Name: シングルセル分解能でのエピゲノムおよび遺伝子発現プロファイリングのためのマウス心臓前駆細胞からの核分離(英語) (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: 学ぶマウス心臓前駆細胞からの核分離法。シングルセル分解能でエピゲノムと遺伝子発現をプロファイリングし、心臓発生と先天性心疾患の細胞異質性を解明する。凍結サンプルから高品質な核を単離する手法です。

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本研究は、ERA-CVD-2019およびANR-JCJC-2020からSSの支援を受けて行われました。貴重なコメントを提供してくれたU 1251 /Marseille Medical Geneticsラボのゲノミクスおよびバイオインフォマティクスファシリティ(GBiM)と匿名のレビューアに感謝します。

この研究で採用された動物の手順は、エクスマルセイユ大学の動物倫理委員会(C2EA-14)によって承認され、指定された動物実験のための国家倫理委員会によって承認されたプロトコルに従って実施されました。認可アパフィスN°33927-2021111715507212)。
1.解剖前の時限交配の設定
<ol><li>マウス胚を作製するには、心臓領域単離の9.5日前に成体マウス間で時限交配を行う。この手順では、生後2〜6か月の野生型C57BL/6Jマウスを使用し、一晩で時限交配を行いました。</li>
	<li>翌朝、雌のマウスに膣栓があるかどうかを確認します。プラグが胎児の日(E)0.5として識別された日を考えてみましょう。</li>
</ol>2.組織調製と細胞分離
<ol><li>妊娠後9.5日目に生後2〜6か月の妊娠中の女性C57BL / 6JをCO2を介して安楽死させ、濃度を上げてから子宮頸部脱臼を行います。腹部の下部を70%エタノールできれいにします。 注:子宮頸部脱臼の前に麻酔薬を使用することは、その後のトランスクリプトームおよびエピゲノム研究に影響を与える可能性のある環境変化に胚をさらすため、推奨されません。</li>
	<li>腹部と腹膜をハサミで開きます。子宮角を視覚化し、鉗子を使用して両方の角を切除します。</li>
	<li>1%FBSを含む冷たい完全培地を含むペトリ皿に角を置きます。特定の容量は必要ありませんが、胚が培地に完全に浸されるように注意する必要があります。10cmのペトリ皿あたり約10mLの容量が適切です。</li>
	<li>倍率5倍に設定した実体顕微鏡下で、鉗子を使用して、各胚から子宮内膜組織、胎盤、および卵黄嚢を取り除きます。</li>
	<li>胚を1%FBSを含む冷たい完全培地を含むペトリ皿に入れる。胚性心臓領域を、 図1に例示した概略胚に記載されるように、低温完全培地中で解剖する。</li>
	<li>5匹のマウス胚から解剖した心臓領域を1.5 mLの微量遠心チューブにまとめてプールします。スイングバケット遠心分離機を4°Cにプレチルします。</li>
	<li>スイングバケット遠心分離機でRTで1分間、300x g で遠心分離します。上清を除去し、組織培養グレードのPBSを1 mL加えて組織を洗浄します。</li>
	<li>300 x g でRTで1分間遠心分離し、上清を取り除き、洗浄手順を繰り返して合計2回の洗浄を行います。洗浄を2回繰り返し、PBSを0.05%トリプシン/ EDTA(1x)に置き換えます。</li>
	<li>組織消化のために、50 μLの0.25%トリプシン/EDTAを37°Cで10分間加えます。 ワイドオリフィスフィルターチップを使用した上下のジェスチャーにより、5分後に穏やかな機械的解離を適用します。</li>
	<li>トリプシン消化活性を不活性化するには、解離した細胞に350 μLの完全培地を添加します。再懸濁した細胞を40 μmの細胞ストレーナーに通します。</li>
</ol>3.細胞カウントと生存率評価
注:細胞数と生存率は、単一細胞実験の成功にとって重要なパラメータです。snATAC-seqアプローチは、細胞数のわずかな変動に敏感です。細胞が少なすぎるとクロマチンが過剰に消化され、リード数が多くなり、アクセスできないクロマチン領域(ノイズ)がマッピングされます。同様に、細胞が多すぎると、配列決定が困難な高分子量の断片が生成されます。細胞および核濃度を正確に決定するために、細胞数および生存率を2つの異なる方法で評価した。
<ol><li>以下に説明するように、細胞計数のためのトリパンブルーアッセイを実行します。<ol><li>0.4%トリパンブルー染色溶液をボルテックスし、室温2,000 x gで10秒間スピンし、10 μLをマイクロチューブに移します。</li>
		<li>ピペットを使用して細胞懸濁液を混合し、すでに分注された10 μLのトリパンブルー溶液に10 μLの懸濁液を加えます。ピペットで10回慎重に混合します。</li>
		<li>染色した細胞10 μLをカウントスライドに移します。スライドをカウンターに入れると、細胞濃度と生存率が自動的に計算されます。</li>
	</ol></li>
	<li>以下に説明するように、蛍光ベースの死亡率評価を実行します。 注:このアッセイは、細胞生存率を評価するための蛍光色素(エチジウムホモ二量体-1、EthD-1、およびカルセインAM)の使用に基づいています。市販のキットを使用し、適切な準備と使用のためにプロバイダーの指示に従っていました。<ol><li>付属の2 mM EthD-1ストック溶液5 μLを滅菌組織培養グレードD-PBS1 mLに加え、5秒間ボルテックスして完全に混合することにより、10 μM EthD-1溶液を調製します。</li>
		<li>付属の4 mMカルセインAMストック溶液2.5 μLを、すでに調製したEthD-1溶液に移します。完全な混合を確実にするために5秒間ボルテックス。</li>
		<li>得られた10 μM EthD-1および10 μMカルセインAM作業溶液10 μLを10 μLの細胞懸濁液に加えます。 注:カルセインは水溶液中での加水分解の影響を非常に受けやすいため、この作業溶液を1日以内に使用してください。</li>
		<li>染色した細胞10 μLをカウントスライドに移します。スライドを自動蛍光セルカウンターに挿入します。GFPフィルターを使用して生細胞をカウントし、RFPフィルターを使用して死細胞をカウントします。 注:2つの計数法は同様の細胞数と生存率を与え、新たに解離した細胞の総数は、胚性心臓領域(0.06 mm3)あたり平均約20,000細胞と推定されました。</li>
	</ol></li>
</ol>4.細胞凍結
<ol><li>細胞懸濁液を500 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 チューブの底に触れずに上清を注意深く取り除き、ペレットを1 mLの冷やした凍結培地に再懸濁します。</li>
	<li>細胞懸濁液を予冷したクライオバイアルに移し、クライオバイアルを予冷した凍結容器に入れます。</li>
	<li>容器を-80 °Cで4時間から8時間置きます。クライオバイアルを液体窒素に移して、下流の単核RNAおよびATACシーケンシング実験を行います。 注意: クライオバイアルは、使用前にドライアイスで輸送する必要があります。私たちの経験では、細胞は細胞生存率を失うことなく、少なくとも6か月間液体窒素に保存することができます。氷晶の形成を防ぐために、保管温度は常に-150°C未満に保つ必要があります。</li>
</ol>5.細胞の融解と死細胞の除去
<ol><li>クライオバイアルを37°Cの水浴に1〜2分間入れます。小さな結晶がクライオバイアルに残っているときにそれを取り除きます。</li>
	<li>予熱した(37°C)完全培地を1 mL加えます。ピペットで3回混ぜます。懸濁液を、10 mLの温かい完全培地を含む15 mLのコニカルチューブに移します。</li>
	<li>細胞懸濁液全体を30 μmのストレーナーに通します。ストレーナーを1〜2 mLの温かい完全培地ですすぎ、フロースルーを同じ円錐形のチューブに集めます。</li>
	<li>300 x g で5分間遠心分離し、上清を除去します。PBSで1回洗浄し、細胞懸濁液を1.5 mLマイクロチューブに移します。</li>
	<li>300 x g で5分間遠心分離し、細胞ペレットを破壊することなく上清を除去します。</li>
	<li>付属の磁気マイクロビーズ100 μLをペレットセルに加え、ワイドボアピペットチップを使用して5回ホモジナイズします。RTで15分間インキュベートします。</li>
	<li>その間に、磁気分離カラム(容量:1 x 107 〜2 x 108 セル)を500 μLの1x結合バッファーですすいでください。</li>
	<li>インキュベーションが完了したら、マイクロビーズを含む細胞懸濁液を500 μLの1x結合バッファーで希釈します。</li>
	<li>細胞懸濁液(0.6 μL)を調製した磁気分離カラムに塗布します。フロースルーは負に選択された生細胞画分であり、磁気的に保持された画分は正に選択された死細胞です。</li>
	<li>生細胞流出液を15 mL遠沈管に回収します。細胞懸濁液とカラムが入っていた1.5 mLマイクロチューブを2 mLの1x結合バッファーですすぎ、同じ15 mLチューブに流出液を回収します。</li>
	<li>300 x g で5分間遠心分離します。細胞ペレットを乱すことなく上清を除去する。</li>
	<li>PBS-BSA溶液を1 mL加え、ワイドオリフィスピペットチップを使用して5回ピペッティングして穏やかに混合します。細胞懸濁液を1.5 mLマイクロチューブに移します。</li>
	<li>300 x g で5分間遠心分離します。細胞ペレットを乱すことなく上清を除去する。</li>
	<li>1 mLのPBS-BSAを加えてペレットを再懸濁し、洗浄ステップを繰り返して合計2回の洗浄を行います。</li>
	<li>細胞を100 μLのPBS-BSA溶液に再懸濁します。10回ピペッティングして穏やかに混合します。</li>
	<li>前述の方法を用いて細胞の濃度および生存率を決定する(ステップ3.1およびステップ3.2)。次の手順に進むには、セル数が ≥100,000 であることを確認します。代表的な結果については 、図2 を参照してください。 注:凍結保存は、生細胞の最初の出発物質の約40%の損失をもたらします。開始細胞数に応じて、磁気カラム上でビーズを分離すると細胞生存率が高くなりますが、細胞の総数は2倍から5倍に分割されます。死細胞を除去するためのカラムベースの磁気キットの利用は、十分な出発物質が利用可能な場合にのみ推奨されます。</li>
</ol>6. 核の分離
注:snATACとsnRNA-seqの組み合わせは、清潔で無傷の核の懸濁液で行われます。使用する細胞タイプの溶解条件(溶解時間とNP40濃度)の最適化が推奨されます。最適な溶解時点と界面活性剤濃度は、核形態を乱すことなく溶解される細胞の最大数をもたらすものです。細胞/核の損失は、固定角度遠心分離機の代わりにスイングバケット遠心分離機を使用することで減らすことができます。プラスチックの核保持を最小限に抑えるために、低保持ピペットチップと遠心チューブを使用することをお勧めします。これにより、核の回収率を高めることができます。ピペットチップと遠心チューブを5%BSAでコーティングすることは、より安価ですが、より時間のかかる代替手段です。
<ol><li>作業場所と材料を70%エタノールとRNase除去溶液で洗浄します。</li>
	<li>スイングバケット遠心分離機を4°Cにプレチルします。 溶解バッファー、溶解希釈バッファー、0.1x 溶解バッファー、および洗浄バッファーを新たに調製します( 表1を参照)。氷上でバッファーを維持します。</li>
	<li>細胞懸濁液をスイングバケット遠心分離機で4°Cで500 x g で5分間遠心分離します。細胞ペレットが外れないように、チューブの底に触れずにすべての上清をそっと取り除きます。</li>
	<li>100 μLの冷却0.1x溶解バッファーを加えます。ピペッティングで10回穏やかに混ぜます。氷上で5分間インキュベートします。</li>
	<li>冷やした洗浄バッファー1 mLを加え、ピペッティングで5回穏やかに混ぜます。500 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 核ペレットを乱すことなく上清を除去する。</li>
	<li>冷やした洗浄バッファーで洗浄を繰り返し、合計3回の洗浄を行います。希釈した核緩衝液を調製する。再懸濁後、核ストック溶液を氷上に置いておきます。</li>
</ol>7. 単離核の質と量の評価
注:初期細胞数に基づいて、細胞溶解中の核損失の約50%を推定し、適切な数の細胞を冷希釈核バッファーに再懸濁します。冷却希釈核バッファーによる再懸濁量の計算は、ターゲット核回収率と、メーカーのユーザーガイドが推奨する対応する核ストック濃度に基づいています。この計算の例については、 補足プロトコル 1 を参照してください。
<ol><li>初期細胞数に基づいて、細胞溶解中の核損失の約50%を推定し、適切な数の細胞を冷希釈核バッファーに再懸濁します。</li>
	<li>実際の核濃度を決定します。2 μLの核ストック溶液を8 μLの希釈核バッファーと混合し、事前に分注した10 μLのトリパンブルーまたはEthD-1/calceinAM作業溶液に加えます。自動セルカウンターを使用して核をカウントします。細胞の5%未満が生存可能であるはずです。代表的な結果については 、図3 を参照してください。</li>
	<li>核ストックの容量と希釈された核バッファーの容量を計算して、転位反応の推奨濃度で5 μLの総容量を取得します(メーカーのユーザーガイドを参照)。直ちにユーザガイド17に従って転置反応に進む。 注:転位反応からATACおよびGEXライブラリの構築までのすべてのステップは、snRNA-seqおよびsnATAC-seqの組み合わせ17に使用したキットのユーザーガイドに従って実行されました。</li>
</ol>8. snRNA-seqおよびsnATAC-seqライブラリの品質解析
<ol><li>次世代シーケンシングに進む前に、最終的なsnATAC-seqおよび遺伝子発現GEXライブラリの品質とサイズ分布を検証してください。フラグメント解析システムを使用して、ライブラリで同定された配列の質と量を評価します。代表的な品質評価結果については 、図4 を参照してください。 注:snATAC-seqライブラリの最終的なトレースは、ヌクレオソーム巻上げの周期性を示す必要があり、サイズは200 bpから数Kbpの範囲である必要がありますが、遺伝子発現ライブラリのサイズは300 bpから600 bpの範囲である必要があります。</li>
</ol>

マウス心臓前駆細胞からの単一細胞分解能での核単離

<ol><li>vander Bom, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+changing+epidemiology+of+congenital+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cardiology%22%5BJournal%5D)">The changing epidemiology of congenital heart disease.</a> Nature Reviews. Cardiology. 8 (1), 50-60 (2011).</li>
<li>Bouma, B. J., Mulder, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changing+landscape+of+congenital+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Changing landscape of congenital heart disease.</a> Circulation Research. 120 (6), 908-922 (2017).</li>
<li>Postma, A. V., Bezzina, C. R., Christoffels, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+congenital+heart+disease%3A+The+contribution+of+the+noncoding+regulatory+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetics of congenital heart disease: The contribution of the noncoding regulatory genome.</a> Journal of Human Genetics. 61 (1), 13-19 (2016).</li>
<li>Buijtendijk, M. F. J., Barnett, P., vanden Hoff, M. J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+human+heart%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Medical+Genetics.+Part+C%2C+Seminars+in+Medical+Genetics%22%5BJournal%5D)">Development of the human heart.</a> American Journal of Medical Genetics. Part C, Seminars in Medical Genetics. 184 (1), 7-22 (2020).</li>
<li>Sylva, M., vanden Hoff, M. J., Moorman, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+human+heart%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Medical+Genetics.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Development of the human heart.</a> American Journal of Medical Genetics. Part A. 164 (6), 1347-1371 (2014).</li>
<li>Gromova, T., Gehred, N. D., Vondriska, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomes+in+the+heart%3A+When+every+epigenome+counts%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomes in the heart: When every epigenome counts.</a> Cardiovascular Research. 119 (1), 64-78 (2022).</li>
<li>Tanay, A., Regev, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaling+single-cell+genomics+from+phenomenology+to+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Scaling single-cell genomics from phenomenology to mechanism.</a> Nature. 541 (7637), 331-338 (2017).</li>
<li>Schwartzman, O., Tanay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+epigenomics%3A+Techniques+and+emerging+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Single-cell epigenomics: Techniques and emerging applications.</a> Nature Reviews. Genetics. 16 (12), 716-726 (2015).</li>
<li>Macaulay, I. C., Ponting, C. P., Voet, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+multiomics%3A+Multiple+measurements+from+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Single-cell multiomics: Multiple measurements from single cells.</a> Trends in Genetics. 33 (2), 155-168 (2017).</li>
<li>Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATAC-seq%3A+A+method+for+assaying+chromatin+accessibility+genome-wide%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 109, 1-9 (2015).</li>
<li>Stefanovic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hox-dependent+coordination+of+mouse+cardiac+progenitor+cell+patterning+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Hox-dependent coordination of mouse cardiac progenitor cell patterning and differentiation.</a> Elife. 9, e55124(2020).</li>
<li>Xu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+plate-based+single-cell+ATAC-seq+workflow+for+fast+and+robust+profiling+of+chromatin+accessibility%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A plate-based single-cell ATAC-seq workflow for fast and robust profiling of chromatin accessibility.</a> Nature Protocols. 16 (8), 4084-4107 (2021).</li>
<li>Buenrostro, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+chromatin+accessibility+reveals+principles+of+regulatory+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation.</a> Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).</li>
<li>Denisenko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+assessment+of+tissue+dissociation+and+storage+biases+in+single-cell+and+single-nucleus+RNA-seq+workflows%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows.</a> Genome Biology. 21 (1), 130(2020).</li>
<li>Safabakhsh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+nuclei+from+frozen+human+heart+tissue+for+single-nucleus+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolating nuclei from frozen human heart tissue for single-nucleus RNA sequencing.</a> Current Protocols. 2 (7), e480(2022).</li>
<li>Pimpalwar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+isolation+and+transcriptional+profiling+of+individual+cells+from+the+human+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Heliyon%22%5BJournal%5D)">Methods for isolation and transcriptional profiling of individual cells from the human heart.</a> Heliyon. 6 (12), 05810(2020).</li>
<li>10x Genomics. Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Kits User Guide. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%2210x+Genomics%22">10x Genomics</a>. , CG000338_ChromiumNextGEM_Multiome_ATAC_GEX_User_Guide_RevF.pdf (2022).</li>
<li>Jia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+RNA-seq+and+ATAC-seq+analysis+of+cardiac+progenitor+cell+transition+states+and+lineage+settlement%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Single cell RNA-seq and ATAC-seq analysis of cardiac progenitor cell transition states and lineage settlement.</a> Nature Communications. 9 (1), 4877(2018).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+dual-omics+reveals+the+transcriptomic+and+epigenomic+diversity+of+cardiac+non-myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Single-cell dual-omics reveals the transcriptomic and epigenomic diversity of cardiac non-myocytes.</a> Cardiovascular Research. 118 (6), 1548-1563 (2022).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type-specific+gene+regulatory+networks+underlying+murine+neonatal+heart+regeneration+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Cell-type-specific gene regulatory networks underlying murine neonatal heart regeneration at single-cell resolution.</a> Cell Reports. 35 (8), 109211(2021).</li>
<li>Ameen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+single-cell+analysis+of+cardiogenesis+identifies+developmental+trajectories+and+non-coding+mutations+in+congenital+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Integrative single-cell analysis of cardiogenesis identifies developmental trajectories and non-coding mutations in congenital heart disease.</a> Cell. 185 (26), 4937-4953 (2022).</li>
<li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pioneering+function+of+Isl1+in+the+epigenetic+control+of+cardiomyocyte+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Pioneering function of Isl1 in the epigenetic control of cardiomyocyte cell fate.</a> Cell Research. 29 (6), 486-501 (2019).</li>
<li>Manivannan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomic+profiling+unveils+dysregulation+of+cardiac+progenitor+cells+and+cardiomyocytes+in+a+mouse+model+of+maternal+hyperglycemia%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomic profiling unveils dysregulation of cardiac progenitor cells and cardiomyocytes in a mouse model of maternal hyperglycemia.</a> Communications Biology. 5 (1), 820(2022).</li>
<li>Cao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+analysis+of+multimodal+single-cell+data+with+structural+similarity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Integrated analysis of multimodal single-cell data with structural similarity.</a> Nucleic Acids Research. 50 (21), e121(2022).</li>
<li>What is CellRanger. 10x Genomics. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger</a> (2023).</li>
<li>Hill, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+multi-omic+characterization+of+congenital+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Integrated multi-omic characterization of congenital heart disease.</a> Nature. 608 (7921), 181-191 (2022).</li>
<li>Chen, Z., Wei, L., Duru, F., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing%3A+In-depth+decoding+of+heart+biology+and+cardiovascular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Genomics%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing: In-depth decoding of heart biology and cardiovascular diseases.</a> Current Genomics. 21 (8), 585-601 (2020).</li>
<li>Machado, L., Relaix, F., Mourikis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+relief%3A+Emerging+methods+to+mitigate+dissociation-induced+artefacts%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Stress relief: Emerging methods to mitigate dissociation-induced artefacts.</a> Trends in Cell Biology. 31 (11), 888-897 (2021).</li>
<li>Tabula Muris, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomics+of+20+mouse+organs+creates+a+Tabula+Muris%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris.</a> Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).</li>
<li>Machado, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+damage+induces+a+conserved+stress+response+that+initiates+quiescent+muscle+stem+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation.</a> Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).</li>
<li>Haghverdi, L., Lun, A. T. L., Morgan, M. D., Marioni, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Batch+effects+in+single-cell+RNA-sequencing+data+are+corrected+by+matching+mutual+nearest+neighbors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Batch effects in single-cell RNA-sequencing data are corrected by matching mutual nearest neighbors.</a> Nature Biotechnology. 36 (5), 421-427 (2018).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SMNN%3A+Batch+effect+correction+for+single-cell+RNA-seq+data+via+supervised+mutual+nearest+neighbor+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">SMNN: Batch effect correction for single-cell RNA-seq data via supervised mutual nearest neighbor detection.</a> Briefings in Bioinformatics. 22 (3), 097(2021).</li>
<li>Stefanovic, S., Christoffels, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GATA-dependent+transcriptional+and+epigenetic+control+of+cardiac+lineage+specification+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">GATA-dependent transcriptional and epigenetic control of cardiac lineage specification and differentiation.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (20), 3871-3881 (2015).</li>
<li>Gunthel, M., Barnett, P., Christoffels, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development%2C+proliferation%2C+and+growth+of+the+mammalian+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Development, proliferation, and growth of the mammalian heart.</a> Molecular Therapy. 26 (7), 1599-1609 (2018).</li>
<li>Stefanovic, S., Etchevers, H. C., Zaffran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outflow+tract+formation-embryonic+origins+of+conotruncal+congenital+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Development+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Outflow tract formation-embryonic origins of conotruncal congenital heart disease.</a> Journal of Cardiovascular Development and Disease. 8 (4), 42(2021).</li>
<li>Hao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+analysis+of+multimodal+single-cell+data%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Integrated analysis of multimodal single-cell data.</a> Cell. 184 (13), 3573-3587 (2021).</li>
<li>Bai, H., Lin, M., Meng, Y., Bai, H., Cai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+CUT%26RUN+method+for+regulation+network+reconstruction+of+low+abundance+transcription+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Signalling%22%5BJournal%5D)">An improved CUT&RUN method for regulation network reconstruction of low abundance transcription factor.</a> Cellular Signalling. 96, 110361(2022).</li>
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著者は開示するものは何もありません。

snRNA-seqとsnATAC-seqを組み合わせた研究による発達中の心臓の細胞組成の分析は、先天性心疾患の起源のより深い理解を提供します26。いくつかの研究所は、snRNA-seq27に対する心臓組織の凍結保存の効果を研究しています。ヒト疾患のマウスモデルから得られた新鮮な微小解剖組織を用いてsnRNA-seqおよびsnATAC-seqを実施することは、異なる実験条件を比較する際にロジスティック的に困難な場合があります。開発の特定の段階では、サンプル処理によってもたらされる技術的なばらつきを減らすために、対照群と実験群を同じ実行で処理する必要があることが困難の1つです。新鮮な組織の処理が不可能な場合は、結果に基づいて、胚の心臓組織全体を急速凍結するのではなく、解離させてから凍結保存することをお勧めします。一方の方法を他方よりも選択することは、心臓組織が丸ごと凍結している場合、融解後に生存可能な単一細胞を単離することがはるかに困難であるという事実に基づいています。ただし、組織解離プロトコルが最適化されていない場合は、組織全体をスナップフリー...

先天性欠損症の中で、先天性心疾患(CHD)が最も一般的であり、毎年出生の約1%で発生します1,2。遺伝子変異は少数の症例でしか特定されておらず、遺伝子調節の異常などの他の原因がCHD 2,3の病因に関与していることを意味します。心臓の発生は、多様で相互作用する細胞型の複雑なプロセスであり、原因となる非コード変異と遺伝子制御への影響を特定することは困難です。心臓の器官形成は、心筋細胞、線維芽細胞、心外膜細胞、心内膜細胞など、さまざまなサブタイプの心臓細胞を生じさせる細胞前駆細胞から始まります4,5。シングルセルゲノミクスは、心臓の発達を研究し、健康と病気における細胞の不均一性の影響を評価するための重要な方法として浮上しています6。異なるパラメータの同時測定のためのマルチオミクス法の開発と計算パイプラインの拡大により、正常および病気の心臓における細胞タイプとサブタイプの発見が容易になりました6。本稿では、マウス胚から得られた凍結心臓前駆細胞について、下流のsnRNA-seqおよびsnATAC-seq(およびsnRNA-seqとsnATAC-seqの組み合わせ)と互換性のある信頼性の高い単核単細胞分離プロトコルについて説明します7,8,9。
ATAC-seqは、調節オープンクロマチン領域の同定とヌクレオソームの位置決めを可能にする堅牢な方法です10,11。この情報は、転写因子の位置、同一性、および活性に関する結論を引き出すために使用されます。リモデリング剤を含むクロマチン因子の活性、およびRNAポリメラーゼの転写活性は、クロマチン構造の定量的変化を測定するのに非常に感度が高いため、分析することができます1,2。したがって、ATAC-seqは、特定の細胞型における転写調節を制御するメカニズムを明らかにするための堅牢で公平なアプローチを提供します。ATAC-seqプロトコルは、単一細胞におけるクロマチンアクセシビリティを測定するためにも検証されており、細胞集団内のクロマチン構造のばらつきを明らかにしています10、12、13。
近年、単一細胞の分野で顕著な進歩がありましたが、主な困難は、これらの実験を実行するために必要な新鮮なサンプルの処理です14。この困難を回避するために、凍結心臓組織または細胞を用いてsnRNA-seqおよびsnATAC-seqなどの分析を行うことを目的として様々な試験が実施されてきた15,16。
シングルセルゲノミクスデータを解析するために、いくつかのプラットフォームが使用されてきた17。単一細胞遺伝子発現およびATACプロファイリングに広く使用されているプラットフォームは、複数のマイクロ流体液滴カプセル化のためのプラットフォームです17。これらのプラットフォームはマイクロ流体チャンバーを使用しているため、破片や凝集物がシステムを詰まらせ、データが使用できなくなる可能性があります。したがって、単一細胞研究の成功は、個々の細胞/核の正確な分離にかかっています。
ここで紹介するプロトコルは、snRNA-seqおよびsnATAC-seqを使用した最近の研究と同様のアプローチを使用して、先天性心疾患を理解しています18、19、20、21、22、23。この手順では、新たにマイクロ解剖された心臓組織の酵素解離とそれに続くマウス心臓前駆細胞の凍結保存を利用します。解凍後、生細胞は精製され、核分離のために処理されます。この研究では、このプロトコルを使用して、マウス心臓前駆細胞の同じ核製剤からsnRNA-seqおよびsnATAC-seqデータを取得することに成功しました。

<table><tbody><tr><td>2100 バイオアナライザー 機器</td><td>アジレント</td><td></td><td>カタログ番号なし</td></tr><tr><td>5M 塩化ナトリウム (NaCl)</td><td>Sigma</td><td>59222C-500ML&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BSAの10%&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A1595-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Chromium Next GEM Chip J シングルセルキット、16 rxns</td><td>10X Genomics</td><td>1000230</td><td></td></tr><tr><td>Chromium Next GEM シングルセルマルチオーム ATAC + 遺伝子発現試薬バンドル、4 rxns (Nuclei Buffer 20Xを含む)</td><td>10X Genomics</td><td>1000285</td><td></td></tr><tr><td>Countess cell counting chamber slides</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>Countess III FL</td><td>Thermofisher</td><td></td><td>カタログ番号なし</td></tr><tr><td>ジギトニン (5%)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>BN2006</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650-5x5ML</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind チューブ&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>Thermofisher</td><td>14190094</td><td>滅菌済みでRNaseフリー</td></tr><tr><td>のデュアルインデックスキット TT Set A 96 rxns</td><td>10X Genomics</td><td>1000215</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td></td><td></td>352096</tr><tr><td>Falcon 50 mL コニカル遠心チューブ&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td></td><td></td>10788561</tr><tr><td>HI-FBS</td><td>サーモフィッシャー</td><td>A3840001</td><td>熱不活性化</td></tr><tr><td>高感度 DNA キット</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Igepal CA-630</td><td>Sigma</td><td>I8896-50ML</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD 生存能力/細胞毒性キット</td><td>サーモフィッシャー</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>MACS 死細胞除去キット: 死細胞ロモバル MicroBeads, Binding Buffer 20X</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-101</td><td></td></tr><tr><td>MACS SmartStrainers(30 & マイクロ;m)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-458</td><td></td></tr>塩化<tr><td>マグネシウム(MgCl2)</td><td>Sigma</td><td>M1028-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Milieu McCoy 5A&nbsp;</td><td>サーモフィッシャー</td><td>16600082</td><td></td></tr><tr><td>MS カラム</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>NovaSeq 6000 S2</td><td>Illumina</td><td></td><td>カタログ番号なし</td></tr><tr><td>ペニシリン ストレプトマイシン (ペン/連鎖球菌)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>PluriStrainer Mini 40&micro;m</td><td>PluriSelect</td><td>V-PM15-2021-12</td><td></td></tr><tr><td>岩石阻害剤</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ALX-270-333-M005</td><td></td></tr><tr><td>シングルインデックスキット N Set A, 96 rxn</td><td>10X Genomics</td><td>1000212</td><td></td></tr><tr><td>Standard 90mm Petri dish Sterilin</td><td>Thermofisher</td><td>101R20</td><td></td></tr><tr><td>滅菌二重蒸留水</td><td>Thermofisher</td><td>R0582</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Hydrochlorideソリューション(HCl)</td><td>Sigma</td><td>T2194-100ML&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルーステイン(0.4%)</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td></td></tr>トリ<tr><td>プシン0.05% - EDTA 1X</td><td>サーモフィッシャー</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>シグマ</td><td>P9416-50ML&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ワイドオリフィスフィルター付きピペットチップ200 &mu;l</td><td>Labcon</td><td>1152-965-008-9</td><td></td></tr><tr><td>ZEISS SteREO Discovery.V8</td><td>ZEISS</td><td></td><td>カタログ番号なし</td></tr></tbody></table>

シングルセル分解能でのエピゲノムおよび遺伝子発現プロファイリングのためのマウス心臓前駆細胞からの核分離(英語)

Nuclei Isolation from Mouse Cardiac Progenitor Cells for Epigenome and Gene Expression Profiling at Single-Cell Resolution

発達中の心臓は、複雑な調節機構によって制御される様々な前駆細胞を含む複雑な構造である。個々の細胞の遺伝子発現とクロマチン状態の検査は、細胞の種類と状態の識別を可能にします。シングルセルシーケンシングアプローチは、心臓前駆細胞の不均一性の多くの重要な特性を明らかにしました。ただし、これらの方法は一般に新鮮な組織に限定されており、技術的なばらつきを減らすために新鮮な組織を同じ実行で一度に処理する必要があるため、多様な実験条件での研究が制限されます。したがって、この分野では、一核RNAシーケンシング(snRNA-seq)や、ハイスループットシーケンシングを備えたトランスポザーゼアクセス可能なクロマチンの一核アッセイ(snATAC-seq)などの方法からデータを生成するための簡単で柔軟な手順が必要です。ここでは、後続の単一核デュアルオミクス(snRNA-seqとsnATAC-seqの組み合わせ)のために核を迅速に分離するためのプロトコルを紹介します。この方法は、心臓前駆細胞の凍結サンプルからの核の単離を可能にし、マイクロ流体チャンバーを使用するプラットフォームと組み合わせることができます。

シングルセルアプローチ用のシングルセル懸濁液の調製と比較して、単一核懸濁液の調製ははるかに困難であり、より高いレベルの分離と処理が必要です。snRNA-seqとsnATAC-seqの結合を成功させるための重要な要素は、クリーンで無傷の核懸濁液です。効率的な核分離のためのプロトコルは、各組織の種類と状態(新鮮または凍結)に適合させる必要があります。ここでは、凍結マウス胚性心臓細胞からの核の単離のために最適化されたプロトコルが記載されている。胚性心臓領域の解離と心臓細胞の解離から核の分離までのすべてのステップを 図1にまとめます。出発物質については、効率的な核単離のために、1 x 105-1 x 106 細胞の細胞数と細胞生存率&gt;70%が推奨されます。 図2に示すように、融解後に死細胞を選別して除去するためにこのプロトコルで実行される追加のステップにより、有意に高い細胞生存率を有するよりクリーンな細胞懸濁液を得ることができ、出発サンプルの品質が向上しました。核の分離に加えて...

ここでは、細胞核の調製を説明するプロトコルを提示します。心臓組織のマイクロ解剖および酵素的解離の後、前駆細胞を凍結し、続いて純粋な生細胞を単離し、単一核RNAシーケンシングおよびハイスループットシーケンシング分析によるトランスポゼーゼアクセス可能なクロマチンの単一核アッセイに使用しました。

The developing heart is a complex structure containing various progenitor cells controlled by complex regulatory mechanisms. The examination of the gene ...

このプロトコルの主な目的は、心臓の発達と先天性心疾患へのそれらの寄与の文脈における遺伝的要因と環境要因の相互作用を研究することです。一核RNA-seqや一核運動失調などの単核アプローチは、心臓の発達中の健康と病気における細胞の不均一性を研究するための重要な方法として浮上しています。これらの実験の制限ステップの1つは、すべてのサンプルを同時に実行する必要があることです。すべての実験条件で作業している間、すべての条件に対して同時に十分に新鮮な材料を収集することは困難な場合があります。近年、シングルセルの分野では大きな進歩がありましたが、主な困難は無料サンプルの処理です。困難を回避することは、先天性心疾患の欠陥の根底にある分子メカニズムを特定するために非常に有益です。このプロトコルでは、マウス胚から得られた凍結心筋細胞懸濁液から高品質の核を正常に単離するための手順について説明します。また、私たちのプロトコルは、下流の一核RNA-seqおよび一核運動失調と互換性があります。この手順が関心のある研究者に役立ち、この強力な方法を研究に使用することを奨励することを願っています。

nuclei-isolation-from-mouse-cardiac-progenitor-cells-for-epigenome

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

単一細胞の発現プロファイリングは、個々の細胞の詳細な遺伝子発現解析が可能になります。我々は心筋細胞の単離のための方法を説明し、特定のターゲットの全トランスクリプトームのマイクロアレイや定量PCRのどちらかの結果のライセートを調製した。...

成体マウスの心筋細胞の単一細胞転写プロファイリング

心臓核密度沈降を介して分離し、フローサイトメトリーにより心筋細胞核を識別し、ソートするための中心体周辺物質1（PCM-1）に対する抗体で免疫標識されています。...

事後組織から心筋細胞核の分離

ここでは、急速に下流の並列 RNA 配列のため新鮮なまたは冷凍組織から高品質の核を分離するためのプロトコルを提案する.我々...

並列の単核 RNA 配列のため大人の脊髄核の分離

単核単離は、細胞膜の解離および洗剤ベースの透過性、最適化を必要とし、技術的なアーティファクトを導入する傾向があるステップに依存しています。我々は、単核RNA-seq(snRNA-Seq)またはATAC-seqに適した核を得て、組織全体から直接無傷核を迅速に単離するための洗浄剤および酵素フリープロトコルを実証する。...

洗浄剤と酵素を含まない方法を用いた組織全体からの核分離

ここでは、髄質腎細胞タイプの表現を改善し、酵素組織解離による遺伝子発現アーティファクトを回避する凍結マウス腎臓から高品質の核を単離するためのプロトコルを提示します。...

単核RNAシーケンシングのための成体マウス腎臓からの核分離

我々は、1細胞オミクス実験を行うために、安定したまたは乱れた流動条件にさらされたマウス頸動脈の内腔から内皮細胞および核を単離する方法を提示する。...

シングルセルマルチオミクス実験のためのマウス頸動脈内腔からの内皮細胞の単離

このプロトコルは、マウス上頸部および星状神経節の解剖、細胞解離、凍結保存、核単離、ハッシュタグバーコーディングなど、単一核シーケンシングのための詳細で低入力のサンプル調製について説明しています。...

単一核RNAシーケンシングのためのマウス交感神経節のバーコード化抗体による低入力核単離および多重化

ここでは、一核RNA-seq、ATAC-seq、およびジョイントマルチオミクス(RNA-seqおよびATAC-seq)について、瞬間凍結されたアーカイブされた肝臓組織から核を単離するためのプロトコルを紹介します。...

シングルセルマルチオミクスのための瞬間凍結肝臓組織からの核の単離

単一細胞/単一核のトランスクリプトミクスおよびマルチオミクスの成功は、細胞/核の品質に大きく依存します。したがって、組織からの細胞/核の分離とその精製は高度に標準化されなければなりません。このプロトコルは下流の単一核のmultiomeの試金のための頭脳および骨髄からの核の準備を記述する。...

単一核マルチオームアッセイのための高品質脳および骨髄核調製(英語)

凍結保存された人工多能性幹細胞由来の間質/内皮および血液細胞タイプから高品質の核を抽出するためのプロトコルについて説明し、単一核の次世代シーケンシング解析をサポートします。高品質で無傷の原子核を作製することは、マルチオミクス実験にとって不可欠ですが、研究室によってはこの分野への参入障壁となることがあります。...

凍結保存されたIn Vitro由来血液細胞からの核分離

本研究は、組織切片の直接的な空間バーコードと単一細胞マルチオーム解析を組み合わせた空間的Trekker–CUT&amp;Tagマルチオームプロトコルを提示します。このアプローチにより、遺伝子発現とヒストンH3K27ac修飾の空間的に分解された単一細胞プロファイリングを同時に可能にし、組織微細解剖学の文脈における遺伝子調節に関する機構的洞察を提供します。...

凍結組織切片におけるトランスクリプトームおよびエピゲノム標的の空間的に分解された統合マルチオミクスプロファイリング

学ぶマウス心臓前駆細胞からの核分離法。シングルセル分解能でエピゲノムと遺伝子発現をプロファイリングし、心臓発生と先天性心疾患の細胞異質性を解明する。凍結サンプルから高品質な核を単離する手法です。

シングルセル分解能でのエピゲノムおよび遺伝子発現プロファイリングのためのマウス心臓前駆細胞からの核分離(英語)

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