Name: 次世代シーケンシングのためのmRNAおよび亜硫酸水素-mRNAライブラリー調製の濃縮 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: 学ぶ亜硫酸水素RNAシーケンスによるRNAメチル化解析法。膵がん細胞における5-メチルシトシン修飾の役割と、がん進行に関わる差異的メチル化RNAの同定手法を解説します。

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トランスクリプトームワイドマッピングのための堅牢なBisulfite-mRNAライブラリーの作成

<ol><li>Boccaletto, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MODOMICS%3A+a+database+of+RNA+modification+pathways.+2021+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2021 update.</a> Nucleic Acids Research. 50, D231-D235 (2022).</li>
<li>Bohnsack, K. E., Höbartner, C., Bohnsack, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+5-methylcytosine+%28m5C%29+RNA+Methyltransferases%3A+Mechanisms%2C+Cellular+Functions%2C+and+Links+to+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic 5-methylcytosine (m5C) RNA Methyltransferases: Mechanisms, Cellular Functions, and Links to Disease.</a> Genes. 10 (2), 102(2019).</li>
<li>Shinde, H., Dudhate, A., Kadam, U. S., Hong, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+methylation+in+plants%3A+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">RNA methylation in plants: An overview.</a> Frontiers in Plant Science. 14, 1132959(2023).</li>
<li>Courtney, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitranscriptomic+addition+of+m5C+to+HIV-1+transcripts+regulates+viral+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Epitranscriptomic addition of m5C to HIV-1 transcripts regulates viral gene expression.</a> Cell Host & Microbe. 26 (2), 217-227 (2019).</li>
<li>Jonkhout, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+modification+landscape+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">The RNA modification landscape in human disease.</a> RNA. 23 (12), 1754-1769 (2017).</li>
<li>Legrand, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistically+robust+methylation+calling+for+whole-transcriptome+bisulfite+sequencing+reveals+distinct+methylation+patterns+for+mouse+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Statistically robust methylation calling for whole-transcriptome bisulfite sequencing reveals distinct methylation patterns for mouse RNAs.</a> Genome Research. 27 (9), 1589-1596 (2017).</li>
<li>Schaefer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+5-methylcytosine+analysis+by+bisulfite+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">RNA 5-methylcytosine analysis by bisulfite sequencing.</a> Methods in Enzymology. 560, 297-329 (2015).</li>
<li>Amort, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+5-methylcytosine+profiles+in+poly%28A%29+RNA+from+mouse+embryonic+stem+cells+and+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Distinct 5-methylcytosine profiles in poly(A) RNA from mouse embryonic stem cells and brain.</a> Genome Biology. 18 (1), 1(2017).</li>
<li>Schumann, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+links+between+5-methylcytosine+content+of+mRNA+and+translation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Multiple links between 5-methylcytosine content of mRNA and translation.</a> BMC Biology. 18 (1), 40(2020).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Methylcytosine+promotes+mRNA+export+-+NSUN2+as+the+methyltransferase+and+ALYREF+as+an+m5C+reader%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">5-Methylcytosine promotes mRNA export - NSUN2 as the methyltransferase and ALYREF as an m5C reader.</a> Cell Research. 27, 606(2017).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Methylcytosine+promotes+pathogenesis+of+bladder+cancer+through+stabilizing+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">5-Methylcytosine promotes pathogenesis of bladder cancer through stabilizing mRNAs.</a> Nature Cell Biology. 21 (8), 978-990 (2019).</li>
<li>Guo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+activity-associated+alteration+of+mRNA+m%285%29+C+methylation+in+CD4%28%2B%29+T+cells+of+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Disease activity-associated alteration of mRNA m(5) C methylation in CD4(+) T cells of systemic lupus erythematosus.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8 (5), 430(2020).</li>
<li>Song, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+roles+of+RNA+m5C+modification+and+its+implications+in+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomarker+Research%22%5BJournal%5D)">Biological roles of RNA m5C modification and its implications in cancer immunotherapy.</a> Biomarker Research. 10 (1), 15(2022).</li>
<li>Xue, C., Zhao, Y., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+RNA+cytosine-5+methylation%3A+detection%2C+regulatory+mechanisms%2C+biological+functions+and+links+to+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biomarker+Research%22%5BJournal%5D)">Advances in RNA cytosine-5 methylation: detection, regulatory mechanisms, biological functions and links to cancer.</a> Biomarker Research. 8 (1), 43(2020).</li>
<li>Helm, M., Motorin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+RNA+modifications+in+the+epitranscriptome%3A+predict+and+validate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Detecting RNA modifications in the epitranscriptome: predict and validate.</a> Nature Reviews Genetics. 18 (5), 275-291 (2017).</li>
<li>Guo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+mRNA+5-methylcytosine+modifications%3A+Detection%2C+effectors%2C+biological+functions%2C+and+clinical+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Advances in mRNA 5-methylcytosine modifications: Detection, effectors, biological functions, and clinical relevance.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 26, 575-593 (2021).</li>
<li>Saplaoura, E., Perrera, V., Colot, V., Kragler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylated+RNA+Immunoprecipitation+Assay+to+Study+m5C+Modification+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3AJoVE%22%5BJournal%5D)">Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. (159), e61231(2020).</li>
<li>Quail, M. A., Swerdlow, H., Turner, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+protocols+for+the+illumina+genome+analyzer+sequencing+system%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Improved protocols for the illumina genome analyzer sequencing system.</a> Current Protocols in Human Genetics. , Chapter 18, Unit 18.12 (2009).</li>
<li>Chen, S. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+bisulfite+sequencing+reveals+NSUN2-mediated+suppression+of+epithelial+differentiation+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">RNA bisulfite sequencing reveals NSUN2-mediated suppression of epithelial differentiation in pancreatic cancer.</a> Oncogene. 41 (22), 3162-3176 (2022).</li>
<li>Squires, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+occurrence+of+5-methylcytosine+in+human+coding+and+non-coding+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Widespread occurrence of 5-methylcytosine in human coding and non-coding RNA.</a> Nucleic Acids Research. 40 (11), 5023-5033 (2012).</li>
<li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+DNA+5-hydroxylmethylcytosine+and+RNA+5-methycytosine+reprogramming+during+early+human+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%2C+Proteomics+%26+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Dynamic DNA 5-hydroxylmethylcytosine and RNA 5-methycytosine reprogramming during early human development.</a> Genomics, Proteomics & Bioinformatics. , (2022).</li>
<li>Amort, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+non-coding+RNAs+as+targets+for+cytosine+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+biology%22%5BJournal%5D)">Long non-coding RNAs as targets for cytosine methylation.</a> RNA biology. 10 (6), 1003-1008 (2013).</li>
<li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+NSUN2+deficiency+on+the+mRNA+5-methylcytosine+modification+and+gene+expression+profile+in+HEK293+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenomics%22%5BJournal%5D)">Effects of NSUN2 deficiency on the mRNA 5-methylcytosine modification and gene expression profile in HEK293 cells.</a> Epigenomics. 11 (4), 439-453 (2019).</li>
<li>Huang, T., Chen, W., Liu, J., Gu, N., Zhang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+of+mRNA+5-methylcytosine+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification of mRNA 5-methylcytosine in mammals.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 26 (5), 380-388 (2019).</li>
<li>Rieder, D., Amort, T., Kugler, E., Lusser, A., Trajanoski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((meRanTK%3A+methylated+RNA+analysis+ToolKit%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">meRanTK: methylated RNA analysis ToolKit.</a> Bioinformatics. 32 (5), 782-785 (2015).</li>
<li>Kraus, A. J., Brink, B. G., Siegel, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+specific+oligo-based+depletion+of+rRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient and specific oligo-based depletion of rRNA.</a> Scientific Reports. 9 (1), 12281(2019).</li>
<li>Edelheit, S., Schwartz, S., Mumbach, M. R., Wurtzel, O., Sorek, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+mapping+of+5-methylcytidine+RNA+modifications+in+bacteria%2C+archaea%2C+and+yeast+reveals+m%285%29C+within+archaeal+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide mapping of 5-methylcytidine RNA modifications in bacteria, archaea, and yeast reveals m(5)C within archaeal mRNAs.</a> PLoS Genetics. 9 (5), e1003602(2013).</li>
<li>Furlan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+methods+for+RNA+modification+detection+from+nanopore+direct+RNA+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Computational methods for RNA modification detection from nanopore direct RNA sequencing data.</a> RNA Biology. 18, 31-40 (2021).</li>
<li>Leger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+modifications+detection+by+comparative+Nanopore+direct+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">RNA modifications detection by comparative Nanopore direct RNA sequencing.</a> Nature Communications. 12 (1), 7198(2021).</li>
<li>Mateos, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+m6A+and+m5C+RNA+modifications+at+single-molecule+resolution+from+Nanopore+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Identification of m6A and m5C RNA modifications at single-molecule resolution from Nanopore sequencing.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Johnson, Z., Xu, X., Pacholec, C., Xie, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+parameters+in+RNA+bisulfite+sequencing+data+generation+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22NAR+Genomics+and+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of parameters in RNA bisulfite sequencing data generation and analysis.</a> NAR Genomics and Bioinformatics. 4 (2), 045(2022).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+calibration+of+epitranscriptomic+maps+using+a+synthetic+modification-free+RNA+library%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Systematic calibration of epitranscriptomic maps using a synthetic modification-free RNA library.</a> Nature Methods. 18 (10), 1213-1222 (2021).</li>
<li>Chao, H. -P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+RNA-Seq+preparation+protocol+performance%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance.</a> BMC Genomics. 20 (1), 571(2019).</li>
</ol>

著者には開示すべき利益相反はありません。

このプロトコルでは、標準化されたコンポーネントを利用することで、ポリ(A)濃縮、重亜硫酸塩変換、およびライブラリ調製の詳細なパイプラインが達成されました。さらなるシーケンシング解析により、目的のサンプル中のmRNA 5-メチルシトシンが同定されました。
RNAの分解はポリ(A)RNA精製の回収率に影響を与えるため、重要なステップは出発物質であるトータルRNAの品質です。ポリ(A)RNA精製ステップを実施する前に、サンプルを慎重に取り扱い、RNaseの汚染を避ける必要があります。手順のもう一つの重要な部分は、ライブラリ調製におけるPCRサイクルの数です。サイクル数の決定は、ライブラリ調製に使用される重亜硫酸塩処理mRNAの量と、PCR前のステップで1つのサイズ選択または2倍のサイズ選択を使用するかどうかによって異なります。したがって、目的のサンプルに適したサイクル番号は、試運転が必要であり、キャピラリー電気泳動によってPCR産物のサイズ分布を評価して、同じ細胞株または組織に最適なサイクル番号を決定します。
このプロトコルでは、オ...

150種類以上の転写後修飾1のうち、5-メチルシトシン(m5C)修飾は、リボソームRNA、トランスファーRNA、メッセンジャーRNA、マイクロRNA、長鎖ノンコーディングRNA、ボールトRNA、エンハンサーRNA、低分子カハール体特異的RNAなど、さまざまな種類のRNAで同定されています2。RNAm5Cは、植物の根の発生3、ウイルスの遺伝子発現4、癌の進行5の調節など、多様な生物学的および病理学的メカニズムと関連している。このプロトコルの目的は、異なる発生段階または疾患設定における生物学的サンプルのトランスクリプトームワイドmRNA m5C修飾プロファイルを特徴付けるための合理化されたパイプラインを提供することです。トランスクリプトームワイドの亜硫酸バイサルファイトシーケンシングは、塩基対の分解能6、7、8、9で亜硫酸水素バイサルファイト変換RNAの位置と定量的シトシンメチル化レベルを特徴付けるために開発されました。これは、細胞内の生物学的調節機構に関与する遺伝子発現およびRNA運命とのm5Cの会合を研究する場合に特に有用である。哺乳類細胞において、2つの既知のm5Cリーダーがある:ALYREFは核でm5Cを認識することができ、mRNA核から細胞質へのトランスポーター10として機能し、一方YBX1は細胞質中のm5Cを認識し、mRNA安定化を増大させることができる11。免疫経路に関連する異常なm5C mRNAは、全身性エリテマトーデスCD4 + T細胞で報告されました12。研究により、mRNA m5C修飾とがん免疫の調節とがんの進行との関連が明らかになりました13,14。したがって、mRNA上のm5C修飾プロファイルをマッピングすることは、潜在的な調節機構を解明するための重要な情報を提供することができます。
特定の生物学的条件下でのRNA m5C修飾の機能的役割を調査するために、m5C-RIP-seq、miCLIP-seq、および5-Aza-seqなどの亜硫酸バイサルファイト変換ベース(bsRNA−seq)および抗体アフィニティーエンリッチメントベースのアプローチをハイスループットシーケンシングプラットフォームと組み合わせて、トランスクリプトームワイドスケールでm5C修飾による標的領域および配列の効率的な検出を提供することができる15、16。このプロトコルの利点は、抗体親和性濃縮ベースのアプローチが高品質の抗体の入手可能性に依存し、m5Cメチル化ランドスケープの単一フラグメント分解能を達成できるため、包括的なRNAm5Cランドスケープを単一塩基分解能で提供する17。
すべての RNA サンプルは、オリゴ (dT) ビーズを使用した 2 回の mRNA 濃縮、3 サイクルの重亜硫酸反応、およびシーケンシング ライブラリの調製で処理されます。RNAの品質を監視するために、各RNAサンプルは、mRNA精製および亜硫酸水素反応の手順の前後にキャピラリーゲル電気泳動によって検査され、フラグメント分布を評価します。精製されたライブラリは、PCRアンプリコンの品質、キャピラリーゲル電気泳動によるDNAサイズ分布フラグメント、およびシーケンシング前の蛍光色素ベースの定量アッセイによって検査されたそれらの全体的な量によって検査されます。また、農産物、単離されたビリオン、細胞株、モデル生物、病理標本など、幅広い生体試料の解析にも使用できます。

<table><tbody><tr><td>Agilent 2100 電気泳動バイオアナライザー システム</td><td>アジレント、サンタクララ、カリフォルニア州</td><td></td><td>RNA 品質検出</td></tr><tr><td>AMpure XP ビーズ</td><td>ベックマン・コールター</td><td>A63881</td><td>DNA</td></tr><tr><td>を精製 バイオアナライザー DNA 高感度キット</td><td>アジレント、サンタクララ、CA</td><td>5067-4626</td><td>DNA 品質検出</td></tr><tr><td>バイオアナライザー RNA 6000 ピコキット</td><td>アジレント、サンタクララ、CA</td><td>5067-1513</td><td>RNA品質検出</td></tr><tr><td>DiaMag02 - 磁気ラック</td><td>Diagenode, Denville, NJ</td><td>B04000001</td><td>アシストライブラリ調製</td></tr><tr><td>DiaMag1.5 - 磁気ラック</td><td>Diagenode, Denville, NJ</td><td>B04000003</td><td>アシストポリ(A) RNA精製</td></tr><tr><td>Dynabeads mRNA DIRECT 精製キット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック, ウォルサム, MA</td><td>61011</td><td>ポリ(A) RNA精製;ウォッシュバッファー1およびウォッシュバッファー2</td></tr>エ<tr><td>タノール</td><td>J.T.Baker</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>EZ RNAメチル化キット</td><td>Zymo, Irvine, CA</td><td>R5002</td><td>重亜硫酸塩処理</td></tr><tr><td>ホタルルシフェラーゼmRNA</td><td>プロメガ, マディソン, ウィスコンシン州, USA</td><td>L4561</td><td>制御シーケンスのスパイク </td></tr><tr><td>KAPA ライブラリ定量キット</td><td>ロシュ、スイス</td><td>KK4824</td><td>ライブラリ定量</td></tr><tr><td>ナノドロップ分光光度計</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、マサチューセッツ</td><td></td>州 <td>総RNA量検出</td></tr><tr><td>NEBNextマルチプレックス イルミナ用オリゴ (インデックス プライマーセット1)</td> <td>ニューイングランドバイオラボ、イプスウィッチ、マサチューセッツ</td>州 <td>E7335S</td><td>ライブラリ調製</td></tr><tr><td>NEBNext Ultra <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65352/65352eq01.jpg" style="margin: auto;"> Directional RNA Library Prep Kit for Illumina</td><td>New England Biolabs, Ipswich, MA</td><td>E7760S</td><td>library preparation</td></tr><tr><td>Nuclease-free Water</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>P2 pipetman</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>4641010</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 fluorometer </td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td></td><td>RNA 量検出</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>Q32854</td><td>DNA 量検出</td></tr><tr><td>Qubit RNA HS Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>Q32852</td><td>RNA 量検出</td></tr></tbody></table>

次世代シーケンシングのためのmrnaおよび亜硫酸水素-mrnaライブラリー調製の濃縮

Enrichment of mRNA and Bisulfite-mRNA Library Preparation for Next-Generation Sequencing

様々なタイプのRNA転写物におけるRNA転写後修飾は、真核細胞における多様なRNA制御と関連している。RNAの5-メチルシトシン修飾の異常とRNAメチルトランスフェラーゼの発現異常は、がんを含むさまざまな疾患と関連していることが示されています。トランスクリプトームワイドの亜硫酸水素塩基配列決定は、塩基対の分解能で亜硫酸水素バイサルファイト変換RNAの位置と定量的シトシンメチル化レベルを特徴付けるために開発されました。本明細書では、このプロトコルは多(A) RNAの浄化の2つの円形、重亜硫酸塩の反作用の3周期、およびmRNA 5-methylcytosineの修正の場所のトランスクリプトーム広い地図を描くことを可能にするために図書館の準備のプロシージャを詳しく示す。主反応後のRNAの量と質の評価は、RNAの完全性をモニターするために不可欠であり、高品質のシーケンシングライブラリを確保するための重要なステップです。理想的には、手続きは3日以内に完了することができます。このプロトコルでは、高品質のトータルRNAをインプットとして使用することで、目的のサンプルから次世代シーケンシング用の堅牢な亜硫酸水素-mRNAライブラリを実際に構築できます。

細胞株19 から得られた一連のbsRNA-seqライブラリーは、本レポート (図1)の手順に従って作製しました。細胞株サンプルに対してDNase処理を伴ったトータルRNA精製を行い、ゲル電気泳動およびUV-Vis分光光度法(A260/A280)で品質を確認した後、RNAサンプルはポリ(A)RNA濃縮に進むことができます。二重精製でリボソームRNAの大部分を除去できるかどうかを調べるために、rRNAコンタミネーション率を自動計算できるキャピラリー電気泳動トータルRNAアッセイにより、ポリ(A)RNAの精製効率を評価しました (図2)。RNAフラグメントのピークパターンとrRNAコンタミネーション率から、2回精製したRNAサンプルは、AsPC-1とBxPC-3でそれぞれ6.5%から2.2%、2.6%から1.1%にリボソームRNAのコンタミネーションが減少することを示しました。ヒト膵臓がん細胞株では、2回のビー...

このプロトコルは、目的の生物学的サンプルに対して標準化された装置を使用して、ポリ(A)RNA精製、重亜硫酸塩変換、およびライブラリ調製を行うためのわかりやすいワークフローを提供します。

次世代シーケンシングのためのmRNAおよび亜硫酸水素-mRNAライブラリー調製の濃縮

RNA post-transcriptional modifications in various types of RNA transcripts are associated with diverse RNA regulation in eukaryotic cells. Aberrant RNA ...

この研究は、膵臓癌におけるRNAメチル化、特に5-メチルシトシン修飾の役割を研究することを目的としています。私たちが答えたい質問は、特定のRNAメチルトランスフェラーゼのアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションががん細胞の表現型にどのように影響するか、そしてどのRNA基質を介して影響を受けるかということです。この研究では、標準化された装置を使用して、シングル塩基分解能で包括的なRNA m5Cランドスケープを提供します。バイサルファイトRNAシークエンスを用いたこの研究から、RNAのm5C修飾とがん細胞の分化不良との関連が示されました。これは、RNA転写産物中の特定のm5Cの乗客と病気のドライバーの影響を区別する将来の研究への道を開くはずです。この技術により、腫瘍の進行に関与する可能性のあるメチル化RNAの差動を同定することができます。さらに、単一分子塩基実験は、特異的RNA m5Cのより詳細な調節の役割を提供することができます。

enrichment-mrna-bisulfite-mrna-library-preparation-for-next

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JoVE Journal

Biology

生物学

ここでは、T7リニアRNA増幅に基づく遺伝子発現解析用のライブラリーのシークエンシングの両方シングルリードとペアエンドイルミナのmRNA -...

10ナノグラムのトータルRNAからシングルリードとペアエンドのmRNA - seqのイルミナライブラリ

初期生活ストレスにDNAメチル化と遺伝子発現の変化を研究するために合理化されたワークフローが表示されます。新生児マウスと離散の脳組織の分離の母子分離から始めて、我々は同時に、その後の重亜硫酸塩シークエンシングおよびRT-PCR解析のための脳組織のパンチからDNAとRNAを単離するためのプロトコルを表します。...

脳の小、解剖学的に定義された領域からのDNAメチル化と遺伝子発現の最適化分析

MicroRNA(miRNA)は、広く保存された調節分子のクラスです。ここでは、2つの強力なライゲーションステップとそれに続くハイスループットシーケンシングに依存するmiRNAクローニング法について説明します。私たちの方法は、miRNAの正確なゲノムワイド定量を可能にします。...

ハイスループットシークエンシングによりマイクロRNA定量のための低分子RNA分子の高効率ライゲーション

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencingは、制限酵素消化とシトシンバイサルファイト変換を組み合わせたDNAメチル化解析のためのシーケンシングライブラリを調製する方法です。このプロトコルでは、50...

塩基対解像度でDNAメチル化の評価のための強化されたの減少表現重亜硫酸塩シークエンシング

次世代シーケンシングによりDNAメチル化解析をターゲット

このプロトコルでは、マッピング mRNA 3'...

3' 末端配列 A seq2 とライブラリの準備

ここでは、プロトコルとメチル Seq エピゲノムのプラットフォームでは、慢性的なストレス暴露に伴うエピジェネティックな変化を識別するためにラットのモデルを使用しての実装について述べる。結果は、ラット メチル Seq...

ストレス曝露に伴うエピジェネティックな変化を識別するためにラット メチル Seq プラットフォーム

我々は、標準的な方法よりもバイアスが少ない詳細な小さなRNAライブラリー修復プロトコルと2'-O-メチルRNAの感度の増加を提示する。このプロトコルは、コストを節約するために自家製試薬を使用するか、便宜上キットを使用して従うことができます。...

小型RNA-seqの改善:バイアスの減少と2'-O-メチルRNAの検出の改善

ここでは、細菌におけるRIBO-seqのサンプル採取および調製の段階について説明する。これらのガイドラインに従って作成されたライブラリのシーケンシングは、包括的なバイオインフォマティクス分析のための十分なデータをもたらす。私たちが提示するプロトコルはシンプルで、標準的な実験装置を使用し、リシスから図書館の取得まで7日かかります。...

細菌におけるRIBO-seq:NGSシーケンシングのためのサンプル収集とライブラリ調製プロトコル

ここでは、高い、長期にわたる、安定したオンターゲットサイレンシング効率と、低いゲノムワイドなオフターゲット活性を持つ、遺伝子操作された転写抑制因子(ETR)の in vitro...

イン・ビトロ 標的エピジェネティックサイレンシングのための遺伝子操作転写リプレッサーの選択

学ぶ亜硫酸水素RNAシーケンスによるRNAメチル化解析法。膵がん細胞における5-メチルシトシン修飾の役割と、がん進行に関わる差異的メチル化RNAの同定手法を解説します。

次世代シーケンシングのためのmRNAおよび亜硫酸水素-mRNAライブラリー調製の濃縮

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