Name: 電量マイクロレスピロメトリーを用いたショウジョウバエのメラノガスターにおけるO2消費量の測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-07T13:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: 学ぼう、電量マイクロレスピロメトリーによるDrosophila melanogasterの酸素消費量測定法。CASK変異体と野生型の比較により、遺伝的背景が代謝に与える影響を解明する実験手法を習得できます。

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アリゾナ大学のリンダ・レスティフォ博士には、KASK変異体のO2 消費の試験を提案し、KASK変異体とそのコンジェニックコントロールを送っていただいたことに感謝します。出版料は、カレッジパーク大学の生物学部から部門再投資基金によって提供されました。スペースといくつかの機器は、シェイディグローブの大学から提供されました。

1.ハエの飼育と収集
<ol><li>標準的な ショウジョウバ エの餌が入った狭いバイアルでハエを25°Cに維持します。 注:各遺伝子型のサンプルサイズは、少なくとも9回の反復で構成され、それぞれが15〜25匹のハエを含む単一の呼吸計チャンバーで構成され、以下に説明するように設定する必要があります。</li>
	<li>2〜3日ごとにハエを移します。</li>
	<li>CO2でハエを麻酔し、各遺伝子型の15〜25人の男性のグループを収集し、各グループを新鮮な酵母のない食品バイアルに入れます。 注:男性は、生殖状態による変動を減らすために使用されました。この方法は男女ともに適用されます。</li>
	<li>ハエを25°Cで少なくとも24時間回復させます。 注:実験時までに、ハエは1〜4日齢になっているはずです。ステップ1.3で説明した収集頻度は、ハエの年齢範囲を狭めるために設定できます。</li>
</ol>2.呼吸計チャンバーのセットアップと組み立て
<ol><li>ウォーターバスをオンにして、実験に必要な温度に設定します。 注:以下の実験は、50 mLのシュレンクチューブをチャンバーとして使用して25°Cで行いました。コンポーネントは、 図1A、1B、および1Cに示すように組み立てます。</li>
	<li>チャンバーとセンサープラグのすりガラスの接合部を徹底的に清掃するには、70%エタノールを実験室用ワイプ(接合部に直接スプレーするのではなく)にスプレーし、センサープラグからほこりや古いグリースを拭き取ります(図1A)。新しい実験室用ワイプでエタノールを拭き取ります。</li>
	<li>精製水に浸した1cmの綿ロールをチャンバーの底に置き、湿度を安定させます。<ol><li>十分な水(~0.5 mL)を加えて、ロール綿の底に小さなプールを作ります。</li>
	</ol></li>
	<li>チャンバーの接合部にこぼれた水を拭き取ります。</li>
	<li>漏斗を使用して、ラベル付きのポリプロピレンチューブにハエを移します。<ol><li>チューブを綿ロールで塞ぎます。 注:チューブは、長さ5.5 cmにトリミングされた5 mLのポリプロピレン製試験管で構成されており、実験チャンバーと空気を自由に交換できるようにホットナイフで穴が開いています。CO2麻酔は代謝異常を引き起こすことが知られているため、ハエは麻酔なしで移送され、ハエを失わないように細心の注意を払う必要があります。</li>
	</ol></li>
	<li>ハエの入った換気チューブを各呼吸計チャンバー(濡れた綿の上)に1本追加します。</li>
	<li>ソーダライムカートリッジ(チューブあたり4〜5ペレット)を充填し、チャンバー内のハエを含むチューブの上部に置きます。 注:ソーダライムカートリッジは、電動ドリルで4〜5回穴あけされた800μLの遠心分離管で構成されています。</li>
	<li>O2 発生器に飽和硫酸銅(CuSO4)溶液を通気孔のレベルより下に充填します 注:O2 発電機は、ねじ山の下に4つの穴が開けられたスクリューキャップ遠心分離管で構成されています。白金(Pt)電極と銅(Cu)電極を2ピンコネクタにはんだ付けし、キャップに開けた穴に挿入し、エポキシで貼り付けます。CuSO4 の電気分解は、実験生物によって消費されるO2 を生成する。CuSO4 は無脊椎動物に有毒であり、こぼれや漏れを避け、すぐにクリーンアップします。</li>
	<li>充填されたO2 ジェネレーターをセンサープラグの2ピンコネクタに接続します。 注意: 銅カソードはコントローラの負出力に接続し、白金アノードをプラス線に接続する必要があります。接続が逆になっていると、実験が失敗します。</li>
	<li>センサープラグのすりガラスジョイントの反対側に、透明なシリコングリースを2つ小さなたたきます。</li>
	<li>プラグをチャンバーに挿入し、プラグ(またはチャンバー)を適度な圧力で回転させて、ジョイントにグリースを広げます。<ol><li>余分なグリースをラボ用ワイプで拭き取ります。</li>
	</ol></li>
	<li>プラスチック製のケッククランプをジョイントにスナップして、チャンバーにプラグを固定します。組み立てられたチャンバーは 図1Cのようになります。</li>
	<li>その日の実験に使用したチャンバーの数について、上記の手順を繰り返します。 メモ: 記録できるチャンバーの数は、使用可能なチャンバー、コントローラー、およびコンピューターへのUSB入力の数によって制限されます。本実験では、通常、7つのチャンバーを並列に実行しました。ミュータントなどの実験的なハエは、適切な対照と一致させる必要があります。ハエのいないチャンバーを同じように設定し、環境変動のコントロールとして各実験に含める必要があります。異なる処理(変異型、野生型、飛行禁止)を含むチャンバーは、実験間でローテーションする必要があります。</li>
	<li>組み立てたチャンバーを、活栓を開いた状態でウォーターバスのラックに入れます(図1E)。 注:概日変動を避けるために、ここで説明するすべての実験では、午前9時30分から9時50分の間にチャンバーを浴槽に入れました。</li>
	<li>活栓は開いたままにします(ハンドルを活栓と平行に保ちます)。 注意: 活栓に水が入らないように注意してください。</li>
	<li>栓を開いた状態でチャンバーを約30分間平衡化させます。 注意: チャンバーが平衡化されている間に、電子機器を接続し、以下の説明に従ってデータ取得を設定します。</li>
</ol>3.コントローラーとコンピューターのセットアップ
<ol><li>O2 発電機に電流を供給するスイッチがオフの位置にあることを確認してください(コネクタから離れています。 図1D)。</li>
	<li>各コントローラボックスを使用可能なユニバーサルシリアルバス(USB)ポートに接続します。 注:他の場所で説明されているコントローラーユニットの構築とプログラミング12.</li>
	<li>6芯ケーブルを使用して、コントローラーを呼吸計チャンバーに接続します。</li>
	<li>コントローラの有機発光ダイオード(OLED)ディスプレイ(図1D)に環境パラメータが表示されていることを確認します。</li>
	<li>コントローラーのスイッチを使用して、O2 発電機を短時間オンにします(図1D)。<ol><li>電流値がゼロから35〜55mAに増加すると、コントローラーとチャンバーは実験の準備が整います。</li>
	</ol></li>
	<li>コントローラがどのCOMポートを使用しているかを確認します。次の手順に従います。<ol><li>Microsoft Windowsの [スタート ]アイコンをクリックします。</li>
		<li>[設定]アイコンをクリックします。</li>
		<li>[Bluetoothとデバイス]をクリックします。</li>
		<li>コントローラとそのCOMポートがデバイスのリストに表示されていることを確認します。</li>
	</ol></li>
	<li>デスクトップでPuTTYを開き、以下で説明するように、呼吸計の各チャンネルのログファイルを設定します。 注:PuTTYは、COMポートを介してコンピュータにデータを転送するために使用される無料のセキュアシェルおよびTelnetクライアントです。<ol><li>[Serial line](シリアルライン)ボックスにポート番号を入力して、コントローラのCOMポートを選択します(図2A)。</li>
		<li>「 ログ」をクリックします。</li>
		<li>「セッションログ」で「印刷可能な出力」を選択します(図2B)。</li>
		<li>「ログ・ファイル名」で、「 参照」をクリックします。</li>
		<li>選択したフォルダに、説明情報(日付、種、COMポート番号など)を含むファイル名を作成します。</li>
		<li>「 保存」をクリックします。</li>
		<li>「 開く」をクリックします。ウィンドウが開き、カンマ区切りのデータが記録されます(図2C)。</li>
		<li>実験に使用している他のすべてのコントローラーについても同じ手順を繰り返します。各COMポートへの入力は、個別のウィンドウとして表示されます(図2D)。</li>
	</ol></li>
</ol>4. 実験の実行
<ol><li>チャンバーが30分間平衡状態になったら、活栓を閉じて密閉します。</li>
	<li>浴槽と浴室を発泡スチロールの箱で覆い、安定した環境を維持します。</li>
	<li>さらに1時間平衡化します。</li>
	<li>コントローラーボックスのスイッチを使用して、各チャンバーのO2 発生器に電流を流します。</li>
	<li>O2 発生器が作動したら、圧力が事前に設定されたOFF圧力まで上昇することを確認します。 注:この一連の実験では、大気圧をわずかに上回る1017hPaを「OFF」圧力として使用しました。周囲圧力に戻ると、チャンバーからガスが漏れていることを示します。さらに、周囲気圧に関係なく、実験全体で同じ圧力を使用できます。「オン」の圧力は1016hPaであり、O2 発生器が作動する前に圧力が1hPa下がるだけで済むことを意味した。これにより、ショウジョウバエのO2 消費量を測定するのに十分な感度が得られました。チャンバーが「OFF」設定に加圧されると、電流はゼロに低下します。</li>
	<li>実験を3時間以上実行します。 注:高温でVO2 を高くすると、実験時間を短縮できます。機器が機能していることを確認するために時々監視しますが、温度安定性に影響を与える可能性のあるチャンバーの近くで過度の活動を避けてください。</li>
</ol>5. 仕上げ実験
<ol><li>すべてのコントローラーのO2 ジェネレーターをオフにします。 注意: チャンバーが開いている間にO2 ジェネレーターを運転しないように、最初に実行してください。</li>
	<li>活栓を開いてチャンバーのシールを解除します。</li>
	<li>PuTTYウィンドウをさらに5〜15分間開いたままにして、最終的なベースラインを提供します。</li>
	<li>各コントローラーの PuTTY ウィンドウを閉じ、録画を終了します。 注:すべての実験は午後4時50分から5時10分の間に終了しました。</li>
	<li>センサーをケーブルから外します。</li>
	<li>チャンバーをドライラックに移動します。</li>
	<li>センサープラグをチャンバーから一度に1つずつ取り外します。</li>
	<li>O2 ジェネレーターを外し、チューブラックに置きます。</li>
	<li>センサープラグからグリースを拭き取り、ラックに保管します。</li>
	<li>チャンバージョイントからグリースを取り除き、ハエとソーダライムでチューブを取り外します。</li>
	<li>CO2で各チューブに麻酔をかけ、ウェイトボートを叩き、 マイクロ天びんで重さを量ります。<ol><li>各チューブの重量とハエの数を記録します。</li>
	</ol></li>
	<li>ハエを捨てるか、追加の手順のために取っておきます。</li>
	<li>カートリッジからソーダライムを廃棄物容器に捨てます。</li>
	<li>O2発生器を開き、CuSO4溶液を廃液容器に廃棄します。<ol><li>電極とチューブを精製水ですすいでください。</li>
		<li>チューブラックを置いて乾燥させます。</li>
	</ol></li>
</ol>6. 電荷移動データの解析
<ol><li>データをコンマ区切りのテキストとしてスプレッドシートにインポートし、各レコードが個別のワークシートで構成されます。</li>
	<li>O2 発生器の各パルスの現在および時間データを記録します。チャンバーを加圧した後の最初のパルスから開始し、各電流パルスの開始時刻と終了時刻を(行番号として)記録します。これは、電流がゼロ(通常は約45〜50mA)を超え、ゼロを超える最後の行まで行ったときの行番号です。</li>
	<li>ワークシートに表を作成して、次のデータを記録します。<ol><li>パルス中の平均電流振幅:= AVERAGE([パルスの最初の行]:[パルスの最後の行])、各パルス(現在の列から)。</li>
		<li>パルス幅: ([パルスの最終行] - [パルスの最初の行[-1行]])/1000 (ミリ秒単位の時間列から)。</li>
		<li>合計実験時間:[最後のパルスの開始時の時間] - [チャンバー加圧後の最初のパルスの終了時の時間](分列の時間から)。</li>
	</ol></li>
	<li>次に、各パルス(平均電流X時間)の電荷移動(Q)を計算します</li>
	<li>すべてのパルスの電荷を合計して、総電荷量(Qtot)を計算します。</li>
</ol>7.O2 消費量の分析
<ol><li>すべてのデータに対して新しいスプレッドシートを設定し、各チャンバーについて以下を入力または計算します。<ol><li>Qtot (合計料金)</li>
		<li>ほくろ(= Q ÷ 96485 × 4)</li>
		<li>mL O2 (= モル × 22413 mL/mol)</li>
		<li>合計時間(上記のデータ分析から)</li>
		<li>mLのmin-1 (=mlO2 ÷合計時間)</li>
		<li>グラム単位の重量(麻酔をかけ、実験後に測定したハエの重量を量る)</li>
		<li>mL min-1 g-1 (= mL min-1 ÷ 重量 (グラム単位)</li>
		<li>mL/h/g(上記×60)</li>
		<li>mg/fly (= ハエの重量÷ハエの数)</li>
		<li>μL fly-1 h-1 (= (mL min-1 × 3600) ÷ ハエの数)。</li>
	</ol></li>
	<li>各治療のデータを表にする(遺伝子型など)</li>
	<li>分散分析、t検定、またはMann-Whitneyのu検定 13を使用して処理を比較します。</li>
</ol>

ショウジョウバエの微小呼吸器測定法の適応 - CASK変異体代謝への洞察

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</ol>

著者は利益相反がないことを宣言します。

上記の手順は、電子電量マイクロレスピロメーターを使用したD.メラノガスターにおけるO2消費量の測定を示しています。野生型D.melanogasterにおけるO2消費の結果のデータは、他の研究者によって報告されたものよりやや低いものの、多様な方法(表1)を用いた以前のほとんどの出版物に記載されている範囲内であった3,6。
重要なステップは、気密シールと環境安定性というこの方法の2つの絶対的な要件に対処しました。気密環境を維持するのは簡単ですが、注意が必要です。シュレンクフラスコとチューブは、蒸着薬室として理想的です。ガラス構造は、多くの種類のプラスチック19に存在するガス透過性を回避し、これは長時間の実験で特に重要である。標準ジョイントにより、センサーと電子接続を含むプラグとの気密接続が可能です。活栓は信頼性...

代謝率を測定する能力は、環境的文脈における生物を完全に理解するために重要です。例えば、寿命1における食事の役割、代謝における食事の役割2、低酸素ストレスの閾値3を理解するためには、代謝率を測定する必要があります。
代謝率の測定には、2つの一般的なアプローチがあります4。直接熱量測定は、熱産生を測定することにより、エネルギー消費量を直接測定します。間接熱量測定は、他の手段、多くの場合、O2 消費量(VO2)、CO2 生産、またはその両方の呼吸測定を介してエネルギー生産を測定します。直接熱量測定は、 ショウジョウバエのmelanogaster5を含む小さな外温動物に適用されていますが、スピロメトリーは技術的により単純で、より一般的に使用されています。
野生型および変異体D. melanogasterの代謝率を測定するために、いくつかの形態のスピロメトリーが成功裏に使用され、体温6、社会環境3、食事3,7、および神経発達障害8の代謝効果に関する洞察が得られました。これらは 2 つのクラスに分類され、コストと複雑さが大きく異なります。マノメトリーは最も単純で最も安価な9,10であり、ハエはCO2吸収剤を含み、薄いキャピラリーを介して液体リザーバーに接続されている密閉チャンバーに入れられます。O2が消費され、CO2が吸収されると、チャンバー内の圧力が低下し、流体がキャピラリーに引き込まれます。したがって、キャピラリーの流体で満たされた体積はVOに比例します2。毛細血管内の流体によって加えられる力を補正する、より精巧なバージョンもD. melanogaster1で使用されています。マノメトリーには、シンプルで安価であるという利点がありますが、圧力に敏感であるため、一定の環境条件が必要です。また、消費されたO2は置換されないため、チャンバー内のO2(PO2)の分圧は徐々に低下する。
ガス分析を用いた呼吸法は、D. melanogasterにも定期的に使用されています。この場合、ガスは、ハエを含む密閉チャンバーから一定の間隔でサンプリングされ、赤外線分析装置に送られる2,6,11。このタイプの装置には、市販されており、環境条件の影響を受けにくく、サンプリング中にガスがリフレッシュされるため、PO2が安定しているという利点があります。ただし、機器は高価で操作が複雑になる可能性があります。
最近開発された電量マイクロレスピロメータ12は、既存のシステムに代わる安価で高感度かつ安定した代替手段を提供する。実際には、生物はO2を消費する気密チャンバーに入れられ、呼気されたCO2は吸収性材料によって除去され、チャンバー圧力の正味の低下をもたらします。内圧が予め設定された閾値(ON閾値)まで低下すると、電解O2発生器に電流が流れ、圧力を第2の閾値(OFF閾値)に戻して電気分解を停止する。O2発生器を横切る電荷移動は、チャンバを再加圧するのに必要なO2の量に正比例し、したがって、生物4によって消費されるO2を測定するために使用することができる。この方法は感度が高く、VO2を正確に測定し、O 2の定期的な交換により、数時間または数日間、PO2をほぼ一定のレベルに維持できます。
この研究で使用された電量マイクロレスピロメーターは、マルチモーダル(圧力、温度、湿度)電子センサーを採用しています。センサは、圧力のわずかな変化を検出し、低圧閾値に達するとO2生成を作動させるマイクロコントローラによって動作する12。この装置は既製の部品から組み立てられ、さまざまなチャンバーや実験環境で使用でき、カブトムシテネブリオモリターの体重と温度の影響を調べるのに成功しています。本研究では、マイクロレスピロメーターは、T. molitor の質量の約 1% を有する D. melanogaster のO 2 消費量を測定するように適合されています。O2生成を活性化する閾値を小さくすることで装置の感度を高め、温度管理された水槽で実験を行い、チャンバー内の湿度を100%近くに維持することで環境安定性を高めました。
膜関連グアニル酸キナーゼ(MAGUK)ファミリーの一部であるCASK(カルモジュリン依存性セリンプロテインキナーゼ)タンパク質は、さまざまな多タンパク質複合体の分子足場であり、KASKの変異はヒトおよびD. melanogasterの神経発達障害と関連している13,14。生存可能なD.メラノガスター変異体であるCASKΔ18は、ドーパミン作動性ニューロンの活性を阻害し15、コンジェニックコントロールと比較して活性レベルを50%以上低下させる14,16。KASK変異体の活性レベルの低下と代謝調節におけるカテコールアミンの役割17のために、我々はそれらの標準代謝率、したがってO2消費量が対照と比較して劇的に減少すると仮定した。
O2 消費量は、CASKΔ18 およびそれらの野生型同族体 w(ex33) で測定されました。ハエのグループをスピロメトリーチャンバーに入れ、O 2消費量を測定し、O2消費量を計算し、質量比ベースとハエあたりベースの両方で発現させた。この装置は、野生型ハエのV O2を記録し、これは以前の研究と一致しており、野生型ハエとKASK変異ハエのハエあたりのO2消費量を区別することができました。

<table><tbody><tr><td>19/22 温度計アダプター</td><td>Wilmad-Labglass</td><td>ML-280-702</td><td>センサー プラグ</td></tr><tr><td>2 ml スクリューキャップ チューブ</td><td>フィッシャー</td><td>3464</td><td>O2 ジェネレーター</td></tr><tr><td>2 ピン コネクタ</td><td>Zyamy</td><td>40PIN-RFB10</td><td>O2 ジェネレーター: 2 ピン</td></tr><tr><td>4 ピン メス コネクタ</td>にカット <td>TE Connectivity</td><td>215299-4</td><td>センサー プラグ</td></tr><tr><td>5 mlポリプロピレンチューブ</td><td>ファルコン</td><td>352063</td><td>5.5cmにカットして穴あき&nbsp;</td></tr><tr><td>50 ml シュレンク チューブ 19/22 ジョイント</td><td>ラボイ</td><td>HMF050804</td><td>チャンバー</td></tr><tr><td>6 導体ケーブル</td><td>ゼニス</td><td>6 導体 26 ga</td><td>ケーブル</td></tr><tr><td>6 ピン メス バルクヘッド コネクタ</td><td>スイッチクラフト</td><td>17982-6SG-300</td><td>コントローラー</td></tr><tr><td>6 ピン メス コネクタ</td><td>スイッチクラフト</td><td>18982-6SG-522</td><td>センサー プラグ</td></tr><tr><td>6 ピン オス コネクタ</td><td>スイッチクラフト</td><td>16982-6PG-522</td><td></td></tr>ケーブル<tr><td>800ul遠心分離管</td><td>フィ</td><td>ッシャー05-408-120</td><td>ソーダライムカートリッジ</td></tr><tr><td>ABSプラスチックエンクロージャ</td><td>バドインダストリー</td><td>ズPS-11533-G</td><td></td></tr><tr><td>コントローラーArduinoナノエブリ</td>イー<td>ビルLLC</td><td>ABX00028</td><td></td></tr><tr><td>コントローラーBME280</td><td>センサーDIYMallFZ1639-BME280</td><td></td><td>センサープラグ</td></tr><tr><td>回路基板Lheng</td><td></td><td>5 X 7 cm</td><td>コントローラー</td></tr><tr><td>硫酸銅</td><td>BioPharm</td><td>BC2045</td><td>O2</td></tr><tr><td>ジェネレーター コンピューター</td><td>Azulle</td><td>Byte4</td><td>データ収集</td></tr><tr><td>コットン ロール</td><td>カジュカジュド</td><td>#2</td><td>フライ チューブを差し込むために半分にカット 湿度のために四分の一にカット</td></tr><tr><td>環境チャンバー</td><td>パーシバル</td><td>I30 VLC8</td><td>フライケア</td></tr><tr><td>エポキシ</td><td>JB溶接</td><td>プラスチックボンダーO</td><td>2ジェネレーター</td></tr><tr><td>フライフード</td><td>ラボエクスプレス</td><td>タイプR</td><td>フライケア</td></tr><tr><td>ケッククランプuxcell</td><td></td><td>a20092300ux0418</td>を<td>差し込むためにチャンバーのガラスジョイントを固定します</td></tr>低<tr><td>粘度エポキシ</td><td>ロックタイト</td><td>E-30CL</td><td>センサープラグ</td></tr><tr><td>OLEDディスプレイ</td><td>IZOKEE IZKE31-IIC-WH-3</td><td></td><td>コントローラー</td></tr><tr><td>プラチナワイヤー 24 ga</td><td>uGems</td><td>14349</td><td>O2 ジェネレーター</td></tr><tr><td>シリコーングリース</td><td>ダウコーニング</td><td>高真空グリース</td><td>シール チャンバープラグ接続</td></tr><tr><td>ソーダ ライム</td><td>ジョルベット</td><td>JO553</td><td>CO2 吸収</td></tr><tr><td>トグルスイッチ</td><td>E-Switch</td><td>100SP1T1B1M1QEH</td><td>コントローラー</td></tr><tr><td>USB ケーブル</td><td>Sabrent</td><td>CB-UM63</td><td>コントローラーUSB</td></tr><tr><td>ハブ</td><td>アトラ</td><td>ハブ3.0</td><td>コントローラーをコンピューターに接続する</td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>アマシャム</td><td>56-1165-33</td><td>温度制御</td></tr><tr><td>ウォーターバスタンク</td><td>ガラスケージ</td><td>15リットルリムレスアクリル</td><td>バス呼吸器用</td></tr></tbody></table>

電量マイクロレスピロメトリーを用いたショウジョウバエのメラノガスターにおけるo2消費量の測定

Measuring O2 Consumption in Drosophila melanogaster Using Coulometric Microrespirometry

電量マイクロレスピロメトリーは、安定した環境を維持しながら、小さな生物のO2消費量を測定するための簡単で安価な方法です。電量マイクロレスピロメーターは、O2が消費され、生物によって生成されたCO2が吸収媒体によって除去される気密チャンバーで構成されています。 得られた圧力低下は電解O2生成を誘発し、生成に使用された電荷量を記録することにより、生成したO2の量を測定する。本研究では、この方法を小グループで試験したショウジョウバエのメラノガスターに適合させ、装置の感度と環境条件を高い安定性のために最適化しました。この装置で野生型ハエが消費するO2の量は、以前の研究によって測定された量と一致しています。CASK変異体による質量特異的O2消費は、より小さく、活性が低いことが知られており、コンジェニックコントロールと変わらなかった。しかし、CASK変異体のサイズが小さいため、ハエ当たりのO2消費量が大幅に減少しました。したがって、マイクロレスピロメーターは、D. melanogasterのO2消費量を測定することができ、遺伝子型間のわずかな違いを区別することができ、代謝率を測定するための汎用性の高いツールを追加します。

呼吸計コントローラの圧力と電流の出力は、1つの実験における1つのチャンバーについて図3Aに示されています。最初の長電流パルスは、チャンバーを周囲圧力(約992hPa)から事前に設定されたOFFしきい値の1017hPaまで加圧しました。ハエがO2を消費し、CO2が吸収されると、圧力はゆっくりと低下し、ON閾値の1016hPaに達すると、O2発生器を通る電流が活性化されました。示されている例では、各パルスの平均振幅は50.1mA、持続時間は16.1秒で、パルスあたり約0.81クーロン(C)の電荷移動が得られます。このチャンバーの総電荷移動は、合計時間240.0分で3.28°Cでした。ハエの質量と数(合計14.9 mgの重さのハエ23匹)の手順に記載されている計算を使用すると、このチャンバー内のグループのO2消費量は3.19 mL h-1 g-1または2.07 μL h-1 fly-1でした。
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電量呼吸法は、小さな生物の代謝率を測定するのに理想的です。本研究においてショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)に適応させた場合、測定されたO2消費量は、以前の研究によって野生型D.melanogasterについて報告された範囲内であった。CASK変異体によるハエ当たりのO2消費量は、より小さく、活性が低く、野生型よりも有意に低かった。

電量マイクロレスピロメトリーを用いたショウジョウバエのメラノガスターにおけるO2消費量の測定

Coulometric microrespirometry is a straightforward, inexpensive method for measuring the O2 consumption of small organisms while maintaining a stable ...

私たちの研究は、温度と活動が昆虫の代謝にどのように影響するかに焦点を当てています。これは、種が周囲で生き残るためにどのように進化してきたか、そして変化する世界でどのように適応し続けるかを理解するために不可欠です。この取り組みには、個々の生物の生理機能と行動を理解することが不可欠です。代謝率は、熱産生を測定することによって直接測定することも、酸素の消費量または二酸化炭素の生成を測定することによって間接的に測定することもできます。ショウジョウバエのような小さな生物による熱産生を測定することは技術的に可能ですが、間接的な方法がより一般的に使用されます。このスケールで代謝を測定する際の現在の課題には、コスト、環境の安定性、信頼性などがあります。市販のシステムは信頼性が高く、安定しており、比較的簡単に購入できますが、複雑で高価になる可能性があります。DIYマノメーターは安価ですが、誤差が生じ、実験ごとに製造が必要になることがあります。電量呼吸計は比較的安価で使いやすく、環境パラメータの便利な読み出しを提供し、すべてのコンポーネントが再利用可能です。さらに、酸素の定期的な交換により、数時間または数日間安定した環境が維持されます。研究室では、ショウジョウバエの確立された対照株間の代謝変動と、酸素消費に対する過剰および低活性変異体の影響を研究します。野外では、砂漠に適応した野生のカブトムシの代謝率と温度耐性の研究を始めます。

measuring-o2-consumption-drosophila-melanogaster-using-coulometric

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

代謝障害はヒトにおいて最も一般的な疾患の1つである。遺伝的に扱いやすいモデル生物D.キイロは、代謝を調節する新規遺伝子を同定するために使用することができる。本稿では、そのCO 2産生を測定することにより、ハエに代謝率を研究することができ、比較的簡単な方法を説明します。...

代謝率の測定に<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;呼吸計測を使用した

放射性標識基質からの二酸化炭素生成での測定<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

本稿で、ショウジョウバエのグリセリン thoraxes...

ショウジョウバエのティッシュの最小限の量を使用してのグリセリンの繊維でミトコンドリアの酸素消費量の測定

マイクロプレートフィーダーアッセイは、 ショウジョウバエの液体食品消費を定量化するための経済的で高いスループットの方法を提供します。3Dプリントされたデバイスは、ハエが1536ウェルマイクロプレートに収容される96ウェルマイクロプレートを接続し、そこからハエがトレーサー染料で給餌溶液を消費します。溶液体積の減少は分光光度測定で測定される。...

ショウジョウバエの消費定量化のための高スループットマイクロプレートフィーダアッセイ

この手法は、ライブの分子特性評価のためにプロトンMRスペクトロスコピー（HRMAS 1H -...

ライブの磁気共鳴分光法キイロショウジョウバエマジックアングルスピニングを使用して

臭気物質の嗅覚ニューロンの電気生理学的応答は、単一感覚子記録を使って昆虫で測定することができます。このビデオの記事では、ショウジョウバエの触角の単一感覚子記録を実行する方法を紹介します（...

昆虫における単一感覚子録音キイロショウジョウバエとハマダラカ</em

遺伝的にコードされoptogeneticツール内の特定の神経細胞の非侵襲的な操作を可能に...

で逃避行動のOptogenetic刺激<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

キイロショウジョウバエでは、自発運動などの行動に影響を与える遺伝的または環境的操作を研究するのに有用である。ここでは、赤外線ビームと自発運動を定量化するためのデータ解析ソフトウェアのモニターを利用したプロトコルを記述します。...

における自発運動量の測定<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

ここでは、ストレスを受けた個人の回避を定量化するためのプロトコルを提示します。このパラダイムは強力でありながらユーザーフレンドリーであり、Drosophila...

社会回避での定量化のための簡単​​なアッセイキイロショウジョウバエ

遺伝子と環境がショウジョウバエの社会空間に及ぼす影響は、強力でありながら直接的な分析パラダイムを通じて定量化することができます。...

で社会空間に影響を与える条件<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

学ぼう、電量マイクロレスピロメトリーによるDrosophila melanogasterの酸素消費量測定法。CASK変異体と野生型の比較により、遺伝的背景が代謝に与える影響を解明する実験手法を習得できます。

電量マイクロレスピロメトリーを用いたショウジョウバエのメラノガスターにおける_O2消費量の測定

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