Name: ライン走査型振動和周波数発生顕微鏡を用いたマルチモーダル非線形ハイパースペクトルケミカルイメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-01T14:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: 学ぶライン走査型振動和周波数発生顕微鏡によるマルチモーダル非線形ハイパースペクトルイメージング法。生体組織の化学組成と分子配列を高解像度で可視化し、神経科学・生物物理学研究に応用する。

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装置の開発は、Grant NSF CHE-1828666によってサポートされています。ZW、JCW、WXは、米国国立衛生研究所、国立総合医学研究所、助成金1R35GM138092-01の支援を受けています。BYは、中国科学院青年イノベーション促進協会(CAS、2021183)の支援を受けています。

VSFG顕微鏡を使用したマルチモーダル、迅速、ハイパースペクトル化学分析

著者は何も開示していません。

最も重要なステップは 1.42 から 1.44 です。光学空間分解能を得るためには、対物レンズの位置を合わせることが重要です。また、出射された信号を集めて中継し、入射スリットに走査ビームを線状に投影することも重要です。適切なアライメントにより、最高の分解能とS/N比が保証されます。SDS@2 β-CD 100 μm x 100 μm シートのような一般的なサンプルでは、高い S/N 比で高解像度の画像(~1 μm 分解能)を得るには 20 分かかります。これは、以前のバージョンの機器24,26よりもすでに高速です。より高い繰り返し率のレーザーにより、データ取得速度のさらなる向上を実現できます。
現在の限界は空間分解能であり、さらに高いNA対物レンズ光学系と潜在的な非線形光学系ベースの超解像技術によってさらに改善される可能性がある45。ヘテロダイン検出は、VSFG分光法でその相を分離し、分子配向5,46,47,48を抽出...

2次非線形光学技術1,2である振動和周波数発生(VSFG)は、対称性で許容されるサンプル3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13を化学的にプロファイリングするための分光ツールとして広く使用されています。14、15、16、17、18、19、20、21、22。従来、VSFGは界面系8,9,10,11(気液、液液、気体-固体、固液)に適用されてきましたが、VSFG活性の要件である反転対称性を欠いています。VSFGのこの応用により、埋もれた界面12,13、界面14,15,16,17,18の水分子の配置、界面19,20,21,22の化学種の豊富な分子詳細が得られました。
VSFGは、界面の分子種や配置を決定するのに強力ですが、反転中心を欠く物質の分子構造を測定する可能性はまだ十分に発揮されていませんでした。これは、材料が化学的環境、組成、および幾何学的配置において不均一である可能性があり、従来のVSFG分光計は100μm2程度の広い照明面積を有することによるものです。したがって、従来のVSFG分光法は、典型的な100μm2の照明領域におけるサンプルのアンサンブル平均情報を報告します。このアンサンブル平均化は、反対の配向を持つ整然としたドメイン間のシグナルキャンセルと、局所的な不均一性の誤った特徴付けにつながる可能性があります15,20,23,24。
色収差がほとんどない高開口数(NA)、反射型顕微鏡対物レンズ(シュワルツシルトおよびカセグレン形状)の進歩により、VSFG実験における2つのビームの焦点サイズを100μm2から1〜2μm2に、場合によってはサブミクロン25に縮小することができます。この技術的進歩を含め、私たちのグループなどはVSFGを顕微鏡プラットフォームに開発しました20,23,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36。最近、我々は、マルチモーダル画像(VSFG、第2高調波発生(SHG)、および明視野光学)のシームレスな収集を可能にする反転光学レイアウトおよび広帯域検出スキーム37を実装した。マルチモダリティイメージングにより、光学イメージング、さまざまなタイプの画像を相関させ、サンプル画像上の信号位置を特定することで、サンプルの迅速な検査が可能になります。アクロマティック照明光学系とパルスレーザー照明光源の選択により、この光学プラットフォームは、蛍光顕微鏡38やラマン顕微鏡などの追加技術を将来シームレスに統合することができます。
この新しい配置では、階層組織や分子自己組織化(MSA)のクラスなどのサンプルが研究されています。これらの材料には、コラーゲンとバイオミメティクスが含まれ、化学組成と幾何学的構造の両方が材料の最終的な機能にとって重要です。VSFGは2次の非線形光信号であるため、分子間距離やねじれ角などの分子間配列39,40に特に敏感であり、化学組成と分子配列の両方を明らかにするための理想的なツールとなる。この作業は、光パラメトリック増幅器(OPA)をポンピングするイッテルビウムドープ共振器固体レーザー、自作のマルチモーダル倒立顕微鏡および2次元荷電結合素子(CCD)検出器27に結合されたモノクロメーター周波数分析器からなるコア機器のVSFG、SHG、および明視野モダリティについて説明する。ステップバイステップの構造と位置合わせ手順、およびセットアップの完全な部品リストが提供されます。基本的な分子サブユニットが、一般的な界面活性剤である1分子のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)と、2分子のβ-シクロデキストリン(β-CD)(本明細書ではSDS@2 β-CD)で構成されるMSAの詳細な分析も、VSFGが組織化物質の分子固有の幾何学的詳細を明らかにする方法を示す例として提供されています。また、MSAの化学的特異的な幾何学的詳細は、ニューラルネットワーク関数ソルバーアプローチで決定できることも実証されています。

<table><tbody><tr><td>1 x カメラ Por</td><td>Thorlabs</td><td>WFA4100</td><td>顕微鏡または光学システムにカメラを接続する</td></tr><tr><td>25.0 mm 直角プリズムミラー、保護ゴールド</td><td>Thorlabs</td><td>MRA25-M01</td> 光<td>を反射して再帰反射を生成し、光を元の経路に沿って戻</td></tr>します <tr><td>3インチユニバーサルポストホルダー-5パック</td><td>Thorlabs</td><td>UPH3-P5</td><td>は、さまざまなサイズと構成のポストを保持し、サポート</td></tr>します <tr><td>30mmから60mmケージプレート、4mm厚</td><td>Thorlabs</td><td>LCP4S</td><td>は、30mmケージシステムと60mmケージシステムの間で変換</td></tr>します <tr><td>高さ500mmのセルナボディとエピアーム</td><td>Thorlabs</td><td>CEA1500</td>、<td>顕微鏡検査</td></tr><tr><td>でトップイルミネーション技術を可能にする機能を提供します60 mmケージマウント&Oslash;50.0 mm アイリス</td><td>Thorlabs</td><td>LCP50S</td> 光学<td>システムを通過する光の量を制御</td></tr><tr><td>60 mm ケージ取り付けブラケット</td><td>Thorlabs</td><td>LCP01B</td><td>マウントと 60 mm ケージシステムを光学セットアップに配置する</td></tr><tr><td>エアスペース Etalon</td><td>SLS Optics Ltd.</td><td>カスタマイズされた</td><td>狭帯域1030nm光を生成します&nbsp;</td></tr><tr><td>ケージプレート取り付けブラケット</td><td>Thorlabs</td><td>KCB2</td>は、<td>ミラーを正確な角度で保持および調整</td></tr>します <tr><td>CCD</td><td>Andor Technologies</td><td>Newton&nbsp;</td><td>周波数と空間分解能のための2D CCD</td></tr><tr><td>コリニア光パラメトリックアンプ</td><td>光変換</td><td>オルフェウス-One-HP</td><td>チューナブル MIDライトジェネレータ</td></tr><tr><td>塩化銅</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィッシュ</td><td>A16064.30</td><td>自己組織化コンポーネント</td></tr><tr><td>カスタマイズ ダイクロイックミラー</td><td>ニューポート</td><td>カスタマイズ</td><td>その波長または偏光に基づいて光を選択的に反射または透過します</td></tr><tr><td>Ext から M32 Int Adapter</td><td>Thorlabs</td><td>SM1A34</td><td>は互換性を提供し、異なるスレッドタイプのコンポーネント間の接続を容易にします</td></tr><tr><td>無限遠補正屈折対物レンズ</td><td>Zeiss</td><td>420150-9900-000</td><td>屈折対物レンズ</td></tr><tr><td>無限大補正 Schwarzschild Objective</td><td>Pike Technologies Inc.</td><td>891-0007</td><td>反射対物レンズ</td></tr><tr><td>レーザー</td><td>カーバイド、光変換</td><td>C18212</td><td>レーザー光源</td></tr><tr><td>M32x0.75 外部から内部へのRMS</td><td>Thorlabs</td><td>M32RMSS</td><td>、顕微鏡対物レンズのねじ切りサイズまたはタイプを適応または変換します&nbsp;</td></tr><tr><td>M32x0.75 外部 から M27x0.75 内部彫刻</td><td>Thorlabs</td><td>M32M27S</td><td>顕微鏡対物レンズのねじ切りサイズまたはタイプを適応または変換できます&nbsp;</td></tr><tr>光学素子モノクロメーターの<td>焦点を調整する</td><td>ZFM1030</td>手動<td>ミッドハイトコンデンサーフォーカスモジュール</td><td>Thorlabs</td></tr><tr><td></td><td></td><td>Shamrock 500i</td><td>は、各ラインスキャンの周波数分解能を提供し</td></tr>、<tr>エッジマウントアーム<td>Thorlabs</td>の1<td>"トラベルで電動モジュール</td>を提供し<td>ZFM2020、</td><td>イメージング対物レンズの垂直位置を制御します</td></tr><tr><td>ナノポジショナー</td><td>マッド株式会社シティラボ</td><td>MMP3</td><td>3Dサンプルステージ</td></tr><tr><td>レゾナントスキャナー</td><td>EOPC</td><td>SC-25</td><td>325Hz レゾナントビームスキャナー</td></tr><tr><td>RGBカラーCCDカメラ</td><td>Thorlabs</td><td>DCU224C</td><td>明視野カメラ、製造中止ですが、他のカメラも同様に動作します</td></tr><tr><td>RGBチューブレンズ</td><td>Thorlabs</td><td>ITL200</td><td>白色光収集</td></tr><tr><td>直角運動学ブレッドボード</td><td>Thorlabs</td><td>OPX2400</td><td>2つの固定位置を備えたスライド機構を組み込んで</td></tr>います <tr><td>直角キネマティックミラーマウント、30 mm</td><td>Thorlabs</td><td>KCB1</td>は<td>ミラーを正確な角度で保持および調整</td></tr>します <tr><td>直角キネマティックミラーマウント、60 mm</td><td>Thorlabs</td><td>KCB2</td>は<td>ミラーを正確な角度で保持および調整します</td></tr><tr><td>SM2、Cernaフォーカシングステージ用60mmケージアーム</td><td>Thorlabs</td><td>CSA2100</td><td>コンデンサー</td></tr><tr><td>をしっかりと取り付けて配置します60 mmケージ用スナップオンケージカバー、24インチ</td>、<td>Thorlabs</td><td>C60L24</td>は、<td>ケージ内のコンポーネントを囲み、保護</td></tr>します ド<tr><td>デシル硫酸ナトリウム</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>J63394。AK</td><td>自己組立式コンポーネント</td></tr><tr><td>1インチCernaトラベルステージ用3チャンネルコントローラーとノブボックス</td><td>Thorlabs</td><td>MCM3001</td><td>コントロールZFM2020</td></tr><tr><td>チューブレンズ</td><td>Thorlabs</td><td>LA1380-AB - N-BK7</td><td>SFG信号収集</td></tr><tr><td>可視LEDセット</td><td>Thorlabs</td><td>WFA1010</td><td>イメージングセットアップで照明を提供</td></tr><tr><td>ホワイトライトソース</td><td>Thorlabs</td><td>WFA1010</td><td>明視野イメージング用白色光光源</td></tr><tr><td>WPH05M-1030 - &Oslash;1/2 "ゼロオーダー半波プレート、&Oslash;1インチマウント、1030 nm&nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>WPH05M-1030</td>は<td>、それを通過する光の偏光状態を変更します</td></tr><tr><td>WPLQ05M-3500-&Oslash;1/2インチマウント低次クォーターウェーブプレート、3.5&マイクロ;m&nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>WPLQ05M-3500</td>は<td>、それを通過する光の偏光状態を変更します</td></tr><tr><td>X軸ロングトラベルスチール拡張コンタクトスライドステージ</td><td>Optosigma</td><td>TSD-65122CUU</td><td>ポジショニングステージは、水平(X)方向に拡張移動を提供します</td></tr><tr><td>XT95 4インチレールキャリア</td><td>Thorlabs</td><td>XT95RC4</td><td>マウントし、光学部品</td></tr><tr><td>を配置します X-Y軸平行移動ステージW / 360度回転</td><td>Thorlabs</td><td>XYR1</td><td>2次元のオブジェクトの正確な動きと位置決め、およびプラットフォーム</td></tr><tr><td>XY(1/2 ")を回転させる能力とともに、中央SM1スルーホール</td><td>Thorlabs</td><td>XYT1</td>は<td>、2次元での正確な動きと位置決めを提供します</td></tr><tr><td>Ybドープ固体レーザー</td><td>光変換</td><td>CB3-40W</td><td>シードレーザー</td></tr><tr><td>&beta;-シクロデキストリン</td><td>サーモフィッシャー科学的な</td><td>J63161.22</td><td>自己組織化コンポーネント</td></tr></tbody></table>

ライン走査型振動和周波数発生顕微鏡を用いたマルチモーダル非線形ハイパースペクトルケミカルイメージング

Multimodal Nonlinear Hyperspectral Chemical Imaging Using Line-Scanning Vibrational Sum-Frequency Generation Microscopy

2次の非線形光信号である振動和周波数発生(VSFG)は、~100μmの空間分解能を持つ分光法として、界面の分子を研究するために伝統的に使用されてきました。ただし、分光法はサンプルの不均一性に敏感ではありません。メゾスコピック的に不均一なサンプルを研究するために、私たちは他の研究者とともに、VSFG分光法の分解能の限界を~1μmレベルまで下げ、VSFG顕微鏡を構築しました。このイメージング技術は、イメージングによってサンプルの形態を分解できるだけでなく、画像のすべてのピクセルで広帯域のVSFGスペクトルを記録することもできます。2次非線形光学技術であるため、その選択規則により、生物学、材料科学、生物工学などで一般的に見られる非中心対称またはキラルな自己組織化構造を可視化できます。本稿では、固定されていないサンプルのイメージングを可能にする倒立透過設計について説明します。また、この研究は、VSFG顕微鏡をニューラルネットワーク関数ソルバーと組み合わせることで、個々の自己組織化シートの化学的特異的な幾何学的情報を解像できることも示しています。最後に、さまざまなサンプルの明視野、SHG、およびVSFG構成で得られた画像は、VSFGイメージングによって明らかにされる固有の情報について簡単に説明します。

<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65388/65388fig05.jpg"> 図5:SDS@β-CDの分子構造、形態、ポテンシャル配向 。 (A)SDS@β-CDの上面図と(B)側面図の化学構造。(C)試料面上のメソスケールシートの代表的な不均質な試料分布。分子サブユニットは、基質上で異なる配向とアライメントを持つ可能性がありますが、これは不明です。この図は Wagner et al.27 から修正されたものである。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65388/65388fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるに...

広帯域振動和周波数発生(VSFG)画像と明視野第2高調波発生(SHG)イメージングモダリティを取得するために、マルチモーダルで高速ハイパースペクトルイメージングフレームワークが開発されました。赤外線周波数は分子振動と共鳴するため、対称性が許容されるサンプルの微視的構造およびメゾスコピックな形態学の知識が明らかになります。

Vibrational sum-frequency generation (VSFG), a second-order nonlinear optical signal, has traditionally been used to study molecules at interfaces as a ...

生体組織などのメゾスコピック的に不均質な自己組織化試料を研究し、その化学組成や分子配列を明らかにすることを目指しています。私たちは、これらの自己材料の微視的な配置とメゾスコピックな形態が、それらの微視的な性質とどのように関連しているかを探求しています。高開口数と反射型顕微鏡対物レンズの進歩により、ソフトマテリアルの画像を記録すると同時にスペクトルを空間的に分解し、いわゆるハイパースペクトル画像を形成することができる、1平方ミクロン分解能の振動和周波数発生顕微鏡を実証しました。ハイパースペクトルイメージングは、実験データを複数の次元で記録し、2つは空間で、1つは頻度で、場合によっては1つは時間で記録します。しかし、このようなビッグデータを迅速に収集、保存、分析し、情報を最大限に活用することは、依然として課題となっています。また、有用なデータポイントを収集するためだけに画像をサンプリングすることも困難です。より高速なラインスキャン技術を開発することで、データ収集時間を100倍に短縮することができました。さらに、この顕微鏡は、和周波数発生(SFG)、第2高調波発生(SHG)、広視野イメージングに対応しています。マルチモダリティイメージングにより、光学イメージングとさまざまな画像モダリティの相関を使用してサンプルを迅速に検査できます。SHGイメージングは、私たちの技術の光学技術を支援しますが、スペクトル分解能を持たないため、生物物理学で広く使用されています。当社のSFG顕微鏡は、軟部組織の生物物理学的研究に現在欠けている強力な分子レベルの洞察を提供できるようになります。

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Research

JoVE Journal

Chemistry

化学

スペクトルイメージングは、単一のサンプルで複数の蛍光信号を同定および分離するための信頼性の高いソリューションとなり、目的の信号と背景または自己蛍光を容易に区別できます。励起スキャンハイパースペクトルイメージングは、信号対雑音比を同時に増加させながら、必要な画像集録時間を短縮することで、この技術を向上させます。...

蛍光信号を効率的に判別する励起走査察ハイパースペクトルイメージング顕微鏡

本原稿では、レーザー走査顕微鏡とのSRS実験セットアップの統合により得られる刺激ラマン散乱(SRS)顕微鏡の実装について説明する。SRS顕微鏡は2つのフェムト秒(fs)レーザー源、Ti-Sapphire(Ti:Sa)および同期光学パラメトリック発振器(OPO)に基づいている。...

刺激されたラマン散乱に基づく非線形顕微鏡の実施

本稿では、スペクトル集束モジュールとデュアル出力パルスレーザーを統合し、金ナノ粒子と癌細胞の高速ハイパースペクトルイメージングを可能にする方法について説明します。この研究は、標準的なレーザー走査型顕微鏡でマルチモーダル非線形光学技術の詳細を実証することを目的としています。...

マルチモーダル非線形光学顕微鏡を用いたナノ粒子の細胞取り込みの生体分子イメージング

この論文では、同じ顕微鏡プラットフォームに統合された誘導ラマン散乱(SRS)とコヒーレント抗ストークスラマン散乱(CARS)の解像度、感度、イメージングコントラストを直接比較します。結果は、CARSの空間分解能が優れており、SRSはコントラストとスペクトル分解能が優れており、どちらの方法も感度が類似していることを示しています。...

化学イメージングのためのハイパースペクトル刺激ラマン散乱とコヒーレントアンチストークスラマン散乱顕微鏡の直接比較

我々は、広帯域刺激ラマン散乱(SRS)顕微鏡で化学画像を取得するためのプロトコルを提示する。差動マルチチャンネルロックイン検出で動作するSRS顕微鏡に基づいて、このプロトコルは、サンプル調製、SRS装置の調整、および化学的に不均一なサンプルの異なる成分を解きほぐすためのケモメトリックスを記述しています。...

広帯域刺激ラマン散乱顕微鏡に基づく多重化学イメージング

ラベルフリーの光学イメージングモダリティを組み合わせたマルチモーダルプラットフォームを利用して、細胞のダイナミクスと代謝を視覚化および定量化するためのプロトコルを開発しました。多光子蛍光、第2高調波発生、および誘導ラマン散乱顕微鏡によるイメージングを通じて、細胞および分子環境の全体像を生成することができます。...

細胞代謝研究のためのマルチモーダル光学イメージングプラットフォーム

コンパクトで超安定な複屈折干渉計に基づく広視野フーリエ変換顕微鏡により、2D検出器のすべてのピクセルのスペクトルを並列取得できます。時間領域アプローチにより、光発光およびラマン信号の解消が可能となり、空間分解能は約1μm、スペクトル 分解能は23cm1で高速ラマンマッピング(約5...

マルチモーダル広視野フーリエ変換ラマン顕微鏡

このプロトコルは、レーザー光源の生成方法、組織サンプルの調製方法、イメージングの実施方法、およびデータの分析方法の詳細を含む、同時ラベルフリー自家蛍光多重高調波(SLAM)顕微鏡技術のステップバイステップガイドを提供します。SLAMは、組織微小環境を調査するために4つの相補的なラベルフリーコントラストを測定することにより、非線形顕微鏡を進歩させます。...

同時ラベルフリー自家蛍光多高調波顕微鏡

ラディカルベースの​​生体模倣化学、バイオマーカー開発のために必要な建物のアップライブラリに適用されています。...

ケミカルバイオロジーのフリーラジカル：化学的挙動からバイオマーカー探索·開発へ

ナイルレッド染色手順を使用して藻の中性脂質含有量を決定するための簡単​​なプロトコルが記載されている。この時間節約の技術は、従来の重量ベースの脂質定量化プロトコルに代わるものを提供しています。これは、バイオプロセスの性能を監視する特定の用途のために設計されている。...

蛍光を用いて藻体で中性脂肪を測定するための簡単​​かつ迅速なプロトコル

学ぶライン走査型振動和周波数発生顕微鏡によるマルチモーダル非線形ハイパースペクトルイメージング法。生体組織の化学組成と分子配列を高解像度で可視化し、神経科学・生物物理学研究に応用する。

ライン走査型振動和周波数発生顕微鏡を用いたマルチモーダル非線形ハイパースペクトルケミカルイメージング

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