Name: 新しい冷却セルプロセッサシステムが膵島セル隔離施設に与える影響の評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-11T12:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 21 s
Description: 学ぶ 冷却セルプロセッサシステムを用いたヒト単核細胞の精製法。密度勾配遠心分離により細胞生存率を維持し、GMP対応クリーンルーム環境で無菌処理を実現する革新的な細胞処理技術です。

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著者は、ヨーロッパの糖尿病ゲノム研究所(ANR-10- LABEX-0046からFP)とカタールの代謝研究所であるカタールのハマド医療法人に感謝したいと思います。著者は、論文処理料の支援について、ハマドメディカルコーポレーションの医学研究センターにも感謝しています。

このプロトコルでは、施設の廃棄ガイドラインに基づき、使用不可と判断され廃棄された全血を使用しました。IRBの承認およびインフォームドコンセントは適用されません。
1. 冷却セルプロセッサーのセットアップ
注意：すべての手順はクリーンルーム環境で実施し、スタッフはクリーンルームの衣類着用手順を遵守しなければなりません。
<ol>
	<li>機器の購入
	<ol>
		<li>予備のプレキシガラス製蓋を購入してください。冷却装置システム（機械的冷蔵ガスストリーム温度制御機能付きクーラー、エアドライヤー、圧力および流量レギュレーター）、および保証（オプション）を購入してください。参照してください。 材料一覧 参考文献用。 
		注：合計費用は16,133ドルであり、配送料および関税は含まれていません。</li>
		<li>地域の医療ガス供給業者から、標準グレード（欧州薬局方リファレンス1238）に準拠した圧縮医療ガスである医療用乾燥空気を注文してください。6.8 m³のシリンダーを2本購入してください。3 (47 L：23 cm x 153 cm；直径 x 長さ)</li>
	</ol>
	</li>
	<li>装置のセットアップ（図1 および 図2)
	<ol>
		<li>GMPクリーンルームに設備を持ち込む（GMP手順に従い、クリーンルームへの搬入前に消毒を行う）。</li>
		<li>医療用圧縮空気については、ガスシリンダーをクリーンルーム内に直接設置せず、ガスラインを配管してください。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>冷却のためのセルプロセッサーの改造
	<ol>
		<li>まず、プレキシガラス製のカバーを取り除きます。保証に関する問題が生じた場合に備え、元のプレキシガラスカバーは保管しておいてください。遠心分離機のカバーに亀裂が入るのを防ぐため、セルプロセッサーの予備リッドに、冷却装置のノズルチップの外径に適合する直径の穴を開けます（推奨サイズは13.3 mmです）。</li>
		<li>ブラケットを円形のフォーム材で一緒に固定します。これは、蓋の破損や傷つきを防ぐため、また、セルプロセッサーの上方でクーラーノズルを固定するため、注入される空気の高圧による蓋の過度な屈曲から保護するため、ノズルの重量を支えるため、そして最後に、実験手順中にオペレーターがセルプロセッサーのすべての必要な機能に自由かつ安全にアクセスでき、最大限の安全性を確保するために行います。</li>
		<li>冷却ノズルをプレキシガラスの穴に取り付け、冷却システムをセルプロセッサーに接続します。ブラケットとフォームクッションで固定してください。</li>
		<li>冷却ハウジングをノズルから最大8フィート（2.44 m）離れた場所に設置してください。温度コントローラーは別のキャビネットに収納し、冷却ハウジングから6フィート（1.83 m）以内に配置してください。</li>
		<li>クーラーの設定温度を-に設定します。40 &#176;C クーラーで気流を冷却するために使用します。出口空気温度は、デジタルインジケーターに次のような分解能で連続的に表示されます。 0.1 &#176;C出口温度をデジタル的に～に設定します。 0.1 &#176;C 温度コントローラーを用いて。</li>
		<li>圧力および流量調整モジュールで、空気供給の圧力と流量を制御します（図2）して、クーラーに供給する。エアストリームを-で冷却した際の最適条件に達するように、それぞれ55 psiおよび4 SCFMの流量に設定する。30 &#176;C &#177; 2 &#176;C.</li>
		<li>医療用ガスの供給圧力が5 barに調整されており、少なくとも90分間持続することを確認してください。これは、圧縮空気が到達するまでに必要となります。30 &#176;C. 
		&#8203;注：医療用ドライエアは圧縮医療ガスであり、完全に加圧されたドライエアは標準グレードに準拠しています。</li>
		<li>遠心分離機カバーに開けられた穴を通して、セルプロセッサーの蓋に接続されたクーラーノズルから5 barの圧力を供給します。冷却された医療用空気をセルプロセッサーの遠心ボウル内に注入します（図2）。冷却空気が遠心機ローターのアルミニウム製リムに対して垂直に当たるように、エア注入の位置を選択してください。</li>
		<li>セルプロセッサーを準備する際は、ローターが室温であることを確認してください（18 &#176;C）。冷却システムの自動温度調節器を-に設定します。30 &#176;C そして、冷気をローターに直接噴射します。 
		注：最適な温度勾配（+）に到達させるため、異なる試行条件の検討を行った。4 &#176;C細胞プロセッサーの細胞分離システムにおける耐熱性の克服および、遠心分離中のローターの加熱を抑制するために必要である。プログラムされた温度調節器により、処置中、特に遠心分離中の細胞処理機内部を、クリーンルーム温度の＋〇〇度の最適な目標温度に維持する。18 &#176;C.
		<ol>
			<li>セルプロセッサーを設定し、最初の予冷フェーズにて、プロセッサー（セルプロセッサーキットなし）を＋まで冷却します。3 &#176;C 30～45分間行い、セルプロセッサーの2回目の予冷フェーズでは、キットを+で予冷して実行してください。4 &#176;C 134倍で g5分間。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 空中浮遊粒子数計測
<ol>
	<li>作動段階における加熱装置の影響を評価するため、ISO 14644-1規格に従って、冷却装置がGMPクリーンルーム環境に適合しているかを確認します。</li>
	<li>粒子数モニタリングを用いて、静止時および作動時のクリティカルコントロールポイントにおいて、要求される清浄度が達成されていることを証明します。
	<ol>
		<li>最小サンプリング地点数は、測定面積によって異なります。以下の式を用いて算出してください。 
		<img alt="式 1" src="/files/ftp_upload/65321/65321eq01.jpg" style="margin: auto;" /> 
		&#8203;ここで、Aはクリーンルームまたは清浄空気制御空間の面積（m2）、NLは小数点以下を切り上げたサンプリング地点数です。</li>
		<li>空気サンプリング量は、各地点における最小量です。規定された最大粒子径の粒子を20個カウントするのに十分な空気量であることを確認してください。空気サンプリング量は、以下の式で算出します。 
		V= 20/C x 1000 
		ここで、Vは1地点あたりの最小1回サンプリング量（L）、Cはクラス制限値（粒子数/m3）です。</li>
		<li>面積に応じて、各地点で1回以上のサンプリングを行います。各地点での最小サンプリング量は2 L、最小サンプリング時間は少なくとも1 minであることを確認してください。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>サンプリング前に、パージフィルターを用いてパーティクルカウンターをパージします。フィルターを取り外し、サンプリング用の等速吸引プローブを取り付けます。</li>
	<li>特定したサンプリング地点にパーティクルカウンターを設置します。パーティクルカウンターのメイン画面からサンプル収集を開始します。</li>
	<li>サンプリングが終了したら、パーティクルカウンターを次の地点へ移動させます。すべての地点でのサンプリングが完了したら、データを確認し、レポートを印刷します。</li>
	<li>エリア内の全サンプリング地点における平均粒子濃度が表 1に記載されたクラス制限値を下回った場合、許容粒子濃度を満たしているとして、その部屋は合格とみなします。</li>
</ol>
3. 勾配剤の調製および細胞分離処理
<ol>
	<li>実験に先立ち、低密度および高密度の密度勾配液とセルプロセッサーキットを、冷蔵庫内にて+4 °Cで一晩予冷しておく。</li>
	<li>セルプロセッサーを、停止状態で45分間予冷する（すなわち、使用前にセルプロセッサーの電源を入れる）。温度を+2 °Cから+5 °Cの間に維持する。+4 °Cで予冷したセルプロセッサーキットを装着する。</li>
	<li>標準的なエタノール冷却二重ジャケット式勾配作成装置（オプション；図 3）を使用する場合、2つのガラスチャンバーを接続し、マグネチックスターラー上に配置する。2つのチャンバー間のチューブをクランプで固定する。0 °Cのエタノール循環冷却チラーを用いて勾配作成装置を冷却する。</li>
	<li>まず、チャンバーに130 mLの高密度勾配液（HD; 1.087 g/mL）を満たし、バッグの底部に高密度層をロードする準備を行う。ポンプ速度150 mL/minでロードする。</li>
	<li>バッグ内に高密度勾配液が入ったら、フロントビーカーに130 mLの高密度（HD）勾配液を、バックビーカー（クランプ閉）に140 mLの低密度（LD; 1.063 g/mL）勾配液を加える。</li>
	<li>2つのチャンバー間の止血鉗子/クランプを外し、ポンプ速度50 mL/minで連続的な勾配を作成する。</li>
	<li>血液銀行からの供給状況に応じて、全血廃棄物から回収した複数の匿名バフィーコートをプールしたヒト単核バフィーコート細胞を、精製用に事前に準備する（10個のバフィーコートバッグに40 mLから60 mLの全血を添加した）。
	<ol>
		<li>単核細胞（MNC）の分離
		<ol>
			<li>低密度ヒト単核細胞の分離には、密度勾配遠心法を用いる。手順は以下の通りとする。</li>
			<li>細胞調製のため、血液量（抗凝固全血または懸濁バフィーコート）を算出する。転倒混和により、血液を2倍〜4倍の緩衝液で希釈する。血液の希釈度が高いほど、単核細胞の純度が向上する。</li>
			<li>リン酸緩衝液と抗凝固剤を混合して緩衝液を調製する。血液量を35 mLで除して必要なチューブ数を算出し、各チューブに1.073密度勾配溶液を15 mLずつ注ぐ。</li>
			<li>60 mLシリンジに針を接続し、密度勾配の表面をなぞるようにして、希釈した血液懸濁液35 mLを緩やかに重層させる。少量のサンプルの場合はピペットを使用する。界面を乱すと単核細胞層が不鮮明になるため、乱さないように注意する。</li>
			<li>20 °Cで400 x g、20分間、ブレーキなし（加速&#160;0、減速&#160;0）で遠心分離する。遠心後、滅菌転送ピペットを用いて単核細胞の界面層を慎重に回収する。細胞を別の新しい50 mLコニカルチューブに移す。</li>
			<li>緩衝液（抗凝固剤添加PBS）で細胞を2回洗浄する。1回目の洗浄では、細胞の入ったチューブに緩衝液を50 mLまで満たす。20 °Cで300 x g、10分間遠心分離して細胞をペレット化する（加速&#160;9、減速&#160;0）。上清をすべて注意深く除去する。</li>
			<li>血小板を除去するため、2回目の洗浄を行う。ペレットを緩衝液で50 mLの体積に再懸濁する。20 °Cで200-300 x g、10分間遠心分離する（加速&#160;9、減速&#160;0）。</li>
			<li>細胞を最終量5 mLに再構成する。これらの細胞の比重は、低密度MNC（&#60;1.073）に近いものである必要がある。密度計を用いて勾配の比重を測定する。</li>
			<li>転送バッグ内で、ペレットを95 mLの高密度勾配培地（1.083 g/mL）に加え、最終量100 mLに再懸濁する。この産物を細胞分離機を用いた精製に使用する。最終量100 mLには、細胞と1.083高密度勾配培地が含まれている。 
			注：バフィーコートは、0.5% BSAまたは自己血漿を含むPBS中で、冷蔵庫に一晩保存することが可能である。また、バフィーコートの洗浄も可能である。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>作成済みの勾配の上に、100 mLの濃縮保存液に懸濁した、バフィーコートから単離された最大30 mLのMNCを、ペリスタルティックポンプを用いて25 mL/minでロードする。勾配は+4 °Cに維持する。</li>
	<li>あらかじめ校正したサーモプローブを用いて、セルプロセッサー内部の温度を継続的に測定する。滅菌サーモプローブに接続したデジタル熱電対を使用して、工程中の勾配液および細胞の温度をモニターする。</li>
</ol>
4. グラジエントローディングの各ステップの最適化
<ol>
	<li>+4 °Cで予冷したセルプロセッサーキットを装着する。高密度勾配液（130 mL）を+4.5 °Cでロードする。勾配ロードの終了後、ローターによる発熱を最小限に抑えるため、遠心分離機を比較的低速（537 x g）に設定する。</li>
	<li>セルプロセッサーの電源を切り、油圧システムを運転前レベルに戻して空気を抜く。</li>
	<li>セルプロセッサーを537 x gで再始動し、高密度勾配液（130 mL）および低密度勾配液（140 mL）を加え、+4.3 °C、流量50 mL/minで連続密度勾配を作成する。</li>
	<li>バフィーコート（30 mL）を、+6 °Cの冷保存液100 mLを用い、流量25 mL/minでロードする。洗浄液50 mL（25 mL x 2）を加える。</li>
	<li>+5 °Cで5分間後、分離した勾配画分を100 mL/minの流量で12本のボトルに回収する。</li>
	<li>チューブに洗浄用培地（M199 + 20% human albumin + 10% Penicillin streptomycin）を満たす。チューブ1には洗浄用培地100 mLと細胞150 mLを、チューブ2〜12には洗浄用培地225 mLと細胞25 mLを入れる。</li>
</ol>

Advancements in Cooling Cell Processors for Enhanced Viability in Cell Therapy

<ol><li>Shapiro, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation+in+seven+patients+with+type+1+diabetes+mellitus+using+a+glucocorticoid-free+immunosuppressive+regimen%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen.</a> The New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).</li>
<li>Vesilind, G. W., Simpson, M. B., Colman, R. E., Kao, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+centrifugal+blood+cell+processor+for+washing+platelet+concentrates%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a centrifugal blood cell processor for washing platelet concentrates.</a> Transfusion. 28 (1), 46-51 (1988).</li>
<li>Lake, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+purification+of+human+islets+utilizing+discontinuous+albumin+gradient+on+IBM+2991+cell+separator%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Large-scale purification of human islets utilizing discontinuous albumin gradient on IBM 2991 cell separator.</a> Diabetes. 38, 143-145 (1989).</li>
<li>Ricordi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+islet+isolation+and+allotransplantation+in+22+consecutive+cases%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Human islet isolation and allotransplantation in 22 consecutive cases.</a> Transplantation. 53 (2), 407-414 (1992).</li>
<li>Friberg, A. S., Stahle, M., Brandhorst, H., Korsgren, O., Brandhorst, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+islet+separation+utilizing+a+closed+automated+purification+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+transplantation%22%5BJournal%5D)">Human islet separation utilizing a closed automated purification system.</a> Cell transplantation. 17 (12), 1305-1313 (2008).</li>
<li>Bampton, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Australian+experience+with+total+pancreatectomy+with+islet+autotransplantation+to+treat+chronic+pancreatitis%5BTitle%5D)+AND+%22ANZ+Journal+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Australian experience with total pancreatectomy with islet autotransplantation to treat chronic pancreatitis.</a> ANZ Journal of Surgery. 91 (12), 2663-2668 (2021).</li>
<li>Doppenberg, J. B., Engelse, M., de Koning, E. J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRISM%3A+A+Novel+Human+Islet+Isolation+Technique%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">PRISM: A Novel Human Islet Isolation Technique.</a> Transplantation. 106 (6), 1271-1278 (2021).</li>
<li>Shimoda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+purification+method+using+large+bottles+effectively+achieves+high+islet+yield+from+pig+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Islet purification method using large bottles effectively achieves high islet yield from pig pancreas.</a> Cell Transplantation. 21 (2-3), 501-508 (2012).</li>
<li>Noguchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+Islet+Purification+from+Large+Mammals+and+Humans+Using+a+COBE+2991+Cell+Processor+versus+Large+Plastic+Bottles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pancreatic Islet Purification from Large Mammals and Humans Using a COBE 2991 Cell Processor versus Large Plastic Bottles.</a> Journal of Clinical Medicine. 10 (1), 10(2021).</li>
<li>Shapiro, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+trial+of+the+Edmonton+protocol+for+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">International trial of the Edmonton protocol for islet transplantation.</a> The New England Journal of Medicine. 355 (13), 1318-1330 (2006).</li>
<li>Ricordi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((National+Institutes+of+Health-Sponsored+Clinical+Islet+Transplantation+Consortium+Phase+3+Trial%3A+Manufacture+of+a+Complex+Cellular+Product+at+Eight+Processing+Facilities%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">National Institutes of Health-Sponsored Clinical Islet Transplantation Consortium Phase 3 Trial: Manufacture of a Complex Cellular Product at Eight Processing Facilities.</a> Diabetes. 65 (11), 3418-3428 (2016).</li>
<li>Swift, S., Kin, T., Mirbolooki, M., Wilson, R., Lakey, J. R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+cooling+systems+during+islet+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Comparison of cooling systems during islet purification.</a> Cell Transplantation. 15 (2), 175-180 (2006).</li>
<li>Rilo, H. L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+islet+number+and+viability+obtained+during+purification+on+Euro-Collins-Ficoll+gradients+processed+on+a+refrigerated+or+nonrefrigerated+COBE+2991+cell+separator%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation+Proceedings%22%5BJournal%5D)">Comparison of islet number and viability obtained during purification on Euro-Collins-Ficoll gradients processed on a refrigerated or nonrefrigerated COBE 2991 cell separator.</a> Transplantation Proceedings. 26 (6), 3430(1994).</li>
<li>Chadwick, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+islet+purification+using+bovine+serum+albumin%3A+The+importance+of+density+gradient+temperature+and+osmolality%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Pancreatic islet purification using bovine serum albumin: The importance of density gradient temperature and osmolality.</a> Cell Transplantation. 2 (4), 355(1993).</li>
<li>Nano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+human+pancreatic+islet+isolation+around+Europe%3A+results+of+a+survey+study%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of human pancreatic islet isolation around Europe: results of a survey study.</a> Transplantation. 104 (1), 190-196 (2020).</li>
<li>Chadwick, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Storage+of+pancreatic+digest+before+islet+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Storage of pancreatic digest before islet purification.</a> Transplantation. 58 (1), 99-104 (1994).</li>
<li>Amrani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detrimental+effects+of+temperature+on+the+efficacy+of+the+University+of+Wisconsin+solution+when+used+for+cardioplegia+at+moderate+hypothermia.+Comparison+with+the+St.+Thomas+Hospital+solution+at+4+degrees+C+and+20+degrees+C%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Detrimental effects of temperature on the efficacy of the University of Wisconsin solution when used for cardioplegia at moderate hypothermia. Comparison with the St. Thomas Hospital solution at 4 degrees C and 20 degrees C.</a> Circulation. 86, 280-288 (1992).</li>
<li>Fremes, S. E., Li, R. K., Weisel, R. D., Mickle, D. A., Tumiati, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+hypothermic+cardiac+storage+with+University+of+Wisconsin+solution.+An+assessment+with+human+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Prolonged hypothermic cardiac storage with University of Wisconsin solution. An assessment with human cell cultures.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 102 (5), 666-672 (1991).</li>
<li>Adewola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+cooling+systems+for+the+COBE+2991+cell+separator+used+in+the+purification+of+human+pancreatic+islets+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Cryo+Letters%22%5BJournal%5D)">Comparing cooling systems for the COBE 2991 cell separator used in the purification of human pancreatic islets of Langerhans.</a> Cryo Letters. 31 (4), 310-317 (2010).</li>
<li>Keymeulen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implantation+of+standardized+beta-cell+grafts+in+a+liver+segment+of+IDDM+patients%3A+graft+and+recipients+characteristics+in+two+cases+of+insulin-independence+under+maintenance+immunosuppression+for+prior+kidney+graft%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Implantation of standardized beta-cell grafts in a liver segment of IDDM patients: graft and recipients characteristics in two cases of insulin-independence under maintenance immunosuppression for prior kidney graft.</a> Diabetologia. 41 (4), 452-459 (1998).</li>
<li>de Kort, H., de Koning, E. J., Rabelink, T. J., Bruijn, J. A., Bajema, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22BMJ%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation in type 1 diabetes.</a> BMJ. 342, (2011).</li>
<li>Barbaro, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+human+pancreatic+islet+purification+with+the+refined+UIC-UB+density+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient.</a> Transplantation. 84 (9), 1200-1203 (2007).</li>
<li>Lemarie, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+single-platform+method+for+the+enumeration+of+CD34%2B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">A new single-platform method for the enumeration of CD34+ cells.</a> Cytotherapy. 11 (6), 804-806 (2009).</li>
</ol>

著者は利益相反を宣言しません。

世界中の膵島分離施設は、何十年にもわたって、再利用された細胞プロセッサーでヒト膵島精製を採用してきました。一部の膵島生産施設は、非冷蔵セルプロセッサーで膵島を処理し続けているが、ほとんどのセンターは、セルプロセッサ10,11,15の冷蔵バージョンを使用している。センターは、セルプロセッサを湿気や結露にさらされるという大きな欠点がある冷蔵室に配置するか、シャフトを含むセルプロセッサ自体に技術的に大幅な変更を加え、マシンの保証とその予防保守に直ちに影響を及ぼします。提示された新しいGMP細胞療法対応セルプロセッサー冷却システムは、室温での元のセルプロセッサーセルセパレーターによる遠心分離では達成できない、定義された低温(+ <10°C)で細胞処理を実行するのに有益です。
空冷技術はブリュッセル20 でグループによって最初に使用され、<sup class=...

重症1型糖尿病に対する膵島移植は、内因性インスリン分泌を回復させることができ、多くの国で標準治療となっています1.膵島の単離は、膵臓の温性酵素的および機械的消化、消化組織の回収のための冷却相、およびセルプロセッサー上での連続的または不連続な密度勾配による膵島精製を含む多段階の手順です。急速な冷却は酵素消化段階を遅らせ、腺房細胞を汚染することによって遊離する消化酵素から膵島を保護します。セルプロセッサはもともと、周囲温度で細胞の血液成分を分離するように設計されました2。これは、1989年にランゲルハンスの人間の膵島を浄化するために再利用されました3。30年間にわたり、ヒト膵島は臨床試験のために精製され、最近では、不連続な勾配を持つ細胞プロセッサーで精製されてきました4、または勾配メーカー1または同等のコンピューター操作ミキサー5,6,7.他のグループは、大型の哺乳動物や人間から大型の円筒形のプラスチックボトルを使用した膵島精製を報告しています8,7,9、これにより精製の有効性と膵島の品質が大幅に向上しました。
確かに、臨床移植のためにヒトの膵島を精製するためのゴールドスタンダードを考慮すると10,11、製造されたセルプロセッサーは冷蔵がありませんでした。冷蔵がなかったことの直接的な結果として、膵島は精製ステップ中に温度上昇にさらされました。遠心分離中、ローターの機械的摩擦により、制御不能な温度上昇が発生します12,13。細胞プロセッサーは、グルコース誘発性インスリン分泌と細胞生存率を統計的に増加させる膵島分離センターの冷却システムに適応させ、精製手順中に膵島を低温に保つことの利点を確認しました14,15。
1980年代後半に、密度勾配精製中の膵島の損傷を減らすために10機の冷蔵プロトタイプが製造されたが、それ以上の注意が払われなかったことに注意すべきである。セルプロセッサーのプロトタイプは、チルドポリエチレングリコールによるスピンドルとボウルの冷却に基づいていました。特に、臓器保存液や多糖類の密度勾配などの膵島精製溶液は、室温以上で使用すると膵島の生存率に悪影響を及ぼす可能性があります16,17,18.膵島細胞精製のための細胞プロセッサーと元の非冷蔵細胞プロセッサーの異なる冷却戦略の比較を評価し、ローターの摩擦によって発生する制御不能な温度上昇に対抗するために評価しました。ヒト膵島の精製中に細胞プロセッサーを冷却するためのいくつかの試みがなされてきました。セルプロセッサは、イリノイ大学の島分離センターで現在使用されている勾配遠心分離中に0〜8°Cの温度を維持するために特別に設計された冷蔵室に一時的または恒久的に収容できます<s>up class="xref">19<、マイアミ大学14、オックスフォード大学の施設15、およびサンフランシスコ大学(カスタム冷却ユニットはセルプロセッサを包んでいます)。別の変更には、ジュネーブ、スウェーデン、およびチェコ共和国の電子制御液体窒素冷却を使用した冷却システムによるセルプロセッサスピンドルのコア冷却が含まれます15,19。2000年半ばの別の選択肢は、リール大学の空調ユニット12によるセルプロセッサのコア冷却、またはシャフトの液体冷却による冷却でした。
セルプロセッサの冷却変更は容易には利用できず、保証の喪失や機械の保守に対する建設業者の拒否など、GMPクリーンルーム環境内でのリスク(湿度、結露の蓄積)を伴います。その結果、ミラノ(イタリア)、オスロ(ノルウェー)、エジンバラ(スコットランド)など、一部の島センターでは、島精製プロセス中に細胞プロセッサの冷却システムを使用しません15。
現在の研究は、新しく開発された容易に利用可能なクーラーと最小限の改造されたセルプロセッサシステムの有効性をテストするために設計されました。簡単に説明する空気ベースのクーラーは、-40°Cから-100°Cの間の乾燥ガスの1標準立方フィート/分(SCFM)の温度を制御する機械的に冷却された熱交換器です。この冷却システムには、乾燥した医療用空気の供給が必要です。空気はラインと熱交換器を通って流れ、(7.9 mm)ノズルから出ます。ノズル内に配置されたヒーターは、空気の流れの温度を制御するために熱を供給します。予備の固体プラスチック遠心分離機カバーが購入され、最小限の変更が加えられました。カバーには直径13.3mmの穴が開けられ、冷却された空気はクーラーノズルから遠心分離機カバーの穴を介してセルプロセッサに送られました。冷却された医療用空気は、液体の温度または密度勾配を絶えず制御しながら、セルプロセッサの遠心分離ボウル内に注入されました。
冷却セルプロセッサの技術的性能と、冷却エレメントがGMPクリーンルーム環境に与える影響を評価しました。主な焦点は、生存率を維持するために、ヒトの膵島精製中に堅牢に低い温度(<10°C)を達成することでした。膵島単離の代理としてバフィーコート密度分離を使用して、この冷却プロトコルが細胞生存率に及ぼす影響を決定しました。

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Air粒子</td><td>カウンターLasair III&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>エアジェットXR40&nbsp;</td><td>SP Scientific</td><td>FTSシステムXR40</td><td></td></tr><tr><td>バイオセーフティキャビネット</td><td>Thermo Scientific</td><td>EQ-1301</td><td></td></tr><tr><td>循環冷却チラーJulabo</td><td></td><td>CF30</td><td></td></tr><tr><td>COBE 2991&nbsp;</td><td>テルモ BCT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>コニカルクーリングトレイ</td><td>バイオレップ</td><td>CCT-01</td><td></td></tr><tr><td>ダブルジャケットグラディエントメーカー&nbsp;</td><td>社内</td><td></td><td></td>でカスタマイズ</tr><tr><td>KJT-熱電対温度計</td><td>ハンナインスツルメン</td>ツ <td>HI93551N</td><td>液体温度測定用</td></tr><tr><td>マグネチックスターラー&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>88880014</td><td></td></tr><tr><td>蠕動ポンプ&nbsp;</td><td>MasterFlex</td><td>MK-77921-79</td><td></td></tr><tr><td>温度計&nbsp;</td><td>Extech Instruments</td><td>RMS 430</td><td>COBE温度用</td></tr><tr><td>水なしビーズバスコール</td><td>パー</td><td>マー10122-00</td><td></td></tr><tr><td>材料および試薬</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD幹細胞列挙キット</td><td>BDバイオサイエンス&nbsp;</td><td></td><td></td>344563</tr><tr><td>COBE 2911 チューブ キット</td><td>テルモ BCT</td><td>90819</td><td></td></tr><tr><td>コニカル チューブ 250ml</td><td>コーニング</td><td>430776</td><td></td></tr><tr><td>グラジエント密度 1.1</td><td>バイオクロム&nbsp;</td><td>L6155</td><td></td></tr><tr><td>目盛り付き使い捨てボトル</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャー382019-1000</td><td></td></tr><tr><td>ヒトアルブミン20%&nbsp;</td><td>ケドリオン・バイオファーマ&nbsp;</td><td>8091600</td><td></td></tr><tr><td>M199 洗浄液&nbsp;</td><td>コーニング&nbsp;</td><td>99-784-CM&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex</td>チューブ<td>Masterflex</td><td>96400-6</td><td></td></tr><tr><td>医療ドライエア</td><td>リンデヘルスケア</td><td>Medi On 22</td><td></td></tr><tr><td>Pencillin-streptomycin&nbsp;</td><td>ギブコ&nbsp;</td><td></td><td></td>15140122</tr><tr><td>サーモプローブ</td><td>Biorep</td><td>TC-02</td><td>サーモセンサー</td></tr><tr><td>トリパンブルー&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>ウィスコンシン大学ベルツァー校(UW)&nbsp;</td><td>生命の架け橋&nbsp;</td><td>RM/N 4055</td><td>コンサベーション・メディウム</td></tr></tbody></table>

新しい冷却セルプロセッサシステムが膵島セル隔離施設に与える影響の評価

Evaluation of the Impact of a New Cooling Cell Processor System on Islet Cell Isolation Facility

標準的な細胞治療装置は、臨床移植のためにヒトの膵島を精製するためのゴールドスタンダードの細胞処理装置を含め、ほとんど冷蔵されないため、遠心分離ステップ中に細胞を高温にさらす可能性があります。カスタム冷却システムは、人間の膵島の生存率と機能に直接的な利益をもたらします。本研究は、最小限の変更で容易に利用できる冷却型セルプロセッサーシステムの有効性を検証し、ヒト細胞の生存率とGMPクリーンルーム環境への影響を評価するために設計されました。このクーラーシステムは、-30°Cに設定された機械式冷凍熱交換器を使用して、遠心分離機のカバーに開けられた穴から冷却された医療グレードの乾燥空気をセルプロセッサーボウルに送り込みました。カタールでは膵臓ドナーの利用が限られているため、システムバリデーションは、プールされたヒト骨髄バフィーコートの連続的な密度勾配精製で行われました。無菌性、乱流、および粒子数は、クラスCおよびクラスBのクリーンルーム環境で測定されました。冷却されたセルプロセッサの周囲に乱流が発生することはなく、クリーンルームのGMP基準に従って、0.5 μmおよび5 μmの過剰な空気中の微粒子は発生しませんでした。収集ステップの開始時と終了時に、温度は非冷却セルプロセッサで0.20°C±0.34°Cと21.93°C±それぞれ21.50°Cに上昇し、冷却セルプロセッサでは0.17°C±11.16°C±0.35°Cにそれぞれ上昇しました（p <0.05)。冷却されたセルプロセッサーにより、単核細胞分画の回収率(98%)と後処理後の生存率(100%)(100±2%)の両方が向上しました。新しい冷却システムは、GMPクリーンルーム環境に微粒子の影響を与えずに、セルプロセッサによって生成される熱を効果的に低減します。ここで説明する冷却セルプロセッサは、安価(税金、通関手続き、輸送費を含まない16,000ドル)で、堅牢な冷却を提供する低侵襲の方法です。現在、GMP細胞治療施設における本技術は、臨床プログラムのためのヒト膵島細胞の単離・移植に応用されています。

冷却式細胞処理装置がGMPクリーンルームに与える影響を最初に定量化した。標準化された方法として、粒子計数器を用いて、細胞処理装置および加圧空気冷却システムの近傍にあるGMPグレードCおよびグレードBのクリーンルーム環境における重要なポイントでの空中粒子汚染を測定した。その結果、装置周囲に乱流は発生しなかったことが示された。記録されたデータによると、クリーンルームのGMPグレードC、グレードB、およびBSL IIIの基準に従い、0.5 µmおよび5 µmの空中粒子が過剰に存在することはなかった(図4)。
すべての実験は、連続多糖類密度勾配を用いて行った。まず、冷却および非冷却のセルプロセッサーにおいて、細胞を含まない状態で勾配溶液の温度測定を6回の試行で異なる時間点で行った。その後の研究では、ヒト細胞を冷却セルプロセッサーを用いて密度勾配で精製した。
すべてのデータは、3回の独立した試験の平均値±標準偏差（SD）として示し、商用の解析ソ...

ここでのプロトコルは、GMP(Good Manufacturing Practices)クリーンルームと互換性があり、細胞の生存率後処理を改善するためのカスタム冷却セルプロセッサシステムについて説明しています。

Standard cell therapy equipment, including the gold standard cell processor to purify human islets for clinical transplantation, is rarely refrigerated, ...

evaluation-impact-new-cooling-cell-processor-system-on-islet-cell

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

ヒト膵島の高品質と適切な量を達成することが成功した膵島移植のための著名な前提条件の一つです。このビデオでは、我々は段階的に説明し、人間の膵島を分離するための手順：変更された自動化法を用いて（パートI消化および膵組織のコレクション）。...

人間の膵島単離：パートI：膵組織の消化とコレクション

ヒト膵島の高品質と適切な量を達成することが成功した膵島移植のための著名な前提条件の一つです。修正された自動化された方法を使用して：このビデオでは、我々は人間の膵島の分離（ヒト膵島の精製と​​文化部II）の手順をステップバイステップで説明します。...

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新しい冷却セルプロセッサシステムが膵島セル隔離施設に与える影響の評価

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