Name: マルチプレックス血清学的検査における異なる抗体クラスの同時検出(英語) (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-14T14:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 25 s
Description: 学ぶ デュアルレポーター多重免疫アッセイを用いたライム病のIgG・IgM抗体同時検出法。少量の血清サンプルから複数のボレリア抗原に対する免疫応答を高感度に解析し、早期感染と持続性免疫応答の識別を可能にします。

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このレポートは、Luminex(テキサス州オースティン)から資金提供を受けました。著者らは、Matthew Silverman PhD(Biomedical Publishing Solutions, Panama City, FL; mattsilver@yahoo.com)の分析的および科学的な編集支援に感謝します。また、著者らは、この研究で使用した ボレリア 抗原を提供してくれたtgcBIOMICS GmbH(ドイツ、ビンゲン)のHarald Klein氏とChristoph von Eichel-Streiber氏にも感謝の意を表します。技術的アッセイの検証と品質管理のためのヒト血清サンプルは、以下から入手しました: 1) ドイツにおける SARS-CoV-2 に対する抗体に関する多局所および連続有病率研究 ドイツ、ブラウンシュヴァイクのヘルムホルツ感染研究センター疫学部門による。2)神経科、Sächsisches Krankenhaus Rodewisch(Rodewisch、ドイツ)。ヒトサンプルの使用は、ドイツのハノーバー医科大学(9086_BO_S_2020)の倫理委員会によって承認されました。

血清中の ボレリア特異的IgGおよびIgMに対するマルチプレックスイムノアッセイ

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<li>Ehrenstein, M. R., Notley, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+natural+IgM%3A+scavenger%2C+protector+and+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">The importance of natural IgM: scavenger, protector and regulator.</a> Nature Reviews Immunology. 10 (11), 778-786 (2010).</li>
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<li>Chattopadhyay, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brilliant+violet+fluorophores%3A+A+new+class+of+ultrabright+fluorescent+compounds+for+immunofluorescence+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Brilliant violet fluorophores: A new class of ultrabright fluorescent compounds for immunofluorescence experiments.</a> Cytometry Part A. 81 (6), 456-466 (2012).</li>
<li>Coors, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+seropositivity+for+Borrelia+burgdorferi+and+associated+risk+factors%3A+findings+from+the+Rhineland+Study%2C+Germany%5BTitle%5D)+AND+%22Parasites+%26+Vectors%22%5BJournal%5D)">Regional seropositivity for Borrelia burgdorferi and associated risk factors: findings from the Rhineland Study, Germany.</a> Parasites & Vectors. 15 (1), 241(2022).</li>
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</ol>

著者は何も開示していません。

この報告は、血清サンプル中の抗ボレリア免疫反応性を再現性と感度で測定する2レポータービーズベースのボレリア免疫測定法の開発に焦点を当てています12。ライムボレリア症を引き起こす様々な病原性ボレリア種は、変異体特異的抗原の不均一性によって区別することができる6,7,8,9。マルチプレックスアッセイは、IgGおよびIgMを介した抗ボレリア免疫反応性を同じ反応ウェル内で同時に評価するため、2つのシングルプレックスアッセイを別々に実行するために必要な試薬、労力、およびサンプル材料を節約できます。IgMとIgGの応答を経時的に比較することで、感染後にIgMからIgGへの血清変換が起こるため、疾患の進行をより適切に追跡できる可能性があります6。
デュアルレポーターシステムは、2つの異なる検出抗体システム13,15を使用する。関連する実験では、ボレリア抗IgM検出システムと抗IgG検出システムの間に有意な検出可能な交差反応性は示されませんでした 両方の抗体クラスを同じ反応ウェルで一緒に分析した場合12。IgM抗体とIgG抗体の結合親和性が低いことを考慮し16,17、PEはイムノアッセイで日常的に使用される最も強い発光蛍光色素の1つであるため、IgM検出(デュアルレポーター装置の最初のレポーターチャネル)にはPE標識検出抗体を選択しました18。IgG評価には、ビオチン化検出抗体を使用し、その後、BV421標識ストレプトアビジン(装置の2番目のレポーターチャネル)で照射しました19。シングルレポーターシステムと比較して30分のインキュベーションステップが追加されますが、デュアルレポーターシステムでは、反応ごとに2倍の情報が得られます。全体として、デュアルレポーターマルチプレックスアッセイは、シングルレポーターアッセイを2回実行するよりも、累積的な時間と材料のインプットが少なくて済みます。
マルチプレックスボレリアアッセイの優れた性能と安定性は、アッセイ内およびアッセイ間の精密研究における高い再現性、およびIgGおよびIgM評価の両方において幅広いサンプル濃度にわたる希釈直線性と希釈平行度の実証によって実証されました。2つの装置間の光学系とキャリブレーション設定の違いにより、シングルチャンネル装置を使用した場合とデュアルチャンネルシステムを使用した場合(PEで≈1.7×高い)では、同じ蛍光色素の絶対蛍光発光レベルが高いことが観察されました(図4)。それにもかかわらず、両方の蛍光色素の蛍光発光曲線は、サンプル希釈率の極端さが高い場合と低い場合、両方の装置の線形範囲内にとどまり、測定された絶対蛍光の不一致は、ボレリアの曝露状態の分類に影響を与えませんでした。12名
このビーズベースの ボレリア マルチプレックスアッセイの主な利点は、アッセイを変更または拡張して、異なる分析種または追加の分析種を評価すること、 たとえば、他の ボレリア 種の抗原に対する抗体を検出することが容易であることです。xMAP磁気ビーズセットには、装置の分類チャンネルで区別できるさまざまな色素の組み合わせが含まれており、理論的には、同じサンプル内で最大500の固有の分析種を同時に評価できるマルチプレックスアッセイに実装できます。今回の研究では、アッセイの機能と安定性を実証し、シングルレポーターとデュアルレポーターシステムを比較するために、4つの代表的な ボレリア 抗原に焦点を当てていますが、最終的なアッセイでは、ヨーロッパと北米で循環している臨床的に関連する5つの ボレリア 病原体すべてを同定できる8つの抗原を調査します12。
半自動アッセイフォーマットの標準的な384ウェルマイクロタイタープレートを使用して、ハイスループット性能を実現します。96ウェルプレートと384ウェルプレートの両方に対応したアッセイと装置の互換性により、 ボレリア マルチプレックスアッセイは、全国的な研究20などの大規模なサンプルセットを迅速に分析するための効率的なスクリーニングツールとして使用できます。アッセイの手動による実施は、より小さな96ウェルプレートを使用する小さなサンプルセットでも可能です。
研究の限界には、少数のヒト血清サンプル中の少数の ボレリア 免疫反応性標的の比較評価が含まれます。しかし、最初の研究では、より大きなサンプルセット内の5つの既知の ボレリア 種すべてからの8つの抗原を分析しても、IgGとIgMの両方のアッセイ性能が維持されることが確認されました12。また、デュアルレポーター装置は、各反応で同時に2つの抗体アイソタイプしか評価できないため、完全なアイソタイププロファイリングを行うには、追加のアッセイ反応を実行する必要があります13。
結論として、このレポートでは、ビーズベースのシングルレポーターイムノアッセイを、ヒト血清サンプル中の病原性ボレリア特異的IgG抗体とIgM抗体を同時に評価できるデュアルレポーターアッセイへの合併と変換の成功について詳しく説明しています。この複合アプローチにより、合計時間、材料、労力を節約し、2つの独立したシングルレポーターアッセイと同じデータ量を生成できます。マルチプレックスアッセイは、96ウェルから384ウェルのマイクロタイタープレートフォーマットまでスケールアップでき、ロボットプレートとリキッドハンドリング機器を使用して半自動化できるため、大規模な人口調査などのハイスループットアプリケーションに適しています。ビーズベースのデュアルレポーターアッセイシステムは、例えば、他のウイルスおよび細菌性病原体に対する免疫応答の評価13,21、臓器移植におけるHLAエピトープに対する同種抗体応答の評価22、自己免疫疾患のメカニズムの探索23において有用性が実証されています。今回の報告書では、ライム病の原因となるボレリア病原体への曝露を特定するためのマルチプレックス技術の使用について詳述しており、多様な病状における複雑な免疫メカニズムを探求するためにこのアプローチを研究室がどのように適応させることができるかの例として紹介しています。

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65323">Simultaneous Detection of Different Antibody Classes in a Multiplexed Serological Test</a>. The Authors section was updated to correct an Affiliation. It was updated from:
Julia H&#228;ring1 
Tanja Michel1 
Matthias Becker1 
Daniel Junker1 
Tatia Tchitchagua2 
Olaf Leschnik2 
Berit Lange3,4 
Stefanie Castell3,4 
G&#233;rard Krause3,4 
Monika Strengert3 
Alex Dulovic1 
Nicole Schneiderhan-Marra1 
1NMI Natural and Medical Sciences Institute, University of T&#252;bingen 
2Department of Neurology, S&#228;chsisches Krankenhaus Rodewisch 
3Department of Epidemiology, Helmholtz Centre for Infection Research 
4German Centre for Infection Research (DZIF)
to:
Julia H&#228;ring1 
Tanja Michel1 
Matthias Becker1 
Daniel Junker1 
Tatia Tchitchagua2 
Olaf Leschnik2 
Berit Lange3,4 
Stefanie Castell3,4 
G&#233;rard Krause3,4 
Monika Strengert3 
Alex Dulovic1 
Nicole Schneiderhan-Marra1 
1NMI Natural and Medical Sciences Institute at the&#160;University of T&#252;bingen 
2Department of Neurology, S&#228;chsisches Krankenhaus Rodewisch 
3Department of Epidemiology, Helmholtz Centre for Infection Research 
4German Centre for Infection Research (DZIF)

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65323">Simultaneous Detection of Different Antibody Classes in a Multiplexed Serological Test</a>. The Authors section was updated to correct an Affiliation.

Erratum: Simultaneous Detection of Different Antibody Classes in a Multiplexed Serological Test

ライムボレリア症は、北半球の温暖な気候で最も一般的なダニ媒介感染症です1。これは、ボレリア属のスピロヘータ菌によって引き起こされ、地理的分布が異なる5つの既知のヒト病原体があります2。ヨーロッパにおける主な病原性ボレリア種は B. afzelii と B. garinii であり、B. burgdorferi s.s.、B. spielmanii および B. bavariensis はそれほど頻繁には関与していない。北米では、B. burgdorferi s.s.がライム・ボレリア症の唯一の原因物質である2,3。ボレリア病原体は、マダニ属のIxodesのメンバーによって伝染し、マダニに咬まれてから24時間以内に伝染する可能性があります4。
ライムボレリア症の診断は通常、臨床症状によって行われ、その後血清学によって確認されます。ヨーロッパと北米の両方で、診断ガイドラインでは、ボレリア特異的抗原に対する抗体反応を評価するために、反射免疫ブロットによる酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)からなる2段階の検査シリーズを推奨しています1,5,6,7,8,9 .しかし、このアプローチは感度に欠けており、特にセロコンバージョンが不完全で、抗ボレリアIgGおよびIgM力価が低すぎる感染の初期段階では最適ではありません6。
マルチプレックスイムノアッセイは、一度に1つのターゲットのみを測定する従来のイムノアッセイを改良し、1つ以上の抗原に対する複数の抗体アイソタイプ応答を同時に評価することができます10,11,12。ELISAなどのアッセイは、1回の反応で1つの分析種を同定・定量することに限定されており、現在のケースでは、ボレリア菌に感染した後、単一の細菌抗原に対して誘導されたIgGまたはIgMを循環させます。このレポートでは、ヒト血清サンプル中のボレリア抗原のいずれかに対してIgG抗体とIgM抗体の両方を同時に検出するマルチプレックスイムノアッセイの開発に、ビーズベースの分析種プロファイリング技術を使用していることを説明しています。ヨーロッパ原産の最も一般的な病原性ボレリア種(B.garinii, B. afzelii, B. burgdorferi s.s.)北アメリカ (B. burgdorferi s.s.)(表1)2、3。これにより、決定的な病原体同定が可能になり、患者サンプル中の早期のIgMおよびその後のより耐久性のあるIgG免疫反応性を識別する能力が得られます。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>ターゲットアイソタイプ</td>
			<td>レポーターチャンネル</td>
			<td>抗原</td>
			<td>ボレリア種</td>
			<td>濾す</td>
			<td>抗原カップリング濃度</td>
		</tr><tr><td>免疫グロブリンM</td>
			<td>PEの</td>
			<td>OspC(オースプシー)</td>
			<td>B.ガリニイ</td>
			<td>20047</td>
			<td>5.0 μg/10 ビーズ6 個</td>
		</tr><tr><td>IgG(免疫グログラム)</td>
			<td>BV421型</td>
			<td>VlsE (英語)</td>
			<td>B. burgdorferi s.s</td>
			<td>B31の</td>
			<td>1.25 μg/10ビー ズ6個</td>
		</tr><tr><td>IgG(免疫グログラム)</td>
			<td>BV421型</td>
			<td>DbpAの</td>
			<td>B. burgdorferi s.s.</td>
			<td>ZS7の</td>
			<td>10.0 μg/106 ビーズ</td>
		</tr><tr><td>IgG(免疫グログラム)</td>
			<td>BV421型</td>
			<td>DbpAの</td>
			<td>B.アフゼリイ</td>
			<td>PKoの</td>
			<td>5.0 μg/10 ビーズ6 個</td>
		</tr></tbody></table>表1:マルチプレックスアッセイ開発に用いた 代表的なボレリア 抗原。
私たちはまず、抗ボレリア 抗原IgG抗体またはIgM抗体のいずれかを2つの別々の反応で検出するシングルレポーターイムノアッセイを開発し、次にこれらのアッセイをデュアルレポーターマルチプレックスアッセイに統合し、同じ反応混合物中の両方の抗体アイソタイプを測定しました。磁気ビーズを目的の病原体標的抗原に結合させ、患者の血清サンプルとインキュベートします。ビーズ共役抗原は、病原体抗原に対する免疫応答で生成される血清中の循環IgGとIgMの両方によって認識され、捕捉されます。アッセイIgG対IgMの特異性は、IgGまたはIgMのいずれかに結合し、それぞれが2つの二次抗体に関連する異なる蛍光色素シグナルを持つ二次抗体の選択によって決定されます。各蛍光シグナルは、IgGまたはIgM(ここではそれぞれBrilliant Violet 421またはフィコエリトリン)の検出に使用される単一の蛍光色素に特異的な異なる励起レーザーと発光捕捉を持つ、装置の2つのレポーターチャンネル(デュアルレポーター)の1つで検出されます。装置の分類チャンネルは、異なるビーズセットに固有の色分けされた色素を識別します。したがって、複数の標的抗原を異なる染色ビーズに結合させ、ビーズセットを混合して使用することで、血清サンプル中の多様な抗病原体免疫反応性を包括的に評価することができます。分類チャンネルは、個々のビーズセット(特異的抗原)を識別し、その抗原に対するIgGまたはIgMに関連する蛍光を測定します。得られたマルチプレックスアッセイは、包括的でない従来の検査と比較して時間とリソースを節約し、限られたサンプル量でライム免疫反応性を正確にカタログ化します。SARS-CoV-2感染など他の病態における免疫応答を分類するために、同様のデュアルレポーターアプローチが以前に使用されてきたが13、この報告では、ライムボレリア症における免疫反応性を特徴付けるためのマルチプレックス蛍光アッセイ技術の適用について詳述している。

<table><tbody><tr><td>抗体および検出試薬</td><td>Source</td><td>カタログ番号</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン化ヤギ 抗ヒト IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch (Dianova)</td><td>109-066-098&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ブリリアントバイオレット421-ストレプトアビジン</td><td>BDバイオサイエンス563259</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ロバ抗ヒトIgM&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch (Dianova)</td><td>709-116-073</td><td></td></tr><tr><td>Borrelia Antigens</td><td>tgcBIOMICS (Bingen, Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coupling Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC)</td><td>Thermo Scientific Pierce</td><td>77149 ProteoChem (100 mg)</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399-4</td><td></td></tr><tr><td></td><td>BSA Carl Roth</td><td>T844.3</td><td></td></tr><tr><td>MES (2-エタンスルホン酸; 双性イオン緩衝液)</td><td>Carl Roth</td><td>4256.2</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Carl Roth</td><td>4984.1</td><td></td></tr><tr><td>ProClin300</td><td>Sigma</td><td>48914-U</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide)</td><td>Thermo Scientific Pierce</td><td>24510 (500 mg)</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Scientific</td><td>85111<</td><td></td></tr><tr><td>strong>Instrumentation and Ancillary Lab Supplies</td><td>Source</td><td></td><td></td></tr><tr><td>384ウェルプレート</td><td>Corning, Cat# 3570</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96ウェル深井戸プレート</td><td>ThermoFisher Scientific, Cat# 95040450</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96ウェルハーフエリアプレート&nbsp;</td><td>コーニング、Cat#3690</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioTek 405 TSプレートウォッシャーBioTek</td><td>Instruments / Agilent Technologies、サンタクララ、カリフォルニア州&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioTek MultiFlo FX プレート ウォッシャー</td><td>BioTek Instruments/Agilent Technologies, Santa Clara, CA&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DynaMag Spin Magnet (微量遠心チューブ内のビーズの単離用)</td><td>ThermoFisher, Cat# 12320D</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flexmap 3D (two-channel, single-reporter instrument)</td><td>Luminex Corp., Austin, TX</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KingFisher Magnetic Particle Processor (96ウェルプレート内のビーズの単離用)&nbsp;</td><td>ThermoFisher、Cat#A31508</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MagPlexマイクロスフィア(磁気、蛍光、6.5-&micro;m-diameter beads)</td><td>Luminex Corp., Austin, TX</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SmartBlock Plates</td><td>Eppendorf, Cat# 5363000039</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer C</td><td>Eppendorf, Cat# 5382000015</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ThermoTop</td><td>Eppendorf, Cat# 5308000003</td><td></td><td></td></tr><tr><td>xMAP Intelliflex (3チャンネル、デュアルレポーター装置)</td><td>Luminex Corp., Austin, TX</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

マルチプレックス血清学的検査における異なる抗体クラスの同時検出(英語)

Simultaneous Detection of Different Antibody Classes in a Multiplexed Serological Test

感染症の進行をモニタリングするには、さまざまな抗原決定因子に対する免疫反応性を評価し、宿主の免疫応答のさまざまな段階で現れるさまざまな抗体アイソタイプを測定することが有用です。ライムボレリア症では、病原体は ボレリア 種の複数のメンバーの1つである可能性があります。したがって、サンプルを正しく分類するには、異なる ボレリア 種の異なる抗原に対する免疫反応性を評価する必要があります。さらに、抗病原体IgGおよびIgM応答は、疾患の進行中に異なる誘発時間経過をとる可能性があります。本研究では、異なる細菌抗原に対するIgGとIgMの両方の免疫反応性を同時に評価することにより、ヒト血清サンプル中の ボレリア特異的免疫応答を同定するのに役立つ2レポーターマルチプレックスイムノアッセイの開発を実証します。このデュアルレポーターアプローチは、シングルレポーター法の分析性能を維持しながら、時間とリソースを節約し、サンプルサイズの要件を低減します。このアッセイにより、血液サンプルから血清学的情報を半分の時間で生成することができます。

実験の概要 シングルレポーターおよびデュアルレポータービーズベースのボレリアアッセイの一般的なスキームを図 1 に示します。特定のボレリア抗原に対して生成された単一の抗体ターゲット(すなわち、IgGまたはIgM)について、報告用のPE標識抗アイソタイプ抗体を使用して、ヒト血清サンプルで両方の抗体クラスを独立して評価しました。IgGとIgMの両方の免疫反応性を同時に分析するデュアルレポーターアッセイでは、ボレリア抗原特異的IgG検出では、ビオチン化抗ヒトIgG + BV421標識ストレプトアビジン(青色蛍光)レポーター系を使用し、IgM検出用のPE標識レポーター(オレンジ色蛍光)を保持しました。デュアルレポーターアッセイのワークフローはシングルレポーターアッセイと似ていますが、セカンドチャンネル蛍光検出試薬BV421-ストレプトアビジンとの30分間の検出システムインキュベーションが追加されています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65323/65323fig01.jpg"> 図1:シングルレポーターおよびデュアルレポータービーズベースの ボレリア アッセイの概略図。 (A)シングルレポーター装置を使用して、抗ボレリア IgGまたはIgMのいずれかを個別に特徴付けるビーズベースのアッセイを開発し、最初に検証しました。任意のボ レリア 抗原をビーズに結合させ、血清サンプル中に存在するIgGまたはIgMのいずれかを捕捉および定量するために使用できます。特定の抗原に対するIgGとIgMの両方の反応性を評価するには、2つの別々のイムノアッセイが必要です。(B)デュアルレポーターシステムにより、同じウェル内の個々の ボレリア 抗原に対するIgG抗体とIgM抗体の両方の血清サンプルを同時に分析することができました。このアプローチでは、抗ボレリア IgMを標的とする同じPE標識検出抗体を使用しますが、PEベースのシステムからのIgG検出を、ビオチン化一次検出抗体とBV421標識ストレプトアビジン(「青色」エミッター)の使用に置き換え、30分間の追加検出システムインキュベーションステップが必要です。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65323/65323fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
アッセイ内精度 3つの代表的な ボレリア 抗原のスピアマン相関解析(図2)により、ヒト血清中に存在する抗ボレリア 抗体を検出した場合、MFI値の均一な再現性が実証されました。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65323/65323fig02.jpg"> 図2:アッセイ内 デュアルレポータービーズベースの ボレリア アッセイの精度。 Spearmanの相関解析では、PE検出システムを使用して ボレリア特異的IgM抗体(A)を検出し、BV421検出システムを使用して ボレリア 特異的IgG抗体(B、C)を検出した場合、デュアルレポーターアッセイのアッセイ内精度が高いことが示されました。合計 21 の血清サンプルを、半自動手順を使用して重複して分析しました。各グラフでは、MFI信号を互いにプロットし、線形回帰によって分析しました。赤い破線で示された線形曲線(x=y)は、検出システムのMFI信号が同一であることを示します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65323/65323fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
アッセイ間の精度 アッセイ間の良好な再現性は、デュアルレポーターアッセイで観察されました。Levey-Jenningsチャート(図3)は、7回の独立した分析で測定された品質管理サンプルのMFI値で、すべての代表的な抗原について高いアッセイ間精度を示しました。代表的な 4つのボレリア 抗原の平均変動率(CV%=標準偏差/平均×100)は5.3%でした。
希釈直線性 従来のシングルレポーターアッセイと新しいデュアルレポーターアッセイでは、異なるフローサイトメトリープラットフォームを使用しているため、同じ抗原イムノアッセイの蛍光出力の中央値を2台のフローサイトメトリー装置間で比較しました(図4)。サンプル希釈シリーズは、IgM と IgG の両方の評価に線形希釈曲線を提供し、評価された希釈範囲全体(1:100-1:12,800)にわたって装置間の用量反応の良好な平行性を示しました。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65323/65323fig03.jpg"> 図3:デュアルレポータービーズベースの ボレリア アッセイのアッセイ間精度。 アッセイ間の精度を評価するために、品質管理サンプルの ボレリア特異的IgM(A)およびIgG(B-D)抗体レスポンスを、毎回重複したウェルで7回独立して分析しました。アッセイは手作業で行いました。MFI値はLevey-Jenningsチャートにプロットされました。緑の線は、すべての値の平均を示します。2本の赤い破線は、アッセイ間精度の許容範囲を示しています。これは、標準偏差(2.5 S.D.)の2.5倍±平均値から計算されました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65323/65323fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65323/65323fig04.jpg"> 図4:デュアルレポータービーズベースの ボレリア アッセイの希釈直線性。 サンプル希釈倍率を 100 倍から 12,800 倍にした場合、IgM 検出(A)と IgG 検出(B)の希釈曲線は、シングルレポーター装置とデュアルレポーター装置で手動で行った場合と同様でした。テストしたすべての希釈率で、MFI 値は、シングルレポーター装置(赤色の記号)を使用した場合、デュアルレポーター装置(青色の記号)よりもわずかに高かった。2 つの代表的な抗原の希釈曲線を示しており、各希釈点は、標準偏差(SD *)で示す三重ウェルの平均測定値を表しています。注: この縮尺では、小型の SD は表示されません。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65323/65323fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
補足資料。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65323/Supplementary_FIle_Buffer_Compositions.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

3チャンネルデュアルレポーター蛍光フロー分析システムを使用して、ヨーロッパおよび北米でライムボレリア症を引き起こす異なる ボレリア 種の複数の抗原に対して誘発されたIgGおよびIgMの血清サンプルを同時に評価するビーズベースのマルチプレックスイムノアッセイを開発しました。

To monitor the progression of infectious diseases, it is useful to assess immunoreactivity against various antigenic determinants, and measure different ...

ライムボレリア症の診断は、数年にわたる研究調査にもかかわらず、依然として最適ではなく、感度に欠けています。デュアルレポーターマルチプレックスボレリアアッセイにより、さまざまなボレリア種に対する免疫反応性を同定し、患者サンプル中の早期IgMおよびその後のより耐久性のあるIgG免疫反応性を識別することができます。デュアルレポーターシステムと組み合わせた多重化機能を備えたLuminexのIntelliflex機器は、少量のドナー材料を使用して情報出力を最大化する最先端の技術の1つです。デュアルレポーターイムノアッセイアプローチは、ヒト血清サンプル中に実装されたボレリア抗原のいずれかに対してIgG抗体とIgM抗体の両方を同時に検出することにより、従来のイムノアッセイを改善します。このようにして、1回のアッセイランで貴重なサンプル材料から抽出できる情報を2倍にすることができます。私たちのアプローチは、決定的なボレリア病原体の同定と、感染の初期段階と後期のより耐久性のある免疫反応性の高感度検出を同時に提供します。これにより、コスト、材料、時間の効率が向上し、ライムボレリア症感染をより正確に検出することができます。当社のアッセイは、地域の種の分布と感染源を特定する際のグローバルな血清サーベイランスと病原体除去戦略をサポートします。私たちの研究室では、ワクチンと感染の免疫応答の血清学的分化と深部免疫応答の特性評価に特に焦点を当てて、いくつかのウイルス病原体に対する予防的および治療的ワクチンの開発に携わっています。

simultaneous-detection-different-antibody-classes-multiplexed

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

我々は、オリゴヌクレオチド結合蛍光ビーズを用いて試料内の微生物の検出のための多重方法を説明します。サンプル内のすべての生物からのアンプリコンは、プローブ結合ビーズのパネルにハイブリダイズさせる。ルミネックスまたはバイオプレックス機器は、ビーズタイプとハイブリダイゼーションシグナルのための各ビーズを照会するために使用されます。...

オリゴヌクレオチド結合蛍光マイクロスフェアを使用して複雑な臨床及び環境試料中の細菌の多重検出

ルミネックス社のXMAPのミクロスフィア技術を使用して、我々は様々な実験動物種のserosurveillanceの多重蛍光イムノアッセイ（MFIA）を開発しました。 MFIAは、抗原、組織制御や免疫グロブリンが共有結合し、色分けされたポリスチレン微小球にリンクされているサスペンションマイクロアレイである。...

多重化された蛍光イムノアッセイテスト方法とトラブルシューティング

ELISAは、簡単にルミネックスXMAPアッセイに変換することができると、多重化の利点を介して、いくつかの抗体は、アッセイのコストを削減しながら、増加した感度とダイナミックレンジの結果、最適な抗体のペアを識別するために同時にスクリーニングすることができる。...

多重抗体スクリーニング法を用いたLuminex XMAPアッセイへの捕捉ELISAの変換

このビデオでは、蛍光磁気ビーズまたはマイクロスフェアを異なる抗原と組み合わせて使用し、血清サンプル中のさまざまな抗体アイソタイプを同時に検出するイムノアッセイ技術について説明しています。このアッセイは、感染中またはワクチン接種後のセロコンバージョンを理解するのに役立ちます。...

Multianalyte Immunobead Assay:ヒト血清サンプル中の複数の抗体サブタイプを同時に検出するためのフローベースのイムノアッセイ技術

現在の資源不足の状況では、研究者がより安価に、より速く、より正確に研究を行うことを可能にする新しい技術が出現しています。ここでは、複数の環境病原体へのヒトの曝露を同時に測定するためのビーズベースの唾液抗体マルチプレックス免疫測定法の開発について説明します。...

環境病原体に対するヒトの暴露を測定するために唾液抗体マルチプレックスイムノアッセイの開発

ここでは、ヒトとマウスの血清IgGとIgMの自己抗体を同時に検出するために使用できるカスタマイズ可能な抗原マイクロアレイを生成する方法について説明します。これらのアレイにより、目的の抗原やエピトープに対する抗体をハイスループットかつ定量的に検出することができます。...

IgGおよびIgM自己抗体の同時検出のための二色抗原マイクロアレイの生成

現在では、複雑なサンプル準備と高価な計測器が必要し、低リソース環境では使用しにくいジカ、チクングニア ウイルスおよびデング...

多重等温増幅ベース ジカ、チクングニア ウイルスおよびデング熱 1 を検出する診断プラットフォーム

SARS-CoV-2の中和IgGおよびIgM抗体を同時に測定できる多重血清および抗体中和アッセイの開発には、2レポーターの読み出しを提供するビーズベースの多重化アッセイのフロー分析システムが使用されました。...

多重化ビードベースの流れ分析システムのための高速多重デュアルレポーターIgGおよびIgM SARS-CoV-2中和アッセイ

この記事では、SARS-CoV-2感染またはワクチン接種に対する免疫応答から生じる2つの免疫グロブリンアイソタイプ(IgA、IgM、またはIgGのいずれか)の抗体価の動的変化を同時にモニタリングするための便利な方法について説明します。この「マルチアナライトCovid-19免疫応答パネル」は、「デュアルチャネル」機能を備えたフローベースのマルチプレックスリーダーを使用して読み取られるコード化されたミクロスフェア上に構築された3つの間接イムノアッセイを採用しています。...

Covid-19の多検体免疫ビーズアッセイを使用した血清変換の動的モニタリング

多重バーコード画像解析により、最近、腫瘍微小環境の特性評価が改善され、細胞組成、機能状態、および細胞間相互作用の包括的な研究が可能になりました。本明細書では、高次元画像解析技術の使用を可能にする、オリゴヌクレオチド結合抗体およびサイクルイメージングのバーコードを用いた染色およびイメージングプロトコルについて説明する。...

パラフィン組織サンプルの単一細胞分析における免疫プロファイリングと空間マッピングの特性評価のための多重バーコード画像解析(英語)

マルチプレックス蛍光免疫測定法は、血清学的検査の基準になりつつあります。ただし、それらのアプリケーションは、複雑さと時間のかかるビーズ分析種カップリングプロセスによって制限されます。このレポートは、結果を得るまでの時間を大幅に短縮しながら、標準的な方法に匹敵する、半自動で再現性のあるマルチプレックスマイクロスフィアビーズカップリングプロトコルを提示します。...

アルボウイルスに対する抗体応答の検出のためのマルチプレックス血清学的アッセイ

学ぶ デュアルレポーター多重免疫アッセイを用いたライム病のIgG・IgM抗体同時検出法。少量の血清サンプルから複数のボレリア抗原に対する免疫応答を高感度に解析し、早期感染と持続性免疫応答の識別を可能にします。

マルチプレックス血清学的検査における異なる抗体クラスの同時検出(英語)

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