Name: 希少細胞集団におけるプロモーター中心の時空間ゲノム構造を研究するための統合ワークフロー (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-21T14:20:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: 学ぶ希少細胞における低入力Capture Hi-C（liCHi-C）を用いたプロモーター中心の時空間ゲノム構造解析。遺伝子制御と染色質相互作用の新たな知見を得るための統合的アプローチを紹介します。

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原稿に対するフィードバックを提供してくれたハビエールラボの他のメンバーに感謝します。我々は、CERCAプログラム、カタルーニャ州政府、及びジョセップ・カレーラス財団の制度的支援に感謝する。この研究は、FEDER/スペイン科学イノベーション省(RTI2018-094788-A-I00)、欧州血液学会(4823998)、およびスペインがん協会(AECC)LABAE21981JAVIによって資金提供されました。BMJはラカイシャ銀行財団ジュニアリーダープロジェクト(LCF/BQ/PI19/11690001)から資金提供を受け、LRはAGAUR FIフェローシップ(2019FI-B00017)から資金提供を受け、LT-DはFPIフェローシップ(PRE2019-088005)から資金提供されています。バルセロナ自治大学の生化学および分子生物学博士課程の支援に感謝します。資金提供者の誰も、実験計画や原稿の執筆には関与していませんでした。

希少細胞におけるプロモーターインタラクトームの研究に対する包括的なアプローチ

著者は開示するものは何もありません。

liCHi-Cは、PCHi-Cと同様の実験フレームワークを使用して、細胞数を大幅に削減した高分解能プロモーターインタラクトームライブラリを生成する機能を提供します。これは、フェノール精製やビオチン除去などの不要なステップを排除することによって大きく達成されます。古典的な核内ライゲーションHi-Cプロトコル57 およびそれに続く派生技術PCHi-Cでは、ビオチンは、後で情報が得られないDNA断片を引き下げることを避けるために、非ライゲーション制限断片から除去されます。この部分とそれに続くDNA精製をスキップしても、有効なリードの割合が大幅に減少することはありません(図3A)が、DNA精製である潜在的なDNA浪費ステップが切り取られます。超音波処理後のHi-Cライブラリ調製物の再編成は、精製ステップ自体として両面選択を使用することにより、さらに別の不要な精製をスキップすることを可能にする。これらすべてが、最小限のチューブ交換を採用することでプロトコル全体の性能を向上させ、反応量の減少、試薬濃度の変化、およびDNA低結合プラスチック器具...

時間的な遺伝子発現は細胞の分化を促進し、最終的には生物の発生を促進し、その変化は幅広い疾患と密接に関連しています1,2,3,4,5。遺伝子転写は、近位(すなわち、遺伝子プロモーター)および遠位(例えば、エンハンサーまたはサイレンサー)に分類され得る調節要素の作用によって細かく制御され、後者はしばしば標的遺伝子から遠くに位置し、クロマチンループを介してそれらと物理的に相互作用して遺伝子発現を調節する6,7,8。
ゲノム中の遠位調節領域の同定は、これらの領域が特異的なヒストン修飾9,10,11を有し、特異的な転写因子認識モチーフを含み、それらの募集プラットフォームとして機能するため、広く合意されている問題である12,13,14。その上、エンハンサーおよびスーパーエンハンサー15,16の場合、それらはまた低ヌクレオソーム占有率17,18を有し、ノンコーディングeRNA19,20に転写される。
それにもかかわらず、各遠位調節要素の標的遺伝子を予測することはより困難です。多くの場合、遠位調節要素とその標的との間の相互作用は、細胞型および刺激特異的であり21,22、数百キロベースに及び、任意の方向に他の遺伝子を橋渡しし23,24,25、標的遺伝子または他の非介在遺伝子のイントロン領域内に位置し得る26,27.さらに、遠位調節要素は同時に複数の遺伝子を制御することもでき、逆もまた同様である28,29。この位置の複雑さは、それらの間の調節関連を特定することを妨げ、したがって、すべての細胞型における各調節要素の標的のほとんどは未知のままです。
近年、クロマチン相互作用を研究するための染色体立体構造捕捉(3C)技術の開発に大きなブームがありました。それらの中で最も広く使用されているHi-Cは、細胞のゲノム30のすべての断片間のすべての相互作用のマップを生成することを可能にする。しかし、制限断片レベルで有意な相互作用を検出するために、Hi-Cは超深部シーケンシングに依存しており、個々の遺伝子の調節状況を日常的に研究するためにそれを使用することを禁止しています。この経済的限界を克服するために、ChIA-PET 31、HiChIP32、およびその低入力対応物HiCuT33など、いくつかの濃縮ベースの3C技術が登場しました。これらの技術は、特定のタンパク質によって媒介されるゲノム全体の相互作用を濃縮するための抗体の使用に依存しています。それにもかかわらず、これらの3C技術のユニークな特徴は、それらのアプリケーションの悩みの種でもあります。ユーザーは、目的のタンパク質に対する高品質の抗体の入手可能性を頼りにしており、タンパク質の結合が動的である条件を比較することはできません。
プロモーター捕捉Hi−C(PCHi−C)は、これらの制限を回避する別の濃縮ベースの3C技術である34、35。PCHi-Cは、ビオチン化RNAプローブ濃縮システムを採用することにより、28,650個のヒトまたは27,595個のマウスアノテーション付き遺伝子プロモーター(プロモーターインタラクトームとも呼ばれる)と相互作用するゲノム領域のゲノムワイドな高解像度ライブラリを生成することができます。このアプローチにより、活性プロモーターと非活性プロモーターの両方の制限フラグメントレベルの分解能で有意な長距離相互作用を検出し、ヒストン修飾やタンパク質結合のダイナミクスとは無関係に、任意の条件間でプロモーター相互作用を堅牢に比較することができます。PCHi-Cは、細胞分化中のプロモーターの相互作用体再編成を同定するために近年広く使用されており36,37、転写因子の作用機序を同定し38,39、非コード変異体40,41,42,43,44,45によって疾患において調節解除される新しい潜在的な遺伝子および経路を発見する。46、47、48、新しいドライバ非コード変異49、50と並んで。さらに、捕捉システムを変更するだけで、この手法を生物学的問題に従ってカスタマイズして、任意のインタラクトーム(例えば、エンハンサーインタラクトーム51または非コード改変のコレクションのインタラクトーム41、52)を尋問することができる。
しかし、PCHi-Cは最低2,000万個の細胞に依存してこの技術を実行するため、発生生物学や臨床応用でよく使用されるような希少な細胞集団の研究が妨げられています。このため、PCHi-Cの実験フレームワークに基づいて、低細胞入力で高分解能プロモーター相互作用を形成するための費用効果が高くカスタマイズ可能な新しい方法である低入力キャプチャHi-C(liCHi-C)を開発しました。最小限のチューブ交換、元のPCHi-Cプロトコルからのステップの交換または排除、反応量の大幅な削減、試薬濃度の変更で実験を行うことで、ライブラリの複雑さが最大化され、わずか50,000細胞で高品質のライブラリを生成することができます53。
低入力キャプチャHi-C(liCHi-C)は、PCHi-Cに対してベンチマークされており、ヒト造血細胞分化中のプロモーター相互作用体再配線の解明、非コード変化によって制御解除される可能性のある新しい疾患関連遺伝子および経路の発見、および染色体異常の検出に使用されています53。ステップバイステップのプロトコルと技術によるさまざまな品質管理は、ライブラリの最終生成とその計算分析までここで詳しく説明します。

<table><tbody><tr><td>0.4 mM Biotin-14-dATP</td><td>Invitrogen</td><td>19524-016</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>AM9855G</td><td></td></tr><tr><td>10x NEBuffer 2</td><td>New England Biolabs</td><td>B7002S</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3994</td><td></td></tr> <tr><td>で制限バッファー 2 として参照10x T4 DNA リガーゼ反応バッファー</td><td>New England Biolabs</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>16% ホルムアルデヒド溶液 (w/v)、メタノールフリー</td><td>Thermo Scientific</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>20 mg/mL ウシ血清アルブミン</td><td>New England Biolabs</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>5 M NaCl</td><td>Invitrogen</td><td>AM9760G</td><td></td></tr><tr><td>5PRIME Phase Lock Gel Light tubes</td><td>Qiuantabio</td><td>2302820</td><td>セクション4(DNA精製)のフェノール-クロロホルム精製用。Phase Lock Gelチューブは、有機相と水相の間に沈殿して分離する中間密度の樹脂を含有することにより、有機相の汚染物質のキャリーオーバーを回避しながら、フェノールクロロホルム精製後のDNA回収を最大化するように設計された市販タイプのチューブです。PLGチューブは、樹脂がチューブの底にしっかりと配置されていることを確認するために、使用前に12,000 x gで30秒間回転させる必要があります</td></tr><tr><td>ライブラリ増幅用のアダプターとPCRプライマー</td><td>統合DNA技術</td><td>-</td>NGS細胞スクレーパー<td>のPAGE精製を備えた個々のプライマーとして購入</td></tr><tr><td></td><td>Nunc</td><td>179693</td><td>または他のブランド</td></tr><tr><td>遠心分離機(1.5mLチューブ用固定角度ローター)</td><td>任意のブランド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CHiCAGO Rパッケージ</td><td>1.14.0</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CleanNGSビーズ</td><td>CleanNA</td><td>CNGS-0050</td><td></td></tr><tr><td>dATP, dCTP, dGTP, dTTP</td><td>Promega</td><td>U120A, U121A, U122A, U123A</td><td>またはその他任意のブランドの</td></tr><tr><td>DNA LoBindチューブ、1.5mL</td><td>Eppendorf</td><td>30108051</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBindチューブ、2mL</td><td>Eppendorf</td><td>30108078</td><td></td></tr><tr><td>DNAポリメラーゼI大(Klenow)フラグメント 5000 units/mL</td><td>New England Biolabs</td><td>M0210L</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1 beads</td><td>Invitrogen</td><td>65002</td><td>For biotin pull-down of the pre-captured library in section 8 (ビオチンプルダウン)</td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin T1 beads</td><td>Invitrogen</td><td>65602</td><td>セクション11の捕捉後のライブラリのビオチンプルダウン用(ビオチンプルダウンおよびPCR増幅)</td></tr><tr><td>DynaMag-2</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td>または1.5 mlチューブL</td></tr>エ<tr><td>タノールアブソリュート</td><td>VWR</td><td>20821.321</td><td></td></tr><tr><td>FBS、認定</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>またはその他のブランドの</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher BioReagents</td><td>に適した他の磁石BP381-1</td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue Coprecipitant</td><td>Invitrogen</td><td>AM9515</td><td>セクション 4 (DNA 精製) の DNA 共沈に使用 (DNA 精製)</td></tr><tr><td>HiCUP</td><td>0.8.2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HindIII, 100 U/&micro;L</td><td>New England Biolabs</td><td>R0104T</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8896-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Klenow EXO- 5000 units/mL</td><td>New England Biolabs</td><td>M0212L</td><td></td></tr><tr><td>ローリテンションフィルターチップ&nbsp;(10 &micro;L、20 &micro;L、200 &micro;Lおよび1000 & マイクロ;L)</td><td>ZeroTip</td><td>PMT233010、PMT252020、PMT231200、PMT252000</td><td></td></tr><tr><td>M220集束超音波処理装置</td><td>Covaris</td><td>500295</td><td></td></tr><tr><td>Micro TUBE AFA ファイバー スリット入りスナップキャップ 6 x 16 mm バイアル</td><td>Covaris</td><td>520045</td><td>セクション 6 (超音波処理)</td></tr><tr><td>NheI-HF、100 U/&micro;L</td><td>New England Biolabs</td><td>R3131M</td><td></td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー分子生物学グレードの水</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>品質管理用PCRプライマー</td><td>Integrated DNA</td> <td>Technologies-PCR</td><td></td></tr> <tr><td>strips&nbsp;キャップ</td><td>Agilent Technologies</td><td>410022、401425</td><td></td></tr><tr><td>フェノール: クロロホルム: イソアミルアルコール 25:24:1、10 mM トリス、pH 8.0、1 mM EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3803</td><td></td></tr><tr><td>Phusion&nbsp;HFバッファーを使用したハイフィデリティPCRマスターミックス</td><td>New England Biolabs</td><td>M0531L</td><td>セクション9のライブラリーの増幅に(dATPテーリング、アダプターライゲーション、PCR増幅) および11(ビオチンプルダウンおよびPCR増幅)</td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤カクテル(EDTAフリー)</td><td>ロシュ</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>プロテイナーゼK、組換え、 PCR グレード</td><td>Roche</td><td>3115836001</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 1x dsDNA 高感度キット</td><td>Invitrogen</td><td>Q33230</td><td>セクション 4 (DNA 精製) での沈殿後の DNA 定量化用(DNA 精製)</td></tr><tr><td>Qubit アッセイチューブ</td><td>Invitrogen</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>rCutsmart buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>B6004S</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640 1x + GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td>または他のブランドの</td></tr><tr><td>SDS -分子生物学のための解決10%</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A0676</td><td></td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム pH 5.2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7899-100ML</td><td></td></tr><tr><td>SureSelectの注文の注文の注文の3-5.9 Mbの図書館</td><td>Agilent Technologies</td><td>5190-4831</td><td>捕獲</td></tr><tr><td>SureSelectのターゲットの濃縮箱1</td><td>のために使用されるAgilent Technologies</td><td>5190-8645</td><td>キャプチャ</td></tr><tr><td>SureSelectターゲットエンリッチメントキットに使用 ILM PEフルアダプター</td><td>Agilent Technologies</td><td>931107</td><td>キャプチャ></</td></tr><tr><td>strongT4 DNAリガーゼ1 U/&microに使用;L</td><td>Invitrogen</td><td>15224025</td><td>セクション 3 のライゲーション用 (ライゲーションおよびデクロスリンク)</td></tr><tr><td>T4 DNA リガーゼ 2000000/mL</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202T</td><td>セクション 9</ストロング> (dATP-テーリング、アダプター ライゲーション、PCR 増幅)</td></tr> <tr><td>T4 DNA ポリメラーゼ 3000 ユニット/mL</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>M0203L</td><td></td></tr><tr><td>T4 PNK 10000 ユニット/mL</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>Tapestation 4200 instrument</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>セクション 9</ストロング> (dATPテーリング、アダプターライゲーション、PCR 増幅) <ストロング>および セクション 11</ストロング> (ビオチンプルダウンおよび PCR 増幅) での自動電気泳動用。その他の自動電気泳動システムは、</td></tr><tr>有効な<td>Tapestation試薬</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5582、5067-5583、5067-5584、5067-5585、</td><td>セクション9(dATPテーリング、アダプターライゲーション、およびPCR増幅)および セクション11(ビオチンプルダウンおよびPCR増幅)の自動電気泳動用です。他の任意の自動電気泳動システムは、</td></tr><tr><td>分子生物学のための有効なTriton X-100</td>です <td>PanReac AppliChem</td><td>A4975</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416-50ML</td><td></td></tr></tbody></table>

希少細胞集団におけるプロモーター中心の時空間ゲノム構造を研究するための統合ワークフロー

An Integrated Workflow to Study the Promoter-Centric Spatio-Temporal Genome Architecture in Scarce Cell Populations

時空間的な遺伝子転写は、転写を制御するために標的遺伝子プロモーターとの物理的な近接に依存するエンハンサーやサイレンサーなどの遠位調節要素によって厳密に制御されています。これらの調節要素は同定が容易ですが、それらのほとんどは細胞型特異的であり、線形ゲノム配列において数百キロ塩基離れている可能性があり、他の非標的遺伝子をスキップするため、それらの標的遺伝子を予測することは困難です。数年前から、プロモーターキャプチャーHi-C(PCHi-C)は、遠位調節エレメントを標的遺伝子に関連付けるためのゴールドスタンダードでした。しかし、PCHi-Cは数百万の細胞の入手可能性に依存しており、初代組織から一般的に得られるような希少細胞集団の研究を禁止しています。この制限を克服するために、ゲノムの各遺伝子を制御する遠位調節要素のレパートリーを同定するための費用効果が高くカスタマイズ可能な方法である低入力Capture Hi-C(liCHi-C)が開発されました。liCHi-Cは、PCHi-Cと同様の実験および計算フレームワークに依存していますが、チューブの変更を最小限に抑え、試薬の濃度と量を変更し、ステップを交換または排除することにより、ライブラリ構築中の材料損失を最小限に抑えます。liCHi-Cは、発生生物学と細胞機能の文脈における遺伝子制御と時空間ゲノム構成の研究を可能にします。

liCHi-Cは、わずか50,000細胞で高品質で分解能の高いゲノムワイドプロモーターインタラクトームライブラリを生成する可能性を提供します53。これは、反応量の大幅な削減とプロトコル全体でのDNA低結合プラスチックウェアの使用に加えて、重大な材料損失が発生する元のプロトコルから不要なステップを削除することによって達成されます。これらには、脱架橋後のフェノール精製、ビオチン除去、およびその後のフェノール-クロロホルム精製およびエタノール沈殿が含まれます。それに加えて、Hi-Cライブラリ調製のステップ(ビオチンプルダウン、Aテーリング、アダプターライゲーション、PCR増幅、および両面常磁性ビーズの選択-PCR産物精製としても)を再編成することで、さらに別の不要なDNA精製ステップを取り除くことができます。実験ワークフローの概要を 図1Aに示します。
ライブラリの品質を評価するために、プロトコル全体でいくつかのコントロールが実行され、その最初のコントロールはゲノム消化効率の計算で...

遺伝子発現は、遺伝子プロモーターと遠位調節要素との相互作用によって調節される。ここでは、低入力のCapture Hi-C(liCHi-C)により、以前は測定できなかった希少細胞型におけるこれらの相互作用の同定がどのように可能になるかを説明します。

Spatiotemporal gene transcription is tightly regulated by distal regulatory elements, such as enhancers and silencers, which rely on physical proximity ...

liCHi-Cでは、私たちが答えようとしている主な問題は、クロマチンが核内でどのように相互作用するか、したがって遺伝子調節の新しい層を理解することです。liCHi-Cを使用して、特定のサンプルのゲノム構成を探索し、疾患に関連する非コード変異を影響を受ける可能性のある遺伝子と関連付け、たとえば腫瘍サンプルの転座などの染色体再構成を検出できることが証明されました。これで、初代幹細胞や関連する臨床サンプルなどの瘢痕細胞タイプの3Dクロマチン組織を調べることができます。私たちのプロトコルは、制限フラグメントの解像度でゲノム構成を探索するための高品質のデータを取得するために必要な入力材料と時間とコストを削減します。liCHi-Cは、3Dクロマチン組織化分野の範囲を拡大し、これまで分析できなかった新しい細胞タイプを探索することを可能にしています。liCHi-Cのおかげで、科学界は遺伝子発現の特別な調節を探求することができます。例えば、腫瘍内の特定のクローン亜集団においてのみ悪性形質転換において。

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Genetics

遺伝学

DNA 規制要素、エンハンサーなどは、物理的にゲノム長距離にまたがる長距離染色体相互作用を介して多くの場合、ターゲット遺伝子のプロモーターに連絡して遺伝子発現を制御します。プロモーターが PCHi ハをやあ-C...

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定量染色体立体構造捕捉による胚体におけるエンハンサー・プロモーター接触の同定(4C)

ここで著者らは、網膜におけるトランスクリプトームおよびクロマチンアクセシビリティプロファイルを特徴付ける際の表現型決定およびその後のscRNA-seqおよびscATAC-seqのペアに対するMULTI-seqの有用性を示す。...

scRNA-SeqおよびscATAC-Seqを用いた網膜遺伝子発現およびクロマチンアクセシビリティの多重化解析

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遺伝子および組織特異的エンハンサーを選択するためのWebベースのワークフロー

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