Name: オルガネラ特異的色素を用いた カエノラブディティス・エレガンス および哺乳類細胞におけるマイトファジーの検出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-19T13:40:00.000+00:00
Duration: 11 min 59 s
Description: 学ぶマイトファジー検出法：蛍光色素キットを用いてCaenorhabditis elegansと哺乳類細胞でミトコンドリアの自己分解を定量化する革新的アプローチ。加齢や神経変性疾患の研究に有用です。

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原稿を批判的に読んでくださったグロス研究所のメンバーと、彼らのコメントとアドバイスに感謝します。我々は、国立衛生研究所研究基盤プログラム局(P40 OD010440)から資金提供を受けているカエノラブディティス遺伝学センター(CGC)に、いくつかの菌株を提供してくれたことに感謝する。この研究は、Vitalunga Ltdとイスラエル科学財団からの助成金(助成金番号989/19)によって支援されました。グラフィカルな抽象図(図1)は、BioRender.com で生成されました。

C. elegansおよび肝臓がん細胞株におけるマイトファジーの定量化

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</ol>

著者には、宣言する利益相反はありません。

複数のマイトファジー経路には、さまざまなタンパク質や生体分子(カルジオリピン29など)が含まれます。しかし、これらの経路のエンドポイントは類似しており、リソソーム酵素によるミトコンドリアの分解である12,13。実際、いくつかの方法でこのエンドポイントを使用してマイトファジーを定量化しています。ただし、電子顕微鏡などの一部の方法では、高価な機器、訓練を受けた専門家へのアクセス、および試料と分析の準備時間の延長が必要です。さらに、特定の組織/細胞/細胞内コンパートメントにおけるマイトファジーを測定することを含むマイトファジーバイオセンサを使用することの利点にもかかわらず、そのようなセンサの発現は、細胞21の生理機能を変化させることができる。したがって、正常な細胞生理学との長期的な干渉を必要とせずにマイトファジーを定量するための、信頼性が高く、費用効果が高く、迅速な方法が必要です。
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ミトコンドリアは、人間を含むすべての好気性動物にとって不可欠です。生体分子の化学エネルギーを酸化的リン酸化1によるアデノシン三リン酸(ATP)への変換、ヘム2の合成、β酸化3による脂肪酸の分解、カルシウム4と鉄5の恒常性を調節し、アポトーシス6による細胞死の制御、酸化還元恒常性に重要な役割を果たす活性酸素種(ROS)の生成7.新しいミトコンドリア成分の合成(生合成)と、ミトコンドリアのオートファジー(すなわちマイトファジー)による損傷成分の選択的除去という2つの相補的で反対のプロセスがミトコンドリアの完全性と適切な機能を維持します8。
いくつかのマイトファジー経路は、PINK1 /パーキンなどの酵素、およびFUNDC1、FKBP8、およびBNIP/NIX 9,10などの受容体によって媒介されます。特に、ミトコンドリア成分の選択的分解は、オートファゴソーム機構とは無関係に(すなわち、ミトコンドリア由来の小胞を介して)起こり得る11。しかし、異なる選択的マイトファジー経路のエンドポイントは類似している(すなわち、リソソーム酵素によるミトコンドリア分解)12,13。このため、マイトファジーを同定および測定するためのさまざまな方法は、ミトコンドリアマーカーとリソソームマーカーの共局在14,15,16,17、およびミトコンドリアタンパク質/ミトコンドリアDNAのレベルの低下に依存しています18。
以下は、蛍光顕微鏡を使用して動物細胞のマイトファジーを測定するための既存の実験方法論の簡潔な説明であり、マイトファジーエンドポイントフェーズを強調しています。
マイトファジーバイオセンサー ミトコンドリア分解は、リソソーム19の酸性環境内で起こる。したがって、タンパク質を含むミトコンドリア成分は、マイトファジープロセスのエンドポイントで中性pHから酸性pHへの移行を経験します。このパターンは、マイトロゼラ18 やタンデムmCherry-GFP-FIS114など、いくつかのマイトファジーバイオセンサーの作用機序を支えています。これらのセンサーには、pH感受性緑色蛍光タンパク質(GFP)とpH非感受性赤色蛍光タンパク質(RFP)が含まれています。したがって、マイトファジーのエンドポイントでは、GFP蛍光色素の消光により、緑から赤の蛍光比が大幅に低下します。これらのセンサーの主な制限は、(1)蛍光色素間のフェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)の可能性です。(2)GFPとRFPの成熟率の違い。(3)GFPとRFPとの間の解離が、それらを連結するポリペプチドのタンパク質分解的切断による;(4)蛍光-発光オーバーラップ;(5)蛍光色素の輝度と消光の差15、16。
これらの制限のいくつかを克服するセンサは、Keimaミトコンドリアセンサ17である。mt-Keimaセンサー(サンゴタンパク質Keima由来)は、単一の発光ピーク(620 nm)を表示します。しかしながら、その励起ピークはpH感受性である。その結果、高pHから酸性pH 16,17に移行すると、緑色の励起(440 nm)から赤色の励起(586 nm)に遷移します。より最近のマイトファジーセンサーであるMito-SRAIは、固定された生物学的サンプル20での測定を可能にすることにより、この分野を進歩させました。ただし、特定の組織/細胞でそれらを発現し、それらを異なるミトコンドリアコンパートメントに標的とする能力など、遺伝子センサーには多くの利点がありますが、それらには制限もあります。1つの制限は、遺伝子センサーを細胞または動物で発現させる必要があり、時間とリソースを大量に消費する可能性があることです。
さらに、ミトコンドリア内のセンサー自体の発現は、ミトコンドリアの機能に影響を与える可能性があります。例えば、ミトコンドリアGFP(mtGFP)を線虫体壁筋に発現させると、 ミ トコンドリアネットワーク21が拡大する。この表現型は、ミトコンドリア(UPRmt)における折り畳まれていないタンパク質応答の活性化に不可欠な役割を果たすストレス活性化転写因子ATFS-1の機能に依存します21。したがって、遺伝的にコードされたミトコンドリア/マイトファジーバイオセンサーは、 in vivoでのミトコンドリアの恒常性のモニタリングに非常に役立ちますが、測定するように設計されたプロセスそのものに影響を与える可能性があります。
ミトコンドリア/リソソーム特異的抗体および色素 ミトコンドリア/リソソーム共局在を試験するための別の戦略は、ミトコンドリア外膜タンパク質TOM20やリソソーム関連膜タンパク質1(LAMP1)22などのミトコンドリア/リソソームタンパク質に対する抗体を使用することです。ほとんどの場合、蛍光色素に結合した二次抗体は、顕微鏡 で 蛍光シグナルを検出するために使用されます。別の戦略は、細胞内でLAMP1::GFP融合コンストラクトを発現させながら、赤色のミトコンドリア色素(例えば、Mitotracker Red)16で染色するなど、遺伝子構築物をミトコンドリア/リソソーム色素と組み合わせることです。これらの方法論は効果的ですが、特異的抗体を必要とし、多くの場合、固定標本での作業や、蛍光標識されたミトコンドリア/リソソームを発現する細胞/トランスジェニック動物の生成が含まれます。
本稿では、合成ジアミンO,O(オクタン-1,8-ジイル)ビス(ヒドロキシルアミン)(以下VL-85023と呼ぶ)のマイトファジー活性化特性を評価するための市販のリソソーム/ミトコンドリア/核染色キットの利用について、C.エレガンス線虫およびヒトがん細胞株Hep-3Bにおいて概説する(図1)。染色キットには、これらの細胞小器官を特異的に染色するリソソーム/ミトコンドリア/核標的色素の混合物が含まれています23。我々は以前、このキットを用いて、C. elegans23における1,8-ジアミノオクタン(以下、VL-004)のマイトファジー活性を実証した。重要なことに、ミト・ロゼラバイオセンサーとミトコンドリア:核DNA含有量のqPCR測定で染色キットの結果を検証しました23。この染色キットには、次のような利点があります。第1に、ミトコンドリアバイオセンサを発現するトランスジェニック動物または細胞を生成する必要がない。したがって、改変されていない野生型の動物や細胞を研究することができ、したがって、多くの時間、お金、労力を節約できます。さらに、前述のように、ミトコンドリアバイオセンサーを発現させることは、ミトコンドリア機能を変化させることができる。第二に、キットは費用効果が高く、使いやすく、高速です。第三に、C.エレガンスとヒト細胞でこの方法を実証していますが、他の細胞型や生物に合わせて変更することもできます。
そうは言っても、他の方法と同様に、染色キットプロトコルには欠点があります。例えば、試薬とのワームのインキュベーションは、食物の不在下で行われる(我々は、死んだ細菌でさえ染色効率を著しく低下させることを見てきた)。インキュベーション時間は比較的短いですが、この時間枠でも、マイトファジーを含む恒常性応答が変化する可能性があります。さらに、色素のER /ミトコンドリア/核タンパク質および他の生体分子への結合は、これらの細胞小器官の活動に影響を与える可能性があります。また、遺伝子センサーによるマイトファジー測定とは異なり、化学固定を受けた線虫や細胞を扱います。したがって、同じワーム/細胞を異なる時間に監視し続けることは不可能です。したがって、特定の生理学的プロセスにおけるマイトファジーの機能を検証するために、さまざまな方法論を組み合わせることをお勧めします。以下に、VL-850が C.エレガンス 線虫およびHep-3B細胞において堅牢なマイトファジーを誘導することを示す新しいデータを示す。したがって、これらのデータは、VL-850が C.エレガンス の寿命を延ばし、健康なマイトファジーの誘導を通じて C.エレガンス を酸化的損傷から保護するという仮説をさらに支持しています。我々は、強力なマイトファジー誘導因子24であるプロトンイオノフォアカルボニルシアニド4-(トリフルオロメトキシ)フェニルヒドラゾン(FCCP)をポジティブコントロールとして使用しました。

<table><tbody><tr><td>試薬またはリソース</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>分析天びん</td><td>メトラー・トレド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>バクト寒天</td><td>BD-Difco</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>バクトペプトン</td><td>BD-Difco</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>バクトトリプトン</td><td>BD-Difco</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>バクト酵母抽出物</td><td>BD-Difco</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>Σ</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>シアン化カルボニル 4-(トリフルオロメトキシ)フェニルヒドラゾン (FCCP)</td> <td>Σ</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td>Chemicals</strong</td>><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cholestrol</td><td>サーモフィッシャー</td><td>C/5360/48</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 高グルコース</td><td>生物産業</td><td>01-055-1A</td><td></td></tr><tr><td>二度蒸留水 (DDW)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>生物産業</td><td>02-023-1A</td><td></td></tr><tr><td>FBS 熱不活性化</td><td>Invitrogen</td><td>M7514</td><td></td></tr><tr><td>グルテラデヒド (25%)</td><td>Sigma</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 緩衝液 1 M</td><td>生物産業</td><td>03-025-1B</td><td></td></tr><tr><td>L-グルアタミン</td><td>生物産業</td><td>03-020-1B</td><td></td></tr><tr><td>リソソーム/ミトコンドリア/核染色 サイトペインター試薬</td><td>Abcam</td><td>ab139487</td><td></td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム</td><td>Σ</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P 40</td><td>Σ</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>パラホルマリデヒド (16%)</td> <td>電子顕微鏡科学</td><td>15720</td><td></td></tr><tr><td>ポロキサマー 188 溶液</td><td>Σ</td><td>P5556</td><td></td></tr>リン酸<tr><td>二水素カリウム</td>ミリ<td>ポア</td><td>1.04873.1000</td><td></td></tr>リン酸<tr><td>二塩基性シ</td><td>グマ</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>SeaKem LEアガロース</td><td>ロンザ</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>バイオラボ</td><td>1903059100</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>ガドット</td><td>1310732</td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム二塩基性十二水和物</td><td>シグマ</td><td>4273</td><td></td></tr><tr><td>テトラサイクリン塩酸塩</td><td>シグマ</td><td>87128-25G</td><td></td></tr><tr><td>トリプシンEDTA</td><td>生物産業</td><td>03-052-1A</td><td></td></tr><tr><td>VL-850:1,8-ジアミノオキシオクタン</td><td>特許取得済み</td><td></td><td></td></tr><tr><td><強力>ガラス/プラスチック使い捨て</強力></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 &mu;m シリンジフィルター</td><td>Millex GV</td><td>SLGV033RS</td><td></td></tr><tr><td>1.7 mL マイクロ遠心チューブ</td><td>Lifegene</td><td>LMCT1.7B-500</td><td></td></tr><tr><td>10 cm ペトリプレート</td><td>コーニング</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>1,000 mL 三角フラスコ</td><td>IsoLab, ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL 滅菌ポリプロピレンチューブ</td><td>Lifegene</td><td>LTB15-500</td><td></td></tr><tr><td>35 mm ペトリ皿</td><td>バー ナール</td><td></td><td></td>BN9015810</tr><tr><td>500&nbsp;mL真空フィルター/保存ボトルシステム、0.22&nbsp;&mu;m</td><td>Lifegene</td><td>LG-FPE205500S</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 滅菌ポリプロピレンチューブ</td><td>Lifegene</td><td>LTB50-500</td><td></td></tr><tr><td>Deckgl&auml;ser顕微鏡カバーガラス 24 x 60 mm</td><td>マリエンフェルド</td><td>101152</td><td></td></tr><tr><td>ガラス試験管 (10 mL- 13 x 100 mm) ホウケイ酸ガラス</td><td>パイレックス</td><td>99445-13</td><td></td></tr><tr><td>iBiDi 8 ウェル &mu;-スライド</td><td>iBiDi</td><td>80826</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡カバーガラス 24 x 40 mm</td><td>バー ナオール</td><td>BN1052421ECALN</td><td></td></tr><tr><td>プラチナイリジウム 0.25 mM ワイヤー</td><td>ワールド精密機器</td><td>PT1002</td><td></td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>セルカウンター CellDrop BF</td><td>DeNovix</td><td>CellDrop BF-UNLTD</td><td></td></tr><tr><td>Microspin FV-2400</td><td>Biosan</td><td>BS-010201-AAA</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Yokogawa W1 Spinning Disk 共焦点顕微鏡、DAPI、FITC、TRITCフィルター、明視野、60倍CFIプランアポクロマートラムダタイプレンズ(エアレンズ)、NIS-Elementsソフトウェア</td><td>ニコン</td><td>CSU-W1</td><td></td></tr><tr><td>オリンパスSZ61実体顕微鏡</td>オ<td>リンパス</td><td>SZ61pH</td><td></td></tr><tr><td>メーター</td><td>メトラートレド</td><td>MT30019032</td><td></td></tr>リ<tr><td>ボルバー調整可能なラボローテーターLabnetH5600</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

オルガネラ特異的色素を用いた カエノラブディティス・エレガンス および哺乳類細胞におけるマイトファジーの検出

Detection of Mitophagy in Caenorhabditis elegans and Mammalian Cells Using Organelle-Specific Dyes

ミトコンドリアは、エネルギー生産、脂質代謝、カルシウム恒常性、ヘム生合成、細胞死の制御、活性酸素種(ROS)の生成など、さまざまな生物学的機能に不可欠です。ROSは重要な生物学的プロセスに不可欠です。ただし、制御されていない場合、ミトコンドリアの損傷を含む酸化的損傷を引き起こす可能性があります。損傷したミトコンドリアはより多くのROSを放出し、それによって細胞傷害および疾患状態を強める。ミトコンドリアオートファジー(マイトファジー)と呼ばれる恒常性維持プロセスは、損傷したミトコンドリアを選択的に除去し、その後、新しいミトコンドリアに置き換えられます。複数のマイトファジー経路があり、共通のエンドポイントはリソソームの損傷したミトコンドリアの分解です。 
遺伝子センサー、抗体免疫蛍光法、電子顕微鏡法などのいくつかの方法論では、このエンドポイントを使用してマイトファジーを定量化します。マイトファジーを調べるための各方法には、特定の組織/細胞の標的化(遺伝子センサーを使用)や非常に詳細(電子顕微鏡を使用)などの利点があります。しかしながら、これらの方法は、しばしば高価な資源、訓練を受けた人員、およびトランスジェニック動物の作成などの実際の実験の前に長い準備時間を必要とする。ここでは、ミトコンドリアとリソソームを標的とする市販の蛍光色素を使用してマイトファジーを測定するための費用対効果の高い代替手段を紹介します。この方法は、線虫カ エノラブディティスエレガンス とヒト肝細胞のマイトファジーを効果的に測定し、他のモデルシステムでの潜在的な効率を示しています。

VL-850による C.エレガンス 線虫とHep-3B細胞の両方における堅牢なマイトファジー応答の誘導 VL-850は、 C.エレガンス ワームとヒトケラチノサイト(HaCaT細胞)を酸化ストレスから保護します23。その作用機序をさらに調べるために、VL-850が C.エレガンス や他のヒト細胞でマイトファジーを誘導するかどうかを調べました。これをテストするために、C. エレガンス ワーム(若年成人、L1の3日後)を62.5 μM VL-850、5 μM FCCP(ポジティブコントロール)、およびビヒクル(ネガティブコントロール)に6時間曝露しました。以上のように、染色試薬を用いてマイトファジーを測定した。VL-850には62.5μMの濃度を使用することを選択しましたが、それはワームを酸化ストレスから保護し、ワームの寿命を大幅に延ばすためです23。VL-850は、線虫の頭部体壁筋に堅牢なマイトファジーを誘導し(<strong cla...

電子顕微鏡、遺伝子センサー、免疫蛍光法によるマイトファジーの探索には、高価な機器、熟練した人員、および多大な時間投資が必要です。ここでは、 カエノラブディティスエレガンス と肝がん細胞株の両方におけるマイトファジープロセスの定量化における市販の蛍光色素キットの有効性を実証します。

Mitochondria are essential for various biological functions, including energy production, lipid metabolism, calcium homeostasis, heme biosynthesis, ...

マイトファジーによる損傷したミトコンドリアの分解は、ミトコンドリアネットワークの機能に不可欠です。残念ながら、このプロセスは年齢とともに低下します。マイトファジーを活性化する薬剤を開発・使用することで、健康的な老化を促進し、アルツハイマー病を含む老化や加齢性疾患におけるマイトファジーの機能を理解しています。最大の課題の1つは、マイトファジープロセスに影響を与えずに測定することです。最近の研究では、筋細胞のミトコンドリアにおけるGFP発現がMT UPRであるストレスを誘発することが示されています。したがって、非トランスジェニック動物または細胞に色素を使用することは不可欠であり、遺伝子技術を補完します。私たちのプロトコルには3つの主な利点があります。第一に、マイトファジーバイオセンサを発現するトランスジェニック動物または細胞を生成する必要がない。第二に、電子顕微鏡の場合のような高価なインフラストラクチャと専門知識は必要ありません。そして第三に、オルガネラ色素カクテルは市販されており、プロトコルはシンプルで高速です。新しいマイトファジー活性化化合物VL-850は、堅牢なマイトファジーを誘導し、酸化ストレスから保護し、寿命を促進します。今、大きな問題は、根本的な作用機序を決定することです。私たちは、C.elegansと哺乳類細胞を用いて、細胞から生物まで、複数のレベルでそのメカニズムを探索しました。

detection-mitophagy-caenorhabditis-elegans-mammalian-cells-using

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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酵母でMitophagyを監視するための蛍光顕微鏡アッセイサッカロマイセスセレビシエ

このビデオは、線虫Caenorhabditis elegansのマイトファジーを研究するためのin...

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Mitophagy、ミトコンドリアの選択的分解はミトコンドリアの恒常性に関与しているし、様々 な疾患の緩和します。ただし、mitophagy 活性を測定する便利な実験方法は非常に限られました。ここでは、フローサイトメトリーを用いた mitophagy...

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アイソレーションと試験管内で</emの>活性化線虫（Caenorhabditis elegans）精子

学ぶマイトファジー検出法：蛍光色素キットを用いてCaenorhabditis elegansと哺乳類細胞でミトコンドリアの自己分解を定量化する革新的アプローチ。加齢や神経変性疾患の研究に有用です。

オルガネラ特異的色素を用いたカエノラブディティス・エレガンスおよび哺乳類細胞におけるマイトファジーの検出

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