DNA-タンパク質架橋とその翻訳後修飾の定量的検出

本プロトコルは、トポイソメラーゼ阻害剤およびホルムアルデヒドによって誘導されるユビキチン化、SUMO化、およびADPリボシル化を含む、DNA-タンパク質架橋(DPC)およびそれらの翻訳後修飾(PTM)を検出および定量するための改変方法を強調し、それによってDPCおよびそのPTMの形成および修復の研究を可能にする。

さて、私の研究はDNA損傷修復に焦点を当てています。特に、トポイソメラーゼ阻害剤、PARP阻害剤、およびアルデヒドによって誘導されるDNA損傷の修復。私は、細胞がこれらの薬剤によって誘導されるDNAタンパク質架橋を修復する分子メカニズムを説明しようとしています。

DNAタンパク質架橋の修復における最近の進歩には、DNAタンパク質架橋の新しい修復経路の同定と、これらの修復経路を制御する移植後修飾メカニズムが含まれます。酵素アッセイのin vivo複合体およびDNA付加体回収アッセイへの迅速なアプローチは、DNAタンパク質架橋を測定するために最もよく使用される方法であり、トポイソメラーゼ1つのDNAタンパク質架橋などの特定のDNAタンパク質架橋は、特異的抗体を用いた免疫蛍光によって検出することができる。最大の課題の1つは、DNAタンパク質架橋の修復における翻訳後修飾の役割の研究です。

翻訳後修飾因子結合DNAタンパク質クロスリンクの存在量が非常に少ないため、濃縮および検出は非常に困難でした。このプロトコルは、脱ユビキチル化、SUMO化、およびADPリボシル化DNAタンパク質架橋の検出の詳細を提供し、研究者がさまざまなソースからのDNAタンパク質架橋の修復におけるこれらの修飾の速度論と形成を研究することを可能にします。DNAタンパク質架橋の検出のための他のプロトコルには、それらの翻訳後修飾の検出を記述するステップは含まれていません。

このプロトコルは、修飾を誘発するための薬物濃度および期間、修飾を分離および検出する方法、ならびに修飾を安定化する方法などの詳細を提供する。そのため、DNAタンパク質架橋の修復において、移植後のいくつかの修飾が確認されています。彼らがどのように修理を調整するかはほとんど不明のままです。

したがって、結果として、これらの変更間の相互作用はさらなる調査を必要とします。