Name: 皮膚生検からの患者由来足細胞の生成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-26T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: 学ぶ 皮膚生検由来の線維芽細胞をエピソームリプログラミングでhiPSCに変換し、足細胞へ分化させる方法。患者特異的変異を持つ個別化細胞を作製し、遺伝性腎疾患の病態解明と創薬研究に応用する。

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この研究は、フリードリヒ・アレクサンダー大学エアランゲン・ニュルンベルクの学際的臨床研究センター(IZKF)から助成金番号M4-IZKF-F009でヤニナ・ミュラー・ダイレに、そしてBundesministerium für Bildung und Forschung(BMBF)によってプロジェクト名STOP-FSGS-Speed Translation-Oriented Progress to Treat FSGS、助成金番号01GM2202DがJanina Müller-Deileに与えられた資金提供を受けました。SEM画像の撮影をサポートしてくれたAnnalena Krausに感謝します。

皮膚生検を使用して患者由来の足細胞を生成する

<ol><li>Mundel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rearrangements+of+the+cytoskeleton+and+cell+contacts+induce+process+formation+during+differentiation+of+conditionally+immortalized+mouse+podocyte+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Rearrangements of the cytoskeleton and cell contacts induce process formation during differentiation of conditionally immortalized mouse podocyte cell lines.</a> Experimental Cell Research. 236 (1), 248-258 (1997).</li>
<li>Grgic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+podocyte+foot+processes+by+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Imaging of podocyte foot processes by fluorescence microscopy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 23 (5), 785-791 (2012).</li>
<li>Grahammer, F., Schell, C., Huber, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+podocyte+slit+diaphragm-from+a+thin+grey+line+to+a+complex+signalling+hub%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Nephrology%22%5BJournal%5D)">The podocyte slit diaphragm-from a thin grey line to a complex signalling hub.</a> Nature Reviews Nephrology. 9 (10), 587-598 (2013).</li>
<li>Deen, W. M., Lazzara, M. J., Myers, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+determinants+of+glomerular+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Structural determinants of glomerular permeability.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 281 (4), F579-F596 (2001).</li>
<li>Schell, C., Huber, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolving+complexity+of+the+podocyte+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">The evolving complexity of the podocyte cytoskeleton.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 28 (11), 3166-3174 (2017).</li>
<li>Muller-Deile, J., Schiffer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocyte+directed+therapy+of+nephrotic+syndrome-can+we+bring+the+inside+out%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Podocyte directed therapy of nephrotic syndrome-can we bring the inside out.</a> Pediatric Nephrology. 31 (3), 393-405 (2016).</li>
<li>Boehlke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hantavirus+infection+with+severe+proteinuria+and+podocyte+foot-process+effacement%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Kidney+Diseases%22%5BJournal%5D)">Hantavirus infection with severe proteinuria and podocyte foot-process effacement.</a> American Journal of Kidney Diseases. 64 (3), 452-456 (2014).</li>
<li>Schiffer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+targeting+of+actin-dependent+dynamin+oligomerization+ameliorates+chronic+kidney+disease+in+diverse+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pharmacological targeting of actin-dependent dynamin oligomerization ameliorates chronic kidney disease in diverse animal models.</a> Nature Medicine. 21 (6), 601-609 (2015).</li>
<li>Kopp, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocytopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Podocytopathies.</a> Nature Reviews. Disease Primers. 6 (1), 68(2020).</li>
<li>Wiggins, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spectrum+of+podocytopathies%3A+a+unifying+view+of+glomerular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">The spectrum of podocytopathies: a unifying view of glomerular diseases.</a> Kidney International. 71 (12), 1205-1214 (2007).</li>
<li>Mundel, P., Reiser, J., Kriz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+differentiation+in+cultured+rat+and+human+podocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Induction of differentiation in cultured rat and human podocytes.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 8 (5), 697-705 (1997).</li>
<li>Jat, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+derivation+of+conditionally+immortal+cell+lines+from+an+H-2Kb-tsA58+transgenic+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (12), 5096-5100 (1991).</li>
<li>Saleem, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conditionally+immortalized+human+podocyte+cell+line+demonstrating+nephrin+and+podocin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">A conditionally immortalized human podocyte cell line demonstrating nephrin and podocin expression.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 13 (3), 630-638 (2002).</li>
<li>Eto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocyte+protection+by+darbepoetin%3A+preservation+of+the+cytoskeleton+and+nephrin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Podocyte protection by darbepoetin: preservation of the cytoskeleton and nephrin expression.</a> Kidney International. 72 (4), 455-463 (2007).</li>
<li>Krtil, J., Platenik, J., Kazderova, M., Tesar, V., Zima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+methods+of+glomerular+podocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+%26+Blood+Pressure+Research%22%5BJournal%5D)">Culture methods of glomerular podocytes.</a> Kidney & Blood Pressure Research. 30 (3), 162-174 (2007).</li>
<li>Chittiprol, S., Chen, P., Petrovic-Djergovic, D., Eichler, T., Ransom, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marker+expression%2C+behaviors%2C+and+responses+vary+in+different+lines+of+conditionally+immortalized+cultured+podocytes%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Marker expression, behaviors, and responses vary in different lines of conditionally immortalized cultured podocytes.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 301 (3), F660-F671 (2011).</li>
<li>Shih, N. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD2AP+localizes+to+the+slit+diaphragm+and+binds+to+nephrin+via+a+novel+C-terminal+domain%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">CD2AP localizes to the slit diaphragm and binds to nephrin via a novel C-terminal domain.</a> The American Journal of Pathology. 159 (6), 2303-2308 (2001).</li>
<li>Yan, K., Khoshnoodi, J., Ruotsalainen, V., Tryggvason, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-linked+glycosylation+is+critical+for+the+plasma+membrane+localization+of+nephrin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">N-linked glycosylation is critical for the plasma membrane localization of nephrin.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 13 (5), 1385-1389 (2002).</li>
<li>Sir Elkhatim, R., Li, J. Y., Yong, T. Y., Gleadle, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dipping+your+feet+in+the+water%3A+podocytes+in+urine%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Dipping your feet in the water: podocytes in urine.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 14 (4), 423-437 (2014).</li>
<li>Camici, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urinary+detection+of+podocyte+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicine+%26+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">Urinary detection of podocyte injury.</a> Biomedicine & Pharmacotherapy. 61 (5), 245-249 (2007).</li>
<li>Muller-Deile, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+preeclampsia+induced+microRNA-26a-5p+leads+to+proteinuria+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Overexpression of preeclampsia induced microRNA-26a-5p leads to proteinuria in zebrafish.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3621(2018).</li>
<li>Schenk, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+focal+segmental+glomerulosclerosis+%28FSGS%29+factor+suPAR+using+CytoSorb%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Apheresis%22%5BJournal%5D)">Removal of focal segmental glomerulosclerosis (FSGS) factor suPAR using CytoSorb.</a> Journal of Clinical Apheresis. 32 (6), 444-452 (2017).</li>
<li>Petermann, A., Floege, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocyte+damage+resulting+in+podocyturia%3A+a+potential+diagnostic+marker+to+assess+glomerular+disease+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nephron.+Clinical+Practice%22%5BJournal%5D)">Podocyte damage resulting in podocyturia: a potential diagnostic marker to assess glomerular disease activity.</a> Nephron. Clinical Practice. 106 (2), c61-c66 (2007).</li>
<li>Vogelmann, S. U., Nelson, W. J., Myers, B. D., Lemley, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urinary+excretion+of+viable+podocytes+in+health+and+renal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Urinary excretion of viable podocytes in health and renal disease.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 285 (1), F40-F48 (2003).</li>
<li>Petermann, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocytes+that+detach+in+experimental+membranous+nephropathy+are+viable%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Podocytes that detach in experimental membranous nephropathy are viable.</a> Kidney International. 64 (4), 1222-1231 (2003).</li>
<li>Sakairi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditionally+immortalized+human+podocyte+cell+lines+established+from+urine%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Conditionally immortalized human podocyte cell lines established from urine.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 298 (3), F557-F567 (2010).</li>
<li>Rauch, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+iPSCs+into+functional+podocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human iPSCs into functional podocytes.</a> PLoS One. 13 (9), e0203869(2018).</li>
<li>Musah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+induced-pluripotent-stem-cell-derived+human+podocytes+reconstitute+kidney+glomerular-capillary-wall+function+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip.</a> Nature Biomedical Engineering. 1, 0069(2017).</li>
<li>Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+fibroblast+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures.</a> Nature Protocols. 2 (12), 3081-3089 (2007).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Teshigawara, R., Cho, J., Kameda, M., Tada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+human+somatic+reprogramming+to+iPS+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Mechanism of human somatic reprogramming to iPS cell.</a> Laboratory Investigation. 97 (10), 1152-1157 (2017).</li>
<li>Bang, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+episomal+reprogramming+for+generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Cells+and+Systems%22%5BJournal%5D)">Optimization of episomal reprogramming for generation of human induced pluripotent stem cells from fibroblasts.</a> Animal Cells and Systems. 22 (2), 132-139 (2018).</li>
<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).</li>
<li>Musah, S., Dimitrakakis, N., Camacho, D. M., Church, G. M., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+into+mature+kidney+podocytes+and+establishment+of+a+Glomerulus+Chip%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into mature kidney podocytes and establishment of a Glomerulus Chip.</a> Nature Protocols. 13 (7), 1662-1685 (2018).</li>
<li>Burt, M., Bhattachaya, R., Okafor, A. E., Musah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guided+differentiation+of+mature+kidney+podocytes+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+under+chemically+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Guided differentiation of mature kidney podocytes from human induced pluripotent stem cells under chemically defined conditions.</a> Journal of Visualized Experiments. (161), e61299(2020).</li>
<li>Vangipuram, M., Ting, D., Kim, S., Diaz, R., Schule, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+punch+biopsy+explant+culture+for+derivation+of+primary+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Skin punch biopsy explant culture for derivation of primary human fibroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e3779(2013).</li>
<li>Hoffding, M. K., Hyttel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+visualization+of+the+Mesenchymal-to-Epithelial+Transition+during+reprogramming+of+human+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural visualization of the Mesenchymal-to-Epithelial Transition during reprogramming of human fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Research. 14 (1), 39-53 (2015).</li>
<li>Bharathan, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+markers+used+for+the+identification+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of markers used for the identification of human induced pluripotent stem cells.</a> Biology Open. 6 (1), 100-108 (2017).</li>
<li>Scholzen, T., Gerdes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ki-67+protein%3A+from+the+known+and+the+unknown%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">The Ki-67 protein: from the known and the unknown.</a> Journal of Cellular Physiology. 182 (3), 311-322 (2000).</li>
<li>Sun, X., Kaufman, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ki-67%3A+more+than+a+proliferation+marker%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Ki-67: more than a proliferation marker.</a> Chromosoma. 127 (2), 175-186 (2018).</li>
<li>Vaz, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+aberrations+after+induced+pluripotent+stem+cells+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Chromosomal aberrations after induced pluripotent stem cells reprogramming.</a> Genetics and Molecular Biology. 44 (3), 20200147(2021).</li>
<li>Reiser, J., Altintas, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocytes%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Podocytes.</a> F1000Research. 5, 114(2016).</li>
<li>Ohmori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+NEPHRIN+localization+in+kidney+organoids+derived+from+nephrotic+patient+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Impaired NEPHRIN localization in kidney organoids derived from nephrotic patient iPS cells.</a> Scientific Reports. 11 (1), 3982(2021).</li>
<li>Morizane, R., Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+nephron+progenitor+cells+and+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of nephron progenitor cells and kidney organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 12 (1), 195-207 (2017).</li>
</ol>

著者は開示するものは何もありません。

この細胞培養ベースのプロトコルは、ヒト皮膚線維芽細胞の患者特異的なhiPS細胞へのエピソームリプログラミングと、その後のhiPS細胞由来ポドサイトへの分化を組み合わせたものです。これにより、ポドサイト損傷に関する遺伝性糸球体疾患患者のポドサイトの突然変異関連変化を研究することができます。エレクトロポレーションによる集積フリー法で皮膚線維芽細胞を再プログラムするプロトコルは、Bangら32および沖田ら33の公開研究から適応されています。足細胞をhiPS細胞から区別するためのプロトコルは、Musahらから公開されているプロトコル28,34,35から適応されています。hiPS細胞27,34,35からの足細胞の生成を説明する文献が既に入手可能である。ただし、ここで提供されるプロトコルは、hiPS細胞の足細胞への分化に関して最適化されており、より安価です。Musahらから公開されたプロトコルと比較して、ビトロネクチン、ラミニンシルク-511、可溶化基底膜マトリックスなどのさまざまなコーティング試薬でこのプロトコルをテストしました。ビトロネクチンおよびラミニンシルク-511の濃度は、5μg/mLではなく2.5μg/mLに減少させることができた28,34,35。さらに、BMP7とアクチビンA-2つの非常に高価な成長因子の濃度を100 ng/mLから50 ng/mLに50%減少させることができました。
これにより、より安価な差別化が可能になります。7日目からのネフロン前駆細胞はまだ増殖しており、凍結の可能性は以前に示されていました。これらの細胞を解凍後、最終分化前に、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)とB27を含む基本培地で数日間増殖させ、コストをさらに削減しました。分化ステップに加えて、このプロトコルは、皮膚生検からの線維芽細胞の成長と、その後のエピソームリプログラミング による 患者固有のhiPS細胞の生成について説明します。これら2つの方法を組み合わせることで、患者特異的な足細胞を作製することができます。したがって、患者特異的なiPS細胞由来足細胞を生成するための完全な段階的なプロトコルが、これまで詳細に説明されていなかった完全なステップバイステップのプロトコルがここで提供されます。
全体的なプロトコルにはいくつかの異なる細胞タイプが含まれているため、生成された細胞タイプをさまざまなステップで特徴付けることが重要です。細胞は長期間培養されているため、さまざまな継代で品質管理を行う必要があります。hiPS細胞を扱う場合、毎日の摂食、細胞の挙動および形態のモニタリングが必要です。分化媒体の無菌性は、0.2 μmフィルターによるフィルター滅菌によって確保する必要があります。皮膚生検からhiPS細胞由来ポドサイトまでのプロトコル全体には数か月かかりますが、プロセスの異なる段階で細胞を凍結することが可能です。ネフロン前駆細胞分化培地中で7日後に線維芽細胞、選択されたhiPSCクローン、および増殖性ネフロン前駆細胞を凍結することができ、そして作業細胞バンクを生成することができる。
hiPSC由来の健康な足細胞は、一次および二次足突起の明確なネットワークを発達させ(図5A、B)、典型的な足細胞特異的マーカーを発現しますが(図6A-C)、in vivoで見られるように、特徴的なスリット横隔膜は、古典的な2次元細胞培養モデルでは模倣が困難です。さらに、他の糸球体細胞タイプとの細胞間コミュニケーションは、この単培養環境では不可能です。
それらの末端分化状態および増殖能力の欠如のために、ex vivoで足細胞を研究することは困難である。初代足細胞を条件付きで不死化することの助けを借りて、感温スイッチを挿入することによってこの制限を克服することが可能であり、細胞が33°Cで増殖し、37°Cで分化する細胞培養モデルをもたらす13,14。これらのciPodocytesは足細胞研究の可能性が高いですが、マーカー発現の欠如、脱分化形態、足突起の形成の失敗などの制限があります15,16。
患者由来の体細胞からの足細胞の分化は、ex vivoで健康な対照細胞と罹患した足細胞の生成および比較を可能にする。これにより、ポドサイト特異的遺伝子の変異によるポドサイトの損傷を研究することができます。さらに、hiPS細胞を扱うことは、三次元細胞培養疾患モデル、あるいはむしろオルガノイドを作成する可能性を秘めている43,44。hiPS細胞由来ポドサイトと糸球体内皮細胞やメサンギウム細胞などの他の糸球体細胞との共培養は、健康および糸球体疾患における細胞間コミュニケーションに関する新しい洞察につながる可能性があります。
さらに、患者特異的ポドサイトの特性評価および治療は、ハイスループット分析において ex vivo で行うことができる。個別化アプローチは、特定の変異の新しい治療標的を調査し、将来的に個別化医療を行う機会を開きます。

足細胞は、糸球体基底膜(GBM)、糸球体内皮細胞、およびグリコカリックスとともに腎臓の糸球体濾過バリアを形成する特殊な有糸分裂後腎上皮細胞です。表現型的には、足細胞は細胞体と一次微小管駆動膜伸長、および足突起と呼ばれる二次伸長で構成されています1,2。血液から尿をろ過する糸球体濾過バリアは、開窓内皮、GBM、およびポドクティのスリット横隔膜と呼ばれる隣接するポドサイトの足突起を接続する特殊なタイプの細胞間接合部で構成されています3。健康な条件下では、アルブミンよりも大きいタンパク質は、そのサイズと電荷のためにろ過バリアから保持されます4。
細胞骨格細胞またはポドサイト特異的遺伝子の変異、およびポドサイトシグナル伝達経路に影響を与える循環因子は、ポドサイトの消失、剥離、またはアポトーシスを誘発し、タンパク尿および糸球体硬化症を引き起こすことが知られています。特に、細胞骨格の再配列、足細胞の極性の変化、またはスリット接合の関連する喪失を伴う足突起の損傷は極めて重要です5。それらの最終分化状態のために、足細胞はGBMの剥離後にほとんど置換することができない。しかし、足細胞がGBMに付着している場合でも、それらは消失から回復し、足の突起を改革することができます6,7,8。さまざまな糸球体障害における足細胞損傷につながるイベントのさらなる理解は、これらの疾患の治療法の開発に役立つ新しい治療標的を提供する可能性があります。足球損傷は、限局性分節性糸球体硬化症(FSGS)、糖尿病性腎症、微小変化疾患、膜性糸球体腎症などのさまざまな糸球体疾患の特徴であり、これらの疾患の病理学的メカニズムと潜在的な治療アプローチを研究するために信頼性の高い足球ex vivoモデルが必要です9,10。足細胞は、示差ふるい11による糸球体の単離に基づく古典的な初代細胞培養によってex vivoで研究することができる。しかし、増殖能力が制限された最終分化状態のため、ほとんどの研究者は、SV40大型T抗原の温度感受性変異体を発現するマウスまたはヒトciPodocyte細胞株を使用しています。あるいは、ciPodocytesは、SV40 Tag不死化遺伝子1,12を保持するトランスジェニックマウスから単離される。
CiPodocytesは33°Cで増殖するが、増殖停止に入り、37°Cで分化を開始する13,14。これらの細胞で得られた実験データは、細胞が不自然な遺伝子挿入15を使用して生成されるため、特定の注意を払って解釈する必要があることに留意する必要があります。これらの細胞は不死化遺伝子を持っているため、進行中の増殖のために細胞生理機能が変化します12。マウス、ヒト、ラットのciPodocサイトは、糸球体発現と比較して、タンパク質レベルでシナプトポジンとネフリン、mRNAレベルでNPHS1とNPHS2の発現が5%未満であるため、このアプローチによって生成されたポドサイト細胞株が最近疑問視されています16。さらに、ほとんどの足細胞細胞株はネフリン17、18を発現しない。Chittiprolらはまた、ciPodocytesにおける細胞運動性およびピューロマイシンおよびドキソルビシンに対する応答における有意差を記載した16。足細胞は、異なる糸球体疾患においてGBMから剥離した後の尿中に見出すことができる19,20,21,22。生存可能な尿中足細胞は、最大2〜3週間エクスビボで培養できますが、ほとんどの細胞はアポトーシスを起こします23,24。興味深いことに、足細胞は糸球体疾患患者の尿だけでなく、健康な被験者の尿にも見られ、おそらく老化しているときに見られます-培養での複製の可能性は限られています24。さらに、尿由来ポドサイト数は限られており、細胞は培養中に脱分化し、足突起が少なく、形態が変化し、そして最も重要なことに増殖能力が制限されています。ポドサイト特異的遺伝子の発現は存在しないか、数週間以内に消失するか、またはこれらの細胞クローン間で変化する。ポドサイト特異的マーカー陽性のいくつかの細胞は、尿細管上皮細胞または筋線維芽細胞とメサンギウム細胞のマーカーを共発現し、これは培養尿中ポドサイトの脱分化および/または分化形質転換を示唆している24,25。
最近、熱感受性SV40大型T抗原とhTERTによる形質導入による患者および健常ボランティアの尿に由来するciPodocite細胞株の作製が記載されている26。シナプトポジン、ネスチン、およびCD2関連タンパク質のmRNA発現は検出されましたが、ポドシンmRNAはすべてのクローンに存在しませんでした。尿足細胞の問題に加えて、これらの細胞には挿入された不死化遺伝子も含まれているため、上記の欠点が生じます。
対照的に、ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)は、適切な条件下で自己複製し、複数の細胞型に分化する巨大な能力を持っています。hiPS細胞が足細胞のほぼ無制限の供給源として働くことができることは以前に示されました27,28。
ここでは、皮膚パンチ生検の皮膚線維芽細胞から患者固有の足細胞を生成し、その後のエピソームリプログラミングをhiPS細胞に再プログラミングし、最終的にhiPS細胞由来足細胞に分化させるための2段階のプロトコルについて説明します(図1)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65364/65364fig01.jpg"> 図1:患者特異的なiPS細胞由来足細胞を作製するためのプロトコル。 hiPS細胞へのリプログラミングとポドサイトへの分化により、皮膚生検の皮膚線維芽細胞から患者固有のポドサイトを生成するためのプロトコルのグラフィカルな概要。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/65364fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
最初のステップとして、皮膚パンチ生検から体細胞線維芽細胞を増殖させ、転写因子OCT3/4、KLF4、SOX2、およびc-MYC29、30、31を発現するプラスミドとのエレクトロポレーションによる統合フリー法を使用してhiPS細胞に再プログラムしました。生じたhiPSCコロニーを引き続き選択し、拡大した。分化は、WNTシグナル伝達経路の活性化による中胚葉系譜の誘導から始まり、その後、まだ増殖できるネフロン前駆細胞の生成が続きました。最後に、細胞を足細胞に分化させた。この手順では、Bangら32および沖田らによるhiPS細胞生成のためのエピソームリプログラミングのための以前に公開されたプロトコル、およびMusahらによるiPS細胞を足細胞に分化させるためのプロトコル28,34,35を修正および組み合わせました。
実際、私たちのプロトコルによって生成された足細胞は、一次および二次足突起の明確なネットワークの開発と、シナプトポジン、ポドシン、ネフリンなどの足細胞特異的マーカーの発現に関して、 in vivoでポドサイトに近い表現型を持っていました。hiPS細胞由来の足細胞を使用すると、患者の遺伝的背景はリプログラミングおよび分化中に維持されます。これにより、患者固有の足細胞疾患モデリングと、ほぼ無制限の細胞数での潜在的な治療薬のex vivo での発見が可能になります。さらに、このプロトコルは低侵襲で、費用効果が高く、倫理的に受け入れられ、医薬品開発の新しい道を促進する可能性があります。

<table><tbody><tr><td>0.2 &マイクロ;m 滅菌フィルター</td><td>Rotilab</td><td>P668.1</td><td>分化培地の滅菌用</td></tr><tr><td>all-trans レチノイン酸</td><td>幹細胞技術</td><td>72262</td><td>分化用サプリメント</td></tr><tr><td>B27 サプリメント (50 x)、無血清</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td>無血清分化培地用サプリメント</td></tr><tr><td>BG iMatrix-511 Silk</td><td>biogems</td><td>RL511S</td><td>hiPSC培養に適した細胞培養プラスチックをコーティングするためのコーティング溶液に使用される細胞外マトリックス試薬の追加オプション</td></tr><tr><td>:ウシ血清アルブミン(BSA)&nbsp;</td><td>Roth</td><td>8076.4</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR フィルター キャップ 細胞培養フラスコ、T75、250 mL</td><td>Greiner bio-one</td><td>82050-856</td><td>細胞培養プラスチック 線維芽細胞培養</td></tr><tr><td>に適した CHIR99021 (5 mg)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252917-06-9&nbsp;</td><td>差別化のための補足</td></tr><tr><td>コーニングマトリゲルhESC認定マトリックス&nbsp;</td><td>コーニング</td><td>354277</td>、<td>hiPSC培養に適した細胞培養プラスチック(可溶化基底膜マトリックス)をコーティングするためのコーティング溶液に使用される細胞外マトリックス試薬の追加オプションです。</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>細胞</td><td>をカウントする</td>自動セル<td>カウンターInvitrogen</td><td></td></tr><tr><td>クライオピュアチューブ、2 ml、QuickSealスクリューキャップ、細胞</td>ジメチルスルホキシド(DMSO)の凍結用白色の<td>Sarstedt</td><td>72380</td><td>クライオバイアル</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Roth</td><td>A994.1</td><td>for fibroblast freezezing medium</td></tr><tr><td>DMEM/F12 (1:1) (1 x)</td><td>Gibco</td><td>11320074</td><td>basic medium for differentiation</td></tr><tr><td>DMEM/F12 + Glutamax</td><td>Gibco</td><td>10565018</td><td>basic medium for fibroblast medium</td></tr><tr><td>EVOS M5000 Imaging System</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMF5000</td><td>phase contrast microscope</td></tr><tr><td>fetal wevine serum premium, inactivated (FCS)</td><td>PAN Biotech</td><td>P301902</td><td>血清 線維芽細胞用培地、線維芽細胞凍結培地、足細胞メンテナンス培地</td></tr><tr><td>フィッシャーブランド エレクトロポレーション キュベット プラス、4 mm ギャップ、800 & マイクロ;L 容量、</td><td>線維芽細胞のエレクトロポレーション/エピソーム リプログラミングに使用される</td>滅菌 <td>Fisherbrand</td><td>FB104</td> キュベット (4mm ギャップ)</tr><tr><td>fluoromount-G 封入剤、dapi</td> ゲージ針 (0.6 x 30 mm) を含む DAPI <td>Invitrogen</td><td>00-4959-52</td><td>封入剤</td>付き</tr> <tr><td></td><td>BD Microlance3</td><td>300700</td><td>hiPSC コロニーの小片</td></tr><tr><td>ヒト組換えアクチビン A タンパク質</td><td>への分離用78001.1</td><td>分化のための</td><td>幹細胞技術</td>サプリメント</tr><tr><td>ヒト組換え骨形態形成タンパク質 7 (BMP7)</td><td>Peprotech</td><td>120-03P</td><td>分化のための</td></tr>サプリメント ヒト <tr><td>VEGF-165 組換えタンパク質</td><td>Thermo Scientific</td><td>PHC9394</td><td>分化のための</td></tr><tr><td>サプリメント インスリン-トランスフェリン-セレン (ITS -G) (100 x)</td><td>Gibco</td><td>41400045</td><td>サプリメント足細胞 メンテナンス培地</td></tr><tr><td>LB 培</td>地 <td>Roth</td><td>X964.1</td><td>hiPSC 培養ルックアウトの無菌試験用</td></tr><tr><td>マイコプラズマ PCR 検出キット</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>MP0035-1KT</td><td>市販のマイコプラズマ検出キット</td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>Diagonal GmbH & Co.KG</td><td>21,102</td><td></td></tr><tr><td>マイクロチューブ 1.5 mL&nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>72706400</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1コンプリートキット</td><td>幹細胞技術</td><td>85850</td><td>無血清 hiPSC 培養液用基本培地</td></tr><tr><td>ナルゲン凍結容器 Mr.Frosty</td><td>Roth</td><td>AC96.1&nbsp;</td><td>最適な凍結条件を確保するため</td></tr><tr><td>正常なヤギ血清</td><td>Abcam</td><td>AB 7481</td><td>プレインキュベーション溶液および抗体希釈剤</td></tr><tr><td>Nunc 24 ウェルプレート</td><td>用 Thermo Scientific</td><td>142485</td><td>細胞培養プラスチック hiPSC 培養</td></tr><tr><td>nunc 48 ウェルプレートに適しています&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>152640</td><td>hiPSC 培養</td></tr><tr><td>nunc 6 ウェルプレート</td>に適した細胞培養プラスチック&nbsp;<td>Thermo Scientific</td><td>140685</td><td>hiPSC 培養に適した細胞培養プラスチック</td></tr><tr><td>EasYDish ディッシュ 100 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>150466</td><td>細胞培養プラスチック hiPSC 培養</td></tr><tr><td>に適したプラスチック MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate</td><td>Thermo Scientific</td><td>167008</td><td>hiPSC 培養に適した細胞培養プラスチック</td></tr><tr><td>nutriFreez D10 凍結保存培地</td><td>ザルトリウス</td><td>05-713-1E&nbsp;</td><td>hiPSCおよびネフロン前駆細胞の凍結保存のための無血清凍結保存培地</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>11058021</td><td>エレクトロポレーションメディウム&nbsp;</td></tr><tr><td>pCXLE-hMLN</td><td>Addgene</td><td>#27079</td><td>エピソームリプログラミング用プラスミド</td></tr><tr><td>pCXLE-hOCT3/4 プラスミド</td><td>Addgene</td><td>#27077</td><td>エピソームリプログラミング用プラスミド</td></tr><tr><td>pCXLE-hSK プラスミド</td><td>Addgene</td><td>#27078</td> エ<td>ピソームリプログラミング用プラスミド</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333-100ML</td><td>細菌汚染を避けるプラスチック</td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td>Sarstedt</td><td>&nbsp; 83.1840.002</td><td>hiPSCおよびhiPSC由来足細胞の免疫蛍光染色用</td></tr><tr><td>ROTI Histofix</td><td>Roth</td><td>P087.3</td><td>細胞の固定用市販パラホルムアルデヒド (4%)</td></tr><tr><td>RPMI 1640 + L-グルタミン</td><td>Gibco</td><td>21875034</td><td>足細胞維持用基本培地</td></tr><tr><td>染色チャンバー StainTray ブラックリッド</td><td>Roth</td><td>HA51.1</td><td></td></tr><tr><td>ステムプロ アキュターゼ細胞解離試薬</td><td>Gibco</td><td>A1110501</td><td>ヒト PSC の解離に使用される酵素細胞剥離液</td></tr><tr><td>滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) (1 x)</td><td>Gibco</td><td>14190094</td><td>滅菌</td></tr><tr><td>水</td><td>Roth</td><td>T1432</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ 針なし 20 mL</td><td>BD Plastipak</td><td>300629</td><td>ろ過滅菌分化培地</td></tr><tr><td>TCディッシュ100 mm</td><td>Sarstedt</td><td>8,33,902</td><td>皮膚生検および線維芽細胞培養の切断に使用される無菌細胞培養プラスチック</td></tr><tr><td>TCディッシュ 35 mm</td><td>Sarstedt</td><td>8,33,900</td><td>無菌細胞培養プラスチック 皮膚生検から線維芽細胞</td>の成長を凌駕するために使用される</tr><tr><td>triton X 100</td><td>Roth</td><td>3051.3</td><td>for preincubation solution&nbsp;</td></tr><tr><td>トリパンブルーステイン(0.4%)は、Countess Automated Cell Counter</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td>と併用<td>して細胞</td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA(10 x)をカウントします&nbsp;</td><td>Biowest</td><td>X0930-100</td><td>線維芽細胞およびネフロン前駆細胞用解離試薬</td></tr><tr><td>チューブ 15 mL</td><td>Greiner bio-one</td><td>188271-N</td><td></td></tr><tr><td>チューブ 50 mL</td><td>Greiner bio-one</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>vitronectin ACF</td><td>ザルトリウス</td><td>05-754-0002</td><td>細胞培養用プラスチックをコーティング液に使用した細胞外マトリックス試薬 hiPSC培養</td></tr><tr><td>に適したプラスチックY-27632 二塩酸塩 (10 mg)</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>to avoid apoptosis of hiPSCs during splitting</td></tr><tr><td>Primary antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OCT4&nbsp;</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>60093.1</td><td>多能性マーカー、希釈率 1:200</td></tr><tr><td>SSEA-4</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>60062FI.1</td><td>多能性マーカー、希釈率 1:100</td></tr><tr><td>Ki67 Abcam</td><td></td><td>ab15580</td><td>増殖マーカー、希釈率 1:300</td></tr><tr><td>シナプトポジン</td><td>Proteintech</td><td>21064-1-AP</td><td>足細胞特異的マーカー、希釈率 1:200</td></tr><tr><td>ネフリン</td><td>プロゲン</td><td>GP-N2</td><td>足細胞特異的マーカー、希釈率 1:25</td></tr><tr><td>podocin</td><td>proteintech</td><td>20384-1-AP</td><td>脚細胞特異的マーカー、希釈 1:100</td></tr><tr><td>二次抗体</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗モルモット IgG (H+L) 高交差吸着二次抗体、Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A21435</td><td>二次抗体、希釈率 1:1000</td></tr><tr><td>alexa Fluor 647 ヤギ抗ウサギ SFX キット、高交差吸着型</td><td>Invitrogen</td><td>A31634</td><td>二次抗体、希釈度 1:1000</td></tr><tr><td>ロバ抗ウサギ IgG (H+L) 高交差吸着型二次抗体、Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21206</td><td>二次抗体、希釈率 1:1000</td></tr><tr><td>ヤギ抗マウス IgG (H+L) 交差吸着型二次抗体、Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A21422</td><td>二次抗体、希釈率 1:1000</td></tr><tr><td>ヤギ抗マウス IgG (H+L) 交差吸着二次抗体、Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td>二次抗体、希釈率 1:1000</td></tr></tbody></table>

皮膚生検からの患者由来足細胞の生成

Generation of Patient-Derived Podocytes from Skin Biopsies

足細胞は、糸球体濾過バリアの尿部位に位置する上皮細胞であり、糸球体の選択的フィルター機能に寄与する。足細胞特異的遺伝子の変異は、限局性分節性糸球体硬化症(FSGS)を引き起こす可能性があり、足細胞は他の多くの原発性および二次性腎症でも影響を受けます。分化した性質のため、初代細胞培養モデルは足細胞には限られています。したがって、一般的に条件付きで不死化された細胞が使用されます。しかし、これらの条件付き不死化足細胞(ciPodocytes)にはいくつかの制限があります:細胞は培養中に脱分化する可能性があり、特にコンフルエントに達すると、いくつかの足細胞特異的マーカーはわずかにしか発現しないか、まったく発現しません。これにより、ciPodocytesの使用と、生理学的、病態生理学的、および臨床的リーチへのそれらの適用性が疑問視されます。ここでは、皮膚パンチ生検から皮膚線維芽細胞をiPS細胞にエピソームリプログラミングし、その後ポドサイトへと分化させることで、患者特異的ポドサイトを含むヒトポドサイトを作製するためのプロトコルについて述べる。これらの足細胞は、足突起の発達や足細胞特異的マーカーの発現などの形態学的特徴の点で、 in vivo 足細胞にはるかによく似ています。最後に、しかし重要なことに、これらの細胞は患者の突然変異を維持し、個別のアプローチで足細胞疾患と潜在的な治療物質を研究するための改良された ex vivo モデルをもたらします。

エピソームのリプログラミングと分化を組み合わせたこの段階的なプロトコルにより、ポドサイト関連遺伝子に患者の変異を持つポドサイトを生成することができます。これにより、 ex vivoでの疾患特異的な足細胞変化の分析が可能になります。患者の遺伝的背景は、すべての異なる細胞段階の間、プロトコル中に保存されます。また、終末分化型非増殖性足細胞の細胞数不足の限界は、hiPS細胞由来足細胞を用いることで克服することができる。成長した皮膚線維芽細胞からhiPSCへのリプログラミングとその後のポドサイトへの分化 を経て 、hiPSC-Podocyteが生成されるまでには数ヶ月かかりますが、プロトコルの3つの異なるステップで細胞を凍結することが可能です(図2)。ネフロン前駆細胞分化培地で7日間分化させた後の線維芽細胞、hiPSC、ネフロン前駆細胞の凍結が可能です。したがって、作業セルバンクの生成と大規模な実験が可能です。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65364/65364fig02.jpg"> 図2:位相差顕微鏡によるプロトコルの個々のステップ。 (A)成長した皮膚線維芽細胞。(B)リプログラミング後のhiPS細胞コロニー形成。(C)選択されたhiPS細胞培養。(d)分化2日後の中胚葉細胞。(e)ネフロン前駆細胞分化培地で14日間分化させた後のネフロン前駆細胞。(f)末端分化型iPS細胞由来ポドサイト。スケールバーは300μm(A、B、D-F)および150μm(C)を表します。スノーフレークは、可能な凍結ステップを強調します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/65364fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
生成されたhiPS細胞由来の足細胞は、細胞の種類と形態に関して劇的な変化を伴う長いプロトコルを横断するため、細胞の特性評価は必須です。サイズや細胞の形状、成長挙動などの細胞の形態は、位相差顕微鏡を使用して監視できます。線維芽細胞は、150 μmから300 μmのサイズの長い紡錘状の表現型を示します(図2A)。リプログラミング後、50 μmの小さなhiPS細胞を持つコロニーが発生します。これらのコロニーは、高い核対体比と増殖率の増加によって区別される明確な境界とhiPS細胞を示します(図2C)。足細胞は最終分化した細胞であるため、分化が進むと増殖速度が低下し、足突起が目立つ300μmの大きな星型足細胞に細胞形態が変化します(図2F)。
コンフルエントはhiPS細胞培養の臨界点であり、コロニーが密になりすぎると自発的な分化が現れることがあります(図3)。これらのコロニーは、継代前に培養皿の患部をこすることによって除去しなければならない。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65364/65364fig04.jpg"> 図3:異なる品質のhiPS細胞の例。 (A)再プログラムされたhiPSCコロニー、(B)選択されたhiPSC、ならびに(C)自然分化、(D、E)非hiPSCコロニー、および(F)高密度すぎるhiPSC培養物の位相差画像。スケールバーは300μmを表します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/65364fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
このプロトコルの異なる細胞型は、特定のマーカーの発現に関して検証されなければならない。再プログラミング後、hiPS細胞は多能性能力を取り戻し、SSEA4、OCT3/4、Ki67などの増殖マーカーと多能性マーカーを発現します(図4)38,39,40。リプログラミング、ならびにhiPS細胞の長時間の培養および分化は、異常な核型につながるか、むしろ突然変異を誘発する可能性があることが知られている41。したがって、培養細胞の遺伝的背景は、gバンディングおよび全エクソームシーケンシングによって、経時的に異なる継代で監視する必要があります。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65364/65364fig03.jpg"> 図4:免疫蛍光染色による生成されたhiPS細胞の特性評価。 (A)増殖マーカーKi67、ならびに多能性マーカー(B)OCT3/4および(C)SSEA4に対する染色による生成されたhiPS細胞の特性評価。スケールバーは100μmを表します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/65364fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
形態学的には、hiPS細胞由来の足細胞は星形に見え、ciPodoc細胞と比較して長い一次および二次足突起の明確なネットワークを発現します(図5)。HiPS細胞由来のポドサイトは、シナプトポジン、ネフリン、ポドシンなどのポドサイト特異的マーカータンパク質を発現します(図6A-C)42。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65364/65364fig05.jpg"> 図5:ciPodoc細胞と比較したhiPS細胞由来足細胞の形態。 健常ドナー由来の(A,B)hiPS細胞由来ポドサイトと(C,D)ciPodoccyの細胞形態と糸状足について、位相差顕微鏡(A,C)と走査型電子顕微鏡(B,D)を用いて比較した。スケールバーは150μm(A、C)および20μm(B、D)を表します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/65364fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
したがって、健康なドナーだけでなく、ポドサイト特異的遺伝子に変異がある患者からのhiPS細胞由来ポドサイトの比較により、患者の変異を ex vivoで個別化することができます。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65364/65364fig06.jpg"> 図6:hiPS細胞由来ポドサイトおよびciPodocyteにおけるポドサイト特異的マーカーの特性評価。ポドサイト特異的マーカータンパク質シナプトポジン(A,D)、ネフリン(B,E)、およびポドシン(C,F)に関する(D-F)ciPodoccytへの健康なドナーからの(A-C)hiPSc由来足細胞の比較。スケールバーは50μmを表します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/65364fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
表 1.研究に使用されたすべての細胞培養培地および溶液の組成。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/Table%201_REv2.zip" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

この原稿では、ヒト誘導多能性幹細胞(hiPSC)へのエピソームリプログラミングとその後のポドサイトへの分化 を介して 、皮膚線維芽細胞から患者固有のポドサイトを生成するための2段階のプロトコルについて説明しています。

Podocytes are epithelial cells sitting on the urinary site of the glomerular filtration barrier that contribute to the selective filter function of the ...

我々は、エピソームリプログラミングによりヒトポドサイトをヒト誘導多能性幹細胞に再プログラミングすることによりヒトポドサイトを作製するためのプロトコルを記載する。これらの細胞は、ポドサイトの食品プロセスおよびポドサイト特異的マーカーの発現の点で、不死化ポドサイトよりもはるかによくin vivoポドサイトに似ています。足細胞は終末分化細胞です。したがって、これらの細胞はもはや増殖せず、細胞培養における初代足細胞分析は制限される。細胞数が限られているという問題は、条件付きで不死化したポドサイトを使用することで克服されましたが、これらのポドサイトは脱分化した表現型と挙動を示し、基礎研究での使用に疑問を投げかけています。人工多能性幹細胞の助けを借りて、ポドサイトは、明確な食物プロセスおよびポドサイト特異的マーカーの発現を含む典型的なポドサイト形態を有するほぼ無制限の細胞数でin vitroで生成することができる。患者特異的幹細胞を使用して足細胞に分化する場合、エクスビボで細胞の疾患特異的変化を研究することができる。症例の場合、最初の皮膚生検は遺伝性足細胞疾患の患者から採取された。私たちのプロトコルで生成された足細胞は、患者の突然変異を持つパーソナライズされた罹患細胞です。したがって、これらの細胞は、個別のアプローチでポドサイト疾患および潜在的な治療物質を研究するための改良されたex vivoモデルを表しています。

generation-of-patient-derived-podocytes-from-skin-biopsies

Research

JoVE Journal

Biology

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人間の皮膚から実行可能な成人上皮幹細胞を単離の迅速、確実な方法が記載されている。方法は、毛包と細胞培養のための単一の細胞懸濁液または組織断片の分離の摘採が続く皮膚のコラーゲンマトリックスの酵素消化を、利用しています。...

ヒト皮膚から大人上皮幹細胞の単離と培養

彼らは多能性のための標準的なテストを通過した時、誘導多能性幹細胞（IPSC）ラインを生成することはあっても発生能の異なる行が生成されます。ここでは、所有している完全な多能性としてIPSC行を定義性IPSC、から完全に由来するマウスを作製するためのプロトコルを記述する...

人工多能性幹細胞に由来するマウスの作製

タンパク質は、天然構造を採用するか、不溶性アミロイドに誤って折り畳まれる可能性があります。ミスフォールディング経路に有利な条件は、さまざまな種類のアミロイド線維の形成につながります。ここで説明する方法は、in...

天然のタンパク質からアミロイドの迅速な生成<em&gt;インビトロ</em

ここでは、許容的培養条件下でヒトの生物学的特徴を再現収縮筋線維（myospheres）の三次元クラスターを形成し、骨格筋前駆細胞の均質な集団を生成することに向けて、ヒト胚性幹細胞（hESC）のエピジェネティックな再プログラミングに基づくプロトコルを記載骨格筋。...

エピジェネティックリプログラミングによるヒトES細胞からMyospheresの生成

学ぶ 皮膚生検由来の線維芽細胞をエピソームリプログラミングでhiPSCに変換し、足細胞へ分化させる方法。患者特異的変異を持つ個別化細胞を作製し、遺伝性腎疾患の病態解明と創薬研究に応用する。

皮膚生検からの患者由来足細胞の生成

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