Name: アルコール使用障害をモデル化するための 2 本ボトルの選択と組み合わせた慢性間欠性エタノール蒸気曝露 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-23T13:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 12 s
Description: 学ぶマウスのアルコール依存モデル構築法。2本ボトル選択と慢性間欠性エタノール蒸気曝露を組み合わせ、飲酒行動と血液エタノール濃度を自動測定し、アルコール使用障害の神経生物学的変化を解明する。

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この作業は、国立衛生研究所(NIH)の助成金AA027301およびAA029985によって支援されました。

すべての手続きは、パデュー大学の動物管理および使用委員会によって承認されました。本研究では、8週齢のC57BL/6Jマウスを使用しました。CIEグループには5匹のマウス(オス3匹、メス2匹)、Airグループには10匹のマウス(オス5匹、メス5匹)がいました。動物は商業的な供給源から入手し(資料表を参照)、食物へのアクセスを備えた12時間の明暗サイクルでグループ飼育されました。マウスの体重は、実験全体を通じて週に1回測定されました。
1. 一般的な実験計画
注:2本選択(2BC)/慢性間欠的エタノール蒸気曝露(CIE)は、エタノール依存性を調査するための前臨床マウスモデルです51。
<ol>
	<li>2BC週間の間に、マウスがエタノール(15%w / v)を含むボトルと水を含むボトルを毎日2時間(月曜日から金曜日)アクセスできることを確認します。</li>
	<li>最初に、エタノール摂取量の安定したレベルに達するまで、マウスに最低2週間のベースライン2BC飲酒を許可します。実験の必要性に応じて、マウスを2つのグループ(CIEグループとエアグループ)に分けるか、平均ベースラインエタノール摂取量に基づいて追加の治療が含まれる場合はそれ以上に分けます。.</li>
	<li>ベースラインの2BC週間後、CIEグループのマウスをエタノール蒸気(CIE)に4日間連続(月曜日から木曜日)さらし、16時間の蒸気オンと8時間の蒸気オフを連続して行います。曝露期間を通じて安定した持続的な血中エタノール濃度を確保するために、ピラゾールをアルコールデヒドロゲナーゼ阻害剤として同時投与し、それによって急速なエタノール代謝を防ぎ、一貫した全身エタノールレベルを促進しました 
	注:照明、振動、騒音、温度などの潜在的なチャンバー固有の変数を制御するために、Airグループのマウスは、CIEグループと同じ環境条件下で同じチャンバーに収容されましたが、アルコール蒸気への曝露はありませんでした。</li>
	<li>CIE/Air の週には、2BC が発生しないようにしてください。CIE / Airの1週間後、次の月曜日から金曜日まで2BCでマウスを再開します。</li>
	<li>マウスにCIE / Airと2BCを交互に数週間投与し、CIEマウスでアルコール飲酒のエスカレーションが発生するまで、手順の残りの部分を許可します。.マウスの血中エタノール濃度(BEC)52を測定するために、CIEを少なくとも週に1回マウスから採取します。</li>
</ol>
2. 実験の準備
<ol>
	<li>研究を開始する前に、マウス、ケージ/金属製のケージトップ、ケージごとに2つ並べて収まる飲料ボトル、寝具、餌、体重計、慢性間欠蒸気チャンバー、アナロックスマシン、またはBECを分析する別の方法(材料の表を参照)をすべて入手してください。</li>
	<li>飲料水、95%エタノール、ピラゾール、ヘパリン、滅菌生理食塩水など、実験に必要なすべての化学物質が揃っていることを確認してください。</li>
</ol>
3. 動物の慣れ
<ol>
	<li>マウスが実験と同じ場所にまだ飼育されていない場合は、マウスが新しい環境に順応するまで少なくとも1週間かかります。 
	注:この期間中、マウスはストレス関連の交絡を最小限に抑え、動物福祉を向上させるために、穏やかな取り扱いにも慣れさせる必要があります。ハンドリングセッションは、1日1回、5日間連続して行われ、各セッションは1匹あたり約2〜3分間続きました。マウスは、尾を持ち上げずに実験者の手にカップ状にされるか、そっと誘導され、ハンドラーの手を自発的に探索することができました。この手法は、日常的な相互作用を促進し、その後の実験手順中のストレスを軽減し、より信頼性の高い行動データを保証します。さらに、動物を実験環境にさらに順応させるために、毎日30分間実験エリアに移されました。</li>
	<li>マウスに1週間の2本のボトルの選択肢を与え、両方のボトルに水を入れて、異なるケージのセットアップに順応し、個々のケージに入れて飲むことができるようにします。</li>
</ol>
4. 15% w/v エタノールと水の 2 本ボトルの選択
<ol>
	<li>2本選択の慣れ
	<ol>
		<li>2本入りボトル選択型テストのパラダイムは、水を使った2本入りボトル選択と、その後の水とエタノールによるテストの週を通して同じです。グループで飼育されているマウスを、照明が消灯する30分前に個々の飲用ケージに移動し、その後、マウスが2時間飲むのを待ちます。</li>
		<li>2時間の飲用期間の前後に各飲用ボトルの容量を記録します。各グループは、月曜日から金曜日までの5日間、2BCを受けます 
		注:慣れ週間の目的は、動物がケージ内にある2本のボトルに順応して、1本のボトルの自然な側面位置によって引き起こされるバイアスを最小限に抑えることです。この週の間、両方のボトルに水が入っています。付属の金属ホッパーが1本のボトルのみを保持するように設計されている場合は、最初のボトルに隣接するバー間のスペースを慎重に使用して、2番目のボトル用のスペースを確保してください。飲酒実験に使用するボトルは、10mLと25mLのピペットを使用してカスタムメイドし、端をカットして、マウスが飲むためのボールベアリング付きのストレートシッパーを挿入できるようにしています。バインダークリップを使用してボトルをワイヤーの蓋にクリップすると、飲用期間中にボトルが動かないようにします(補足図1および補足図2)。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ベースラインの2本の選択
	<ol>
		<li>慣れた後、マウスに少なくとも2週間のベースライン2BC飲酒をさせて、安定したエタノール摂取を確立します。.ベースラインの飲酒中に、マウスを1日2時間および週5日(月曜日から金曜日)テストし、1本のウォーターボトルと15%w / vエタノールを含む2本目のボトルでテストします。2時間の飲用期間の前後に各飲用ボトルの容量を記録します. 
		注:エタノール摂取量の安定したベースラインを確立するには、各マウスが日間の摂取量の変動が約15%未満になるまで、2BCの週を繰り返します。</li>
		<li>マウスがエタノール摂取量の安定したベースラインを達成した後、マウスのエタノール摂取量に基づいて、マウスをエタノール非依存性(空気処理)群とエタノール依存性(CIE処理)グループに均等に分けます。ベースラインのエタノール摂取量が確立されると、マウスは翌週にCIE(または空気曝露)を受けます><。
		注:すべての実験で非従属グループを含める必要があるわけではなく、これは研究の焦点に基づいて決定する必要があります。例えば、特定の処理を受けた場合としない場合のエタノール依存マウスは、より関連性のある比較となり得る。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>2本から選べる(2BC)
	<ol>
		<li>最初のCIE週後のベースライン飲酒中に実行された2BC手順を再開します。 
		注:2本入りマウスの飲用フォーミュラは、15%w / vエタノール混合物(1 L):95%エタノール(195 mL)とマウス飲料水(805 mL)です。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 慢性的な間欠性エタノール蒸気(CIE)曝露
<ol>
	<li>次の材料を配置します:カスタムメイドのCIEベイパーチャンバー(補足図3)、95%エタノール、エタノール-ピラゾール溶液(68.1 mg / kgピラゾールを20%エタノールに混合)、生理食塩水-ピラゾール溶液(生理食塩水に混合した68.1 mg / kgピラゾール)、注射器(1 mL)、および針。</li>
	<li>慢性間欠性エタノール蒸気(CIE)手順
	<ol>
		<li>CIEのベイパーチャンバーに入れる前に、マウスにエタノールピラゾール溶液(0.0075mL / g)を腹腔内注射します。これは、初期のエタノール中毒を引き起こし、エタノールデヒドロゲナーゼを阻害し、エタノール53の代謝を阻害するために使用されます。.</li>
		<li>すべてのエアコントロールと他のグループに、エタノールの代わりに生理食塩水(0.0075 mL / g)と混合した同じピラゾール用量を注入します。.毎週CIEの初日と最終日にピラゾール溶液の半分の用量(0.00375 mL / g)を投与することをお勧めします。.</li>
		<li>注射後、Air/Controlマウスを自宅のケージに戻し、CIEグループのケージをベイパーチャンバー内に置きます 
		注:慢性的なエタノール蒸気曝露に関連する潜在的な健康リスクを考慮して、動物はプロトコル全体を通じて綿密に監視され、健康状態を確保し、悪影響を検出しました。.マウスの体重は少なくとも週に2回行われ、健康評価には苦痛の臨床的徴候の観察が含まれていました。ベースラインから20%を超える体重減少を示した動物、または猫背姿勢、無気力、立毛、毛皮の乱れなどの兆候を示す動物は、人道的なエンドポイントに到達したと見なされ、承認された施設の動物の世話と使用のガイドラインに従って研究から速やかに除外されました。CIE期間中、マウスは、エタノール曝露の中止後に長期の離脱期間に入る週の終わりに向けて、健康状態が悪化する可能性が最も高くなります。離脱の重症度を最小限に抑えるために、毎週蒸気曝露の最終日にピラゾールの半分の用量が投与されます。.さらに、動物をエタノール曝露に戻すのを容易にするために、新しいCIEサイクルの各開始時に半分の用量が与えられます。アルコールデヒドロゲナーゼ阻害剤であるピラゾールは、血中エタノール濃度を安定させ、延長するために使用されます。用量は通常、0.00375 mL / gから0.0075 mL / gの範囲で、目的の血中エタノール濃度を達成するために調整できます。.</li>
		<li>マウスをベイパーチャンバーに入れたら、ドアをロックし、ポンプを適切な蒸気レベル(1〜3など)に設定します。実験の実行時間を設定します。本研究では、実験を17:00 PMに開始し、09:00 AMに終了し、ポンプ設定1-2を使用しました(全体で使用)。</li>
		<li>次に、CIEベイパーチャンバー制御画面のスタートボタンを押して実験を開始します 
		注意: この手順は、使用するチャンバーとセットアップの違いによって異なる場合があります。ここでは、すべてのマウスが注入され、エタノールチャンバーに入れられたら、チャンバーは95%エタノールをガラスフラスコにポンプで送り始め、液体エタノールを蒸気に加熱する必要があります。蒸気は、マウスが4日間(月曜日の夕方から金曜日の朝まで)16時間/日保持されるチャンバーを通って流れます。毎日、マウスは蒸気がオフになっている8時間を経験します。その後、マウスは4日目の終わり(金曜日の朝)にチャンバーから取り出され、次の月曜日に紀元前2年を開始します。特定のベイパーチャンバーシステムとセットアップによっては、設定/蒸気レベルの違いによりBECに変動が生じる場合があります。これは、システムコンポーネント、空気の流れ、排気のわずかな違いなど、さまざまな要因によって引き起こされる可能性があります。ピラゾールの投与量ではなくエタノール蒸気レベルを調整することは、BECを目標範囲内に維持するのに適しています。許容範囲が大きくなると、BECが低すぎる可能性があり、蒸気レベルの調整が必要になる場合があります。蒸気レベル間の勾配が急すぎてBECを増やすことができない場合は、それに応じてピラゾール用量を調整してBECを変更することをお勧めします。.</li>
		<li>CIE中に少なくとも週に1回、マウスのBECを測定し(ステップ5.3を参照)、蒸気が停止する30分前に採血を行い、BECが低下し始めていないことを確認します。 
		注:エタノール耐性が数週間にわたって上昇するため、実験中に蒸気レベルを調整する必要がある場合があります。BECは、蒸気設定を調整する前と後にテストする必要があります。</li>
		<li>CIEの翌週にマウスを2BC試験に戻し、ステップ4とステップ5を繰り返します。マウスをCIEと2BCの間で交互に4〜8サイクル(8〜16週間)維持し、ベースラインの飲用量と比較してエタノール消費量が大幅に増加するまで続けます。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>血液測定
	<ol>
		<li>次の材料を手配します:アナロックスシステム、ブレード、チューブ(0.2 mL)、ヘパリン/EDTA、遠心分離機などのBECを測定する機器(材料の表を参照)。</li>
		<li>CIEの週に1回、蒸気システムがオフになる30分前にCIEマウスをテールスニップして、BECを決定するための血液を採取します。採血は、ラボの好みに応じていくつかの方法を使用して実行できます54. 
		注:血液はヘパリン処理またはEDTAコーティングされた0.5mLチューブに収集されます(材料の表を参照)。</li>
		<li>収集した血液サンプルは、処理されるまで4°Cに維持します。</li>
		<li>サンプルを処理するには、まず 208 x g で 4 °C で 10 分間遠心分離し、血漿を分離します。</li>
		<li>酸素率エタノール分析装置(材料の表を参照)またはBECを測定できる他のシステムを使用して、血中エタノール濃度を測定します。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Modeling Alcohol Use Disorder Using Chronic Intermittent Ethanol Vapor Exposure

モーリー・コールは、ラホーヤ・アルコール・リサーチ社のオーナー兼運営者です。

アルコール使用障害は、有病率が高く、社会にコストがかかる世界的な公衆衛生上の問題です56。前臨床動物モデルで AUD を研究するには、マウスでの一般的な方法は 2BC/CIE 20,34,43,44,51,57,58,59 です。ここでは、この確立されたアルコール依存モデルを使用して、標準的な 2BC/CIE 研究の代表的な方法と結果を提示しました。予想通り、この研究では、マウスは、Airコントロールおよび自身の以前のベースラインアルコール摂取量と比較して、数週...

慢性的な過度のアルコール摂取を伴うアルコール使用障害(AUD)は、最も一般的な精神疾患の1つであり、世界的な問題です。AUDの症状は、酩酊、離脱、渇望の繰り返しのサイクルを伴い、社会的、職業的、健康上の影響に関係なくアルコールを絶えず消費することを特徴としています1,2,3,4,5,6,7.アルコール使用障害は、ADHD><<sup class="xref">9、不安10、<うつ病sup class="xref">11など、他の蔓延性、持続性、障害性精神障害と関連して発生することが多く、米国だけで年間約88,000人の死亡の原因となっています2。過度のまたは頻繁なアルコール摂取は、人の仕事の状況や社会的関係に影響を与える可能性があります12、暴力の増加につながる可能性があります13。身体的には、アルコールからの急性離脱は、不安、興奮、震え、過度の発汗、意識の変化、幻覚を引き起こす可能性があります14,15。さらに、飲酒を減らしたりやめたりすると、禁断症状を感じたり、イライラしたり不機嫌になったりすることがあります16。さらに、慢性的なアルコール摂取は記憶喪失を引き起こす可能性があります17、チアミン欠乏症、ウェルニッケ・コルサコフ症候群(WKS)とも呼ばれ、アルコール誘発性認知症18に大きく寄与する可能性があります。
AUD研究をさらに進めるためには、この疾患の翻訳関連動物モデルが必要です。げっ歯類におけるAUDの最も一般的なモデルは、アルコール蒸気の繰り返し吸入を通じてアルコール依存を誘発するための確立されたアプローチである慢性間欠性エタノール蒸気曝露(CIE)です4,19,20,21,22,23,24、25,26,27,28,29,30.げっ歯類のCIE手順は、取り扱い誘発性痙攣31、過興奮性、過敏性のような行動、不安のような行動、睡眠障害などの離脱症状を誘発し、アルコール飲酒のエスカレーションを引き起こします22,32,33,34,35.さらに、CIEは、ヒトのAUD36で観察された強迫的な摂取を反映して、自発的なアルコール消費の大幅な増加につながります。中毒期には、マウスは、運動失調、鎮静、低体温障害など、ヒトのアルコール中毒と一致する行動的および生理学的徴候を示します37,38,39.これらの結果は、アルコール依存症の神経生物学的側面と行動的側面の両方を捉えるCIEモデルの有用性を強調しており、AUDメカニズムを解明し、潜在的な治療介入をテストするための貴重なツールとなっています。慢性間欠エタノール(CIE)蒸気曝露などのAUDの前臨床モデルでは、マウスはヒトのアルコール中毒と依存に並行する行動的および生理学的徴候を示します。中毒期には、マウスは運動失調、鎮静、探索行動の低下、矯正反射の障害などの徴候を示すことがあります。これらのリスクを考慮して、動物はエタノール蒸気曝露中および曝露後に綿密に監視され、重度の中毒または健康悪化の兆候を特定しました。
ラットでは、CIEモデルはしばしばアルコールのオペラント自己投与を含み、摂取量のエスカレーションを測定します40,41,<sup class="xref">42、マウスモデルにはCIEと2本選択(2BC)の飲酒が含まれます43,44.アルコール依存症の前臨床モデルでは、動物は慢性的なエタノール蒸気曝露後にエタノール摂取量を増加させることが一貫して示されています23,45,46,47。特にマウスでは、CIEのサイクルを繰り返すと、自発的なエタノール摂取量が増加することが示されています3,21,48,49,50。全体として、先行研究は、CIEモデルがげっ歯類のエタノール消費量を増加させ、AUDをモデル化するのに十分であることを示しています。
この研究は、AUDを研究するためのCIE法、より具体的には2BC/CIEマウスモデルに焦点を当てることを目的としています。2BC/CIEを実行するために必要な手順の詳細なプロセスを経て、CIE後のアルコール飲酒のエスカレーションの例を紹介します。

<table><tbody><tr><td>500 エッペンドルフ チューブ</td><td>エッペンドルフ</td><td>L203896J</td><td></td></tr><tr><td>95% エタノール</td><td>デコン研究所</td><td>2816</td><td></td></tr><tr><td>アナロックス</td><td>マシン アナロックス 機器</td><td>アナロックス-AM1</td><td></td></tr><tr><td>動物体重計</td><td>ケント サイエンティフィック</td><td>SCL-4000</td><td></td></tr><tr><td>バインダー クリップ</td><td>オフィス デポ</td><td>560394</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J マウス</td><td>ジャクソン研究所</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>エッペンドルフ</td><td>5418R</td><td></td></tr><tr><td>慢性間欠蒸気室</td><td>ラホーヤアルコールリサーチ株式会社</td><td></td><td>カスタムメイド材料</td></tr><tr><td>ヘパリン/EDTA</td><td>Sagent Pharmaceuticals</td><td>TS/DRUGS/2/2015</td><td></td></tr><tr><td>マウス寝具</td><td>Bed-o'穂軸8B</td><td></td><td>は1/8 "の深さ</td></tr><tr><td>で満たされますマウスの飲酒ボトル</td><td></td><td></td><td>カスタムメイドの材料</td></tr><tr><td>Pyrazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>bccc6397</td><td></td></tr><tr><td>Tekladグローバル18%タンパク質(マウスフード)</td><td>Tekladグローバル</td><td>Envigo 2018</td><td></td></tr></tbody></table>

アルコール使用障害をモデル化するための 2 本ボトルの選択と組み合わせた慢性間欠性エタノール蒸気曝露

Chronic Intermittent Ethanol Vapor Exposure Paired with Two-Bottle Choice to Model Alcohol Use Disorder

アルコール使用障害(AUD)は、通常、制御不能な飲酒とアルコールへの没頭として現れる慢性的なアルコール関連障害です。AUD研究の重要な要素は、トランスレーショナルに関連する前臨床モデルを使用することです。過去数十年にわたり、AUDの研究にはさまざまな動物モデルが使用されてきました。AUDの顕著なモデルの1つは、慢性間欠性エタノール蒸気曝露(CIE)モデルであり、これは吸入によるエタノール曝露の繰り返しサイクルを通じてげっ歯類のアルコール依存を誘発するための確立されたアプローチです。マウスでAUDをモデル化するために、CIE曝露は、アルコール飲用と水の自発的な2本選択(2BC)とペアにして、アルコール飲酒のエスカレーションを測定します。2BC/CIEの手順では、2BCの飲酒とCIEを交互に数週間行い、アルコール飲酒のエスカレーションが達成されるまで繰り返されます。本研究では、CIEベイパーチャンバーの日常的な使用を含む2BC/CIEの実施手順を概説し、このアプローチを用いたC57BL/6Jマウスにおけるアルコール飲酒のエスカレーション例を示す。

今回の代表的な研究では、2BC（2ボトル選択）中のエタノール摂取量（g/kg）を、ベースライン飲酒時および数週間のCIE（慢性間欠的エタノール曝露）後（蒸気曝露後）に報告しています。簡潔に述べると、プロトコルに記載されている通り、2BCの間、マウスは水が入ったボトルと15% (w/v) エタノールが入ったボトルの2本にアクセスすることができました。ベースラインの摂取量が決定した後、被験体はCIE群またはAir群に均等に割り付けられました。CIE前の3週間にわたる初期ベースラインのエタノール摂取量は、2.00 g/kg ± 0.21 g/kg (n = 15) で安定しました（図1A,B）。
全飲酒期間を検討したところ、二元配置反復測定ANOVAにより、エタノール摂取量に対してCIE処置の有意な効果（F(13,78) =7.471, p &lt; 0.0001）および週の有意な効果（F(6,78) = 14.07, p</...

ここに提示されているのは、アルコール使用障害を研究するためのマウスのアルコール依存症の2BC/CIEモデルのプロトコルです。

Alcohol use disorder (AUD) is a chronic alcohol-related disorder that typically presents as uncontrolled drinking and preoccupation with alcohol. A key ...

chronic-intermittent-ethanol-vapor-exposure-paired-with-two-bottle

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