研究では、リアルタイムのハイスループットスクリーニング技術である電気セル基板インピーダンスセンシング(ECIS)を利用して、選択された金属有機フレームワークの毒物学的プロファイルを評価します。

Metal-organic frameworks (MOFs) are hybrids formed through the coordination of metal ions and organic linkers in organic solvents. The implementation of ...

私の研究は、有機溶媒中の有機リンカー中の金属イオンを組み合わせて形成されるハイブリッドである金属有機フレームワークへの曝露によるヒト肺上皮細胞の挙動の変化を評価することを目的としています。この研究は、金属有機フレームワークの物理的および化学的組成、ならびにそれらの細胞曝露率が、時間および用量依存的にヒト肺上皮細胞の挙動に影響を与えることを実証した。これは、リアルタイムで高スループットで記録できます。私たちの研究は、細胞系への曝露時の金属有機フレームワークの毒性のメカニズムを評価、理解するのに役立ちます。現在の方法では、リアルタイムかつ高スループットの方法で連続的な細胞モニタリングが可能です。さらに、この方法は外部試薬に依存しないため、曝露に使用されるフレームワークとの干渉の可能性を低減します。私たちの研究室では、ナノ材料曝露に関連する毒性のメカニズムの理解と評価に引き続き焦点を当て、そのような情報を使用して、ユーザーや環境へのリスクを最小限に抑えて生物医学アプリケーションに実装できる新しい安全なシステムを合成します。

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