Name: イメージングマイクロプレート中のプレキャストポリ(エチレングリコール)(PEG)ヒドロゲルを用いた血管化骨形成骨髄ニッチの簡単な確立 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-19T14:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: 学ぶ PEGヒドロゲルを用いた血管化骨髄ニッチの構築法。hBM-MSCとGFP-HUVECを逐次播種し、成長因子の影響を評価するハイスループットモデルを確立します。

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著者らは、リキッドハンドリングデバイスの技術支援を提供してくれたRiccardo Urbanetと、落射蛍光顕微鏡法のサポートを提供してくれたRodi Odabasiに感謝したいと思います。この研究は、スイス国立科学財団(助成金番号310030E_202429および205321_204318)とEctica Technologies AGによって資金提供されました。

3D 共培養アッセイ:がん薬物スクリーニングのための血管新生骨形成ニッチ

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<li>Calvi, L. M., Link, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+complexity+of+the+bone+marrow+hematopoietic+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Calcified+Tissue+International%22%5BJournal%5D)">Cellular complexity of the bone marrow hematopoietic stem cell niche.</a> Calcified Tissue International. 94 (1), 112-124 (2014).</li>
<li>Behrmann, L., Wellbrock, J., Fiedler, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+myeloid+leukemia+and+the+bone+marrow+niche-take+a+closer+look%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Acute myeloid leukemia and the bone marrow niche-take a closer look.</a> Frontiers in Oncology. 8, 444(2018).</li>
<li>Yip, R. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammary+tumour+cells+remodel+the+bone+marrow+vascular+microenvironment+to+support+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Mammary tumour cells remodel the bone marrow vascular microenvironment to support metastasis.</a> Nature Communications. 12 (1), 6920(2021).</li>
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<li>Traore, M. A., George, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+the+vascular+tree%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+B%2C+Reviews%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering the vascular tree.</a> Tissue Engineering. Part B, Reviews. 23 (6), 505-514 (2017).</li>
<li>Bessy, T., Itkin, T., Passaro, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineering+the+bone+marrow+vascular+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Bioengineering the bone marrow vascular niche.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 645496(2021).</li>
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<li>Montano, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+human+capillaries+in+vitro%3A+The+engineering+of+prevascularized+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Formation of human capillaries in vitro: The engineering of prevascularized matrices.</a> Tissue Engineering Part A. 16 (1), 269-282 (2010).</li>
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<li>Kleinman, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basement-membrane+complexes+with+biological-activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Basement-membrane complexes with biological-activity.</a> Biochemistry. 25 (2), 312-318 (1986).</li>
<li>Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R., Lawley, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+laminin+and+basement-membrane+in+the+morphological-differentiation+of+human-endothelial+cells+into+capillary-like+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Role of laminin and basement-membrane in the morphological-differentiation of human-endothelial cells into capillary-like structures.</a> Journal of Cell Biology. 107 (4), 1589-1598 (1988).</li>
<li>Davis, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+vascular+tube+morphogenesis+and+maturation+in+3D+extracellular+matrices+by+endothelial+cells+and+pericytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Control of vascular tube morphogenesis and maturation in 3D extracellular matrices by endothelial cells and pericytes.</a> Methods in Molecular Biology. 1066, 17-28 (2013).</li>
<li>Jeon, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+3D+vascularized+organotypic+microfluidic+assays+to+study+breast+cancer+cell+extravasation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (1), 214-219 (2015).</li>
<li>Bersini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+3D+in+vitro+model+for+specificity+of+breast+cancer+metastasis+to+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A microfluidic 3D in vitro model for specificity of breast cancer metastasis to bone.</a> Biomaterials. 35 (8), 2454-2461 (2014).</li>
<li>Wang, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+anastomosis+between+living+capillary+networks+and+endothelial+cell-lined+microfluidic+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Engineering anastomosis between living capillary networks and endothelial cell-lined microfluidic channels.</a> Lab on a Chip. 16 (2), 282-290 (2016).</li>
<li>Phan, D. T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vascularized+and+perfused+organ-on-a-chip+platform+for+large-scale+drug+screening+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A vascularized and perfused organ-on-a-chip platform for large-scale drug screening applications.</a> Lab Chip. 17 (3), 511-520 (2017).</li>
<li>Lutolf, M. P., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+biomaterials+as+instructive+extracellular+microenvironments+for+morphogenesis+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering.</a> Nature Biotechnology. 23 (1), 47-55 (2005).</li>
<li>Kyburz, K. A., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+mimics+of+the+extracellular+matrix%3A+How+simple+is+complex+enough%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Synthetic mimics of the extracellular matrix: How simple is complex enough.</a> Annals of Biomedical Engineering. 43 (3), 489-500 (2015).</li>
<li>Ehrbar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+formation+of+modular+cell-instructive+fibrin+analogs+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Enzymatic formation of modular cell-instructive fibrin analogs for tissue engineering.</a> Biomaterials. 28 (26), 3856-3866 (2007).</li>
<li>Ehrbar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomolecular+hydrogels+formed+and+degraded+via+site-specific+enzymatic+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Biomolecular hydrogels formed and degraded via site-specific enzymatic reactions.</a> Biomacromolecules. 8 (10), 3000-3007 (2007).</li>
<li>Blache, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+role+of+mesenchymal+stem+cells+allows+for+microvascularized+bone+tissue-like+environments+in+PEG+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Dual role of mesenchymal stem cells allows for microvascularized bone tissue-like environments in PEG hydrogels.</a> Advanced Healthcare Materials. 5 (4), 489-498 (2016).</li>
<li>Blache, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch-inducing+hydrogels+reveal+a+perivascular+switch+of+mesenchymal+stem+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+Reports%22%5BJournal%5D)">Notch-inducing hydrogels reveal a perivascular switch of mesenchymal stem cell fate.</a> Embo Reports. 19 (8), e45964(2018).</li>
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<li>Zhang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+hydrogels+featuring+in-depth+surface+density+gradients+for+the+simple+establishment+of+3d+tissue+models+for+screening+applications%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discovery%22%5BJournal%5D)">Soft hydrogels featuring in-depth surface density gradients for the simple establishment of 3d tissue models for screening applications.</a> SLAS Discovery. 22 (5), 635-644 (2017).</li>
<li>Martin, I., Muraglia, A., Campanile, G., Cancedda, R., Quarto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor-2+supports+ex+vivo+expansion+and+maintenance+of+osteogenic+precursors+from+human+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor-2 supports ex vivo expansion and maintenance of osteogenic precursors from human bone marrow.</a> Endocrinology. 138 (10), 4456-4462 (1997).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Carpentier, G., Martinelli, M., Courty, J., Cascone, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+Analyzer+for+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%224th+ImageJ+User+and+Developer+Conference%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis Analyzer for ImageJ.</a> 4th ImageJ User and Developer Conference. , Mondorf-les-Bains, Luxembourg. 198-201 (2012).</li>
<li>Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Globally+optimal+stitching+of+tiled+3D+microscopic+image+acquisitions%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions.</a> Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).</li>
<li>Yamada, K. M., Cukierman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+tissue+morphogenesis+and+cancer+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D.</a> Cell. 130 (4), 601-610 (2007).</li>
<li>Loebel, C., Mauck, R. L., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+nascent+protein+deposition+and+remodelling+guide+mesenchymal+stromal+cell+mechanosensing+and+fate+in+three-dimensional+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Local nascent protein deposition and remodelling guide mesenchymal stromal cell mechanosensing and fate in three-dimensional hydrogels.</a> Nature Materials. 18 (8), 883-891 (2019).</li>
<li>Curtis, M. B., Kelly, N., Hughes, C. C. W., George, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+stromal+cells+impact+endothelial+cell+transcriptome+in+3D+microvessel+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Organotypic stromal cells impact endothelial cell transcriptome in 3D microvessel networks.</a> Scientific Reports. 12 (1), 20434(2022).</li>
<li>Wust, R., Terrie, L., Muntefering, T., Ruck, T., Thorrez, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+co-isolation+of+microvascular+endothelial+cells+and+satellite+cell-derived+myoblasts+from+human+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Efficient co-isolation of microvascular endothelial cells and satellite cell-derived myoblasts from human skeletal muscle.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 964705(2022).</li>
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エクティカ・テクノロジーズAGは、3DProSeedヒドロゲルウェルプレートのメーカーであり、商業的利益を有しています。Benjamin R. SimonaとMartin EhrbarはEctica Technologies AGの株主です。

ここでは、骨および骨髄生物学研究、組織工学、および癌研究においてさまざまな用途を有する、完全に合成および制御可能な3D PEGベースのマトリックスにおける高度に血管新生された骨および骨髄ニッチの in vitro モデルを確立するためのプロトコルについて説明します。このモデルは、RGDペプチドおよびMMP切断部位で官能化され、ガラス底96ウェルイメージングプレート30上に詳細な密度勾配でキャストされる合成PEGベースのヒドロゲル上に構築される。このプラグアンドプレイプラットフォームは、細胞をヒドロゲルにカプセル化することなく、高度に相互接続された3Dセルラーネットワークの確立を可能にすることが示されました。先に説明した細胞カプセル化プロトコルと同様に、この研究では、細胞型特異的微小環境を作り出すための細胞固有のECM28 による基質のリモデリングを示す。したがって、この方法では、再現性の高い有機型3D培養条件下で、薬物スクリーニングアッセイおよびハイコンテント分析を容易に実施することができる。ガラス底の96ウェルプレートと光学的に透明なヒドロゲルにより、このプラットフォームはリキッドハンドリングオートメーションとハイスループット顕微鏡と互換性があります。
骨形成性血管骨髄ニッチを生成する最初のステップは、少なくとも3日間のPEGヒドロゲル上でのhBM-MSCの前培養です。この間、それらはヒドロゲルに付着し、それを貫通し、そして細胞間接触およびECM沈着を確立し始める。hBM-MSCをシードする前に、ストレージバッファーを除去する必要があります。ヒドロゲルは96ウェルイメージングプレートの標準ウェル内のインナーウェル内にあるため、インナーウェルリングに触れるまでウェルの側面に沿って吸引チップを挿入しても安全です。真空ポンプは、吸引力をできるだけ低く設定すれば吸引に使用できます。あるいは、ノズルの高さを内側のウェルリングから少なくとも0.8mm上に調整した自動プレートウォッシャーを使用して、ヒドロゲルプレートからバッファーを吸引することができます。液体処理に自動化を使用すると、ヒドロゲル表面への損傷を最小限に抑え、結果として得られる培養物の再現性を高めることができます。細胞がヒドロゲル上に沈降すると、ヒドロゲル表面の小さな欠陥が見えるようになり、欠陥のあるヒドロゲル領域の下部焦点面に現れる。したがって、0日目に参照画像を取得することは、細胞播種の均一性およびヒドロゲル表面完全性のための良好な品質管理として役立つ。小さなヒドロゲル表面の欠陥はウェルのさらなる使用を妨げるものではないが、細胞は欠陥領域にクラスター化する傾向があり、非代表的なパターンに成長するか、またはより迅速に底部ガラスに到達し、そこで単層に成長する可能性がある。これらのアーティファクトは、これらの井戸を使用/評価する際に注意する必要があります。同様の考慮事項は、アッセイの全期間中に実施される培地の変更にも適用されます。
プロトコルの第2ステップでは、予め形成されたhBM-MSC単培養(共培養の0日目)にGFP-HUVECを添加する。hBM-MSCによって寄託されたECMは、内皮細胞の増殖のための大きな足場を提供し、この研究では、hBM-MSC馴化培地の存在下でも、ヒドロゲル上に丸い細胞クラスターを形成することしかできませんでした(図示せず)。hBM-MSC培養物に播種すると、HUVECは統合され、細胞カプセル化によって生成された共培養で観察されたものに匹敵する微小血管様構造を形成します27,28。通常、よく発達した3D微小血管様ネットワークは共培養から4日以内に形成され、これはGFP標識HUVECを使用して縦断的に監視できます。これらの構造は、培養中に少なくとも7日間維持することができ、抗血管新生薬のスクリーニングなどの治療に応答して血管網組織の変化を追跡するのに十分な時間があることを意味する。内皮ネットワークの形態学的要素は、ImageJ33の血管新生分析プラグインなどの確立されたツールを使用してGFP画像をセグメント化することにより、バッチモードで定量化することができ、それらのパラメータを使用して、例えば、薬効および薬力学を評価することができる。
多くの潜在的な用途のための記載された細胞モデルの1つの重要な利点は、その可塑性である。培地に異なる成長因子を補充するだけで、共培養の外観を変えることができます。例えば、単培養および共培養期間を通してBMP-2が存在すると、骨形成血管ニッチが生成し、ALP活性の増加、細胞外カルシウム沈着、ならびにECMアセンブリおよび沈着を示す。それどころか、FGF-2の存在下では、骨形成マーカーは存在せず、共培養はより少ない側方細胞会合を形成するが、より顕著な3D細胞増殖を示す。FGF-2がALP活性を抑制し、BMP-2が成長因子処理なしと比較してより強いALP活性を誘発するという事実は、以前の観察と一致しています27。しかし、hBM-MSC間質成分のこれらの大きな違いにもかかわらず、微小血管網の範囲は、この研究における2つの成長因子処理条件において非常に類似していた。対照培養では、ほんの少しの短い血管網しか形成されず、おそらく血管新生が不十分な骨髄ニッチを表しています。これは、培地に添加する成長因子の種類、濃度、およびタイミングを変更するだけで、比較研究に必要な、明確に定義された血管化骨髄ニッチの範囲を製造できることを示唆しています。ただし、再現性のある結果を得るには、培養の進行と形態が使用する細胞の履歴(たとえば、日常の培養メンテナンス中に使用される継代数や剥離方法)によって異なる場合があり、アッセイ設計中にそのような要因を制御することをお勧めします。
ここでは、このモデルの最初のアプリケーションとして、10 μg/mLのベバシズマブによる治療に対する操作された微小血管ネットワークの感度を示します。特に、ネットワークが発達していない画像ではアーチファクトが生成されることが多いため、使用するアルゴリズムが内皮ネットワークを正確に認識できることを確認することが重要です。この場合、画像処理に使用されるパラメータ(セグメンテーション前とセグメンテーション中)は、多くの場合試行錯誤しながら微調整する必要があります。
第2の応用として、間葉系細胞、内皮細胞、がん細胞の逐次播種によって形成される高度な共培養モデルを紹介します。このモデルは、転移中の重要な要因である可能性のある癌細胞、間質、および骨髄の血管系の間の相互作用を研究することを可能にします。さらに、このモデルは、薬物スクリーニングアプリケーションや、血管新生以外の標的を持つ化合物の試験に使用できます。
2D培養では、細胞は生理学的微小環境シグナルを受け取らず、天然に存在する細胞形態を獲得せず、その結果、ネイティブ3D環境の細胞とは異なる方法で分化します35。操作された3Dヒドロゲルで増殖させると、細胞は早い段階で固有のECMを沈着させ、接着部位を提供し、積極的に改造することができます28,36。ここでは、スクリーニングアプリケーション用の簡略化された3Dモデルを確立するために、血管形成細胞を操作されたヒドロゲルの表面に播種し、灌流のない状態で血管ネットワークを確立させました。画像ベースの評価は、血管構造に寄与する内皮細胞の2D投影について実施されました。しかし、共焦点画像のみが、FGF-2刺激サンプルと比較して、BMP-2刺激サンプルにおける3D血管網の目立たない内部成長を明らかにした。これは、形成された血管構造の長さが過小評価されていたが、それらの接続性が過大評価されていたことを示唆している。さらに、血管周囲細胞と内皮細胞の間の相互作用と血管内腔形成は調査されていません。これらの側面は、特に薬物治療反応の観点から、さらなる注意を必要とするでしょう。最後に、最初に広範な3D血管ネットワークを確立し、次にそれらの骨形成分化を誘導するための洗練されたプロトコルは、より生理学的な骨および骨髄モデルを生成するために望ましいでしょう。
全体として、ここに示すモデルは非常に用途が広く、特定のアプリケーションに合わせて簡単に調整できます。例えば、異なる供給源からの間葉系細胞および内皮細胞を使用することができる。脂肪組織MSCおよび臍帯MSCは、BM-MSCと比較して異なる血管新生因子を発現することが知られており、代替間質成分として容易に置換することができる37。すでに定義された骨髄ニッチから単離された内皮細胞も、HUVECの代わりに使用することができる。また、血管新生筋共培養で最近提案されているように、個別化医療アプリケーションのために、患者由来の一致する骨髄間葉系細胞と内皮細胞との共培養を確立することもできます38。さらに、ヒドロゲルプレートの設計により、明視野顕微鏡と蛍光顕微鏡の両方で培養を縦方向に監視できるため、用途に応じて培養時間を短縮または延長することができます。あるいは、播種に使用される細胞密度を適宜調整して、このプロトコルよりも短いまたは長い観察時間が必要な場合に、細胞ネットワークの形成を加速または遅延させることができます。いずれにせよ、ヒドロゲルの収縮および最終的な細胞剥離につながる可能性があるシート状構造への細胞の過剰増殖を避けるために注意が必要である。
最後に、このモデルを使用して幅広いアッセイを実行できます。生培養または固定培養で実施される免疫蛍光および顕微鏡検査に加えて、3D培養物を酵素的に消化することができ、細胞を回収して任意のタイプの生化学的アッセイに供することができる。ここでは、比色/蛍光アッセイを使用して細胞ライセート中のALP活性の測定とDNA含有量の定量を示しますが、このシステムはPCR、RNAseq、プロテオミクスなど、他の多くの技術と互換性があります。目的のアッセイの感度がそれほど高くない場合は、複数のウェルからのサンプルをプールして、アッセイに利用可能なサンプルの量を増やすことができます。所望の用途がより速いゲル溶解を必要とする場合、プレート上のすべてのウェルがこのように使用されると仮定して、プレートの軌道振とうを少量の消化溶液と組み合わせて適用し、ウェル内の渦形成を確実にすることができる(生きている培養はそのような過酷な取り扱いに敏感である)。要約すると、ここでは、説明どおりに使用された場合、骨形成血管ニッチの重要な側面を要約する in vitro モデルの生成を保証するだけでなく、オーダーメイドのアプリケーション用に変更するのに十分な汎用性を備えたプロトコルを紹介します。

骨と骨髄は、人間の健康の中心となる構造的および機能的に複雑な器官です。これは、造血と骨の維持を調節する明確なニッチの存在によって反映されています1。健康な骨髄では、造血幹細胞と骨格幹細胞、ならびにそれらの子孫の維持と拡大が、異なるニッチによって制御されていることが現在広く受け入れられています。これらのニッチは、骨系細胞、間葉系幹細胞、内皮および血管周囲細胞、神経細胞およびグリア細胞、脂肪細胞、破骨細胞、マクロファージ、好中球など、さまざまな細胞タイプで構成されています2。当然のことながら、これらの主に血管系に関連するニッチは、さまざまな種類の白血病の発症にも関与しており3、さまざまな癌の転移部位です4。骨形成、リモデリング、および骨(骨髄)の維持におけるその特定の役割のために、骨関連血管系は、体の他の場所で見られる血管系とは異なる明確な特殊な構造を持っています5,6,7。したがって、全身に適用される抗血管新生または血管系調節薬は、これらの特殊な環境内で異なる効果を有し得る8。したがって、骨および骨髄の生理学的特性の維持、骨および骨髄の再生、ならびに治療的処置への応答に関与する分子機構を調査するためのモデルが非常に望ましい。
古典的な2次元(2D)組織培養と動物モデルを使用したin vivo調査は、骨と骨髄の発生に関与するさまざまな細胞と分子プレーヤーの役割に関する貴重な洞察を提供しました9,10。関連するヒト細胞を用いたハイスループット実験を可能にするモデルは、これらの非常に複雑なシステムで選択されたパラメータを調節する方法についての理解を深める可能性があります。
過去10年間で、組織工学から派生した原理が3D組織モデルを生成するために採用されてきました11,12。これらは主に、3D単培養または共培養を確立するために、組織関連細胞を生体材料にカプセル化することに依存してきました13。最も使用されている生体材料の中には、フィブリン14、コラーゲン15、およびマトリゲル16,17があり、これらはすべて生体適合性が高く、多くの細胞タイプの増殖に適した条件を提供します。これらの生体材料は、in vivoで見られるさまざまな血管ニッチの重要な側面を再現するin vitroモデルを生成する能力を持っています18。さらに、灌流された血管骨および骨髄モデルを生成するためのマイクロ流体デバイスの使用は、より複雑なin vitroモデルの生成に寄与している19、20、21、22。
天然に存在する生体材料の組成を制御し、特性を設計することの難しさは、予測可能な物理的、化学的、および生物学的特性で合理的に設計できる合成類似体の開発に影響を与えました23,24。我々は、RGDペプチドおよびマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)切断部位で機能化され、細胞の付着およびリモデリングを容易にする完全合成第XIII因子(FXIII)架橋ポリ(エチレングリコール)(PEG)ベースのヒドロゲルを開発しました25,26。これらの生体材料のモジュール設計は、3D血管化骨および骨髄モデルの形成のための条件を最適化するために首尾よく使用されている27、28。
多数の異なる培養条件や新しい治療法の試験には、より高いスループット能力を備えたモデルが必要です。最近、PEGヒドロゲルのFXIII架橋が、詳細なヒドロゲル剛性勾配が形成されるような電気化学的プロセスによって制御できることを示しました29。細胞がそのようなヒドロゲルの上に添加されると、それらは内部に向かって移動し、徐々に高度に相互接続された3Dセルラーネットワーク30に発達する。通常、他の3Dスキャフォールドとともに存在するヒドロゲルに細胞をカプセル化する必要がなくなるため、実験デザインが簡素化されるだけでなく、異なる時点で異なる細胞タイプを順次追加して、複雑な共培養システムを生成できます。これらのヒドロゲルは、ガラス底の96ウェルイメージングプレートにプレキャストできるため、手動および自動の細胞播種プロトコルで3D培養の確立が可能です。PEGヒドロゲルの光学的透明性により、プラットフォームは顕微鏡と互換性があります。
ここでは、このすぐに使用できる合成プラグアンドプレイプラットフォーム内で血管新生骨形成ニッチを生成および特性評価するための簡単な方法を紹介します。血管網の発達は、in vitro骨形成の誘導に一般的に使用される成長因子である骨形成タンパク質-2(BMP-2)で刺激され、骨形成分化は線維芽細胞成長因子2(FGF-2)の補給によって防止できることを示しています27,31。形成されるネットワークは、FGF-2刺激ネットワークと比較すると、全体的な外観、ならびに細胞およびECM分布の点で異なる。また、アルカリホスファターゼをマーカーとして骨形成誘導をモニターした。このマーカーの発現が経時的に増加していることを実証し、定性的および定量的方法を使用してFGF-2刺激ネットワークでの発現と比較します。最後に、このモデルの生成されたニッチが2つの潜在的なアプリケーションに適していることを実証します。まず、予め形成されたニッチにベバシズマブを添加し、その存在下で血管網の分解をモニタリングすることにより、概念実証薬物感受性アッセイを実施しました。次に、MDA-MB-231乳がんとU2OS骨肉腫細胞を予め形成された骨形成ニッチに添加し、これらのニッチを使用してがん細胞とその環境との相互作用を研究できることを示しました。

<table><tbody><tr><td>0.25% トリプシン-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>2 mL マイクロチューブ</td><td>エッペンドルフ</td><td>30120094</td><td></td></tr><tr><td>2-アミノ-2-メチル-1-プロパノール</td><td>シグマ</td><td>A9199</td><td></td></tr><tr><td>3DProSeed ハイドロゲル ウェル プレート</td><td>Ectica Technologies</td><td>ECT.PS1.001.096</td><td></td></tr><tr><td>4-ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩六水和物</td>シ<td>グマ</td><td>71768</td><td></td></tr>アリ<tr><td>ザリンレッドS</td><td>シグマ</td><td>A5533</td><td></td></tr>抗<tr><td>コラーゲンIV抗体</td>アブ<td>カム</td><td>ab6311</td><td></td></tr><tr><td>アンチラミニン1 + 2抗体</td>アブ<td>カム</td><td>ab7463</td><td></td></tr><tr><td>自動プレートウォッシャーAgilent</td><td>Biotek</td><td>EL&chi;50</td><td></td></tr><tr><td>自動洗浄機/ディスペンサー</td><td>Agilent Biotek</td><td>MULTIFLO FX 蠕動ポンプを装備 5uL カセット</td><td></td></tr><tr><td>ベバシズマブ</td><td>Evidentic</td><td>ID PS-E07-2019-00119 A009</td><td></td></tr><tr><td>BMP-2</td><td>Peprotech</td><td>120-02C</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>AppliChem</td><td>A1391</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>Eppendorf</td><td>5415 R</td><td>で 2 mL チューブを遠心分離するALP分析中の16100 x g</td></tr><tr><td>共焦点レーザー走査顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>ステラリス5</td><td></td></tr><tr><td>コニカル50 mL遠心チューブ</td><td>TPP</td><td>91050</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>シグマ</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>DyLight 649 ロバ抗ウサギIgG(最小限のx反応性)抗体</td><td>Biolegend</td><td>406406</td><td></td></tr><tr><td>DyLight 649ヤギ抗マウスIgG(最小限のX反応性)抗体</td><td>Biolegend</td><td>405312</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2</td><td>ロンザ</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>落射蛍光顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>DMI6000B</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10500-064</td><td></td></tr><tr><td>FGF-2</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>フィブロネクチン (IST-9)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-59826</td><td></td></tr><tr><td>GFP-HUVECs</td><td>PELOBiotech</td><td>PB-CAP-0001GFP</td><td></td></tr><tr><td>hBM-MSCs</td><td>-</td><td>-</td><td>University Hospital Baselで分離。Papadimitropoulos A、Piccinini E、Brachat S、他。直接灌流下での3D足場ベースのシステムにおける新鮮な骨髄からのヒト間葉系間質細胞の増殖。プロスワン。2014;9(7):e102359</td></tr><tr><td>倒立顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td>200M</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231 乳がん細胞株</td><td>-</td><td></td><td>J Massagu&eacute から提供、メモリアル・スローン・ケタリングがんセンター</td></tr><tr><td>MEM&alpha;</td><td>Gibco</td><td>22571-038</td><td></td></tr><tr><td>マルチモードイメージングリーダー</td><td>Agilent Biotek</td><td>Cytation 1</td><td>自動イメージング用</td></tr><tr><td>マルチモードイメージングリーダー - 蛍光および吸光度</td><td>Agilent Biotek</td><td>Cytation 5</td><td>ALP分析による吸光度および蛍光強度の測定用</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Artechemis</td><td>US 040</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-015</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>ファロイジン-ローダミン</td><td>Invitrogen</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>Picro-Sirius Red Solution</td><td></td><td>Abcam ab246832</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P7589</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Anti-Collagen I antibody</td><td>Abcam</td><td>ab260043</td><td></td></tr><tr><td>SIGMAFAST BCIP/</td><td>NBT シグマ</td><td>B5655-25TAB</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>シグ</td><td>マ 1064981000</td><td></td></tr><tr><td>リン酸二塩基性ナトリウム、無水シ</td><td>グマ</td><td>S-0876</td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム 一塩基性、一水和物</td><td>メルク</td><td>1.06346</td><td></td></tr><tr><td>トリトン X-100</td><td>シグマ</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>AppliChem</td><td>A4974</td><td></td></tr><tr><td>U2OS 骨肉腫細胞株</td> <td>-</td><td></td> <td>チューリッヒのバイオメカニクス研究所の J Snedeker から提供されました&nbsp;</td></tr><tr><td>&alpha;-トレハロース二水和物</td><td>Sigma</td><td>90208</td><td></td></tr></tbody></table>

イメージングマイクロプレート中のプレキャストポリ(エチレングリコール)(peg)ヒドロゲルを用いた血管化骨形成骨髄ニッチの簡単な確立

Simple Establishment of a Vascularized Osteogenic Bone Marrow Niche Using Pre-Cast Poly(ethylene Glycol) (PEG) Hydrogels in an Imaging Microplate

骨と骨髄は高度に血管新生し、構造的に複雑な臓器であり、癌と転移形成の部位です。血管新生を含む骨および骨髄特異的機能を再現し、薬物スクリーニングと適合する in vitro モデルが非常に望ましい。このようなモデルは、単純で構造的に無関係な2次元(2D)in vitro モデルと、より高価で倫理的に困難な in vivo モデルとの間のギャップを埋めることができます。この記事では、血管新生した骨形成性骨髄ニッチを生成するための、操作されたポリ(エチレングリコール)(PEG)マトリックスに基づく制御可能な3次元(3D)共培養アッセイについて説明します。PEGマトリックス設計により、カプセル化を必要としない簡単な細胞播種ステップで3D細胞培養の開発が可能になり、複雑な共培養システムの開発が可能になります。さらに、マトリックスは透明で、ガラス底の96ウェルイメージングプレートにプレキャストされているため、システムは顕微鏡検査に適しています。ここに記載のアッセイでは、ヒト骨髄由来間葉系間質細胞(hBM-MSC)を、十分に発達した3D細胞ネットワークが形成されるまで最初に培養する。続いて、GFP発現ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVECs)が添加される。培養開発に続いて、明視野顕微鏡および蛍光顕微鏡が続きます。hBM-MSCネットワークの存在は、 そうでなければ形成されず、少なくとも7日間安定している血管様構造の形成を支持する。血管様ネットワーク形成の程度は容易に定量化することができる。このモデルは、共培養の4日目と7日目のアルカリホスファターゼ(ALP)活性の増加によって評価されるように、hBM-MSCの骨形成分化を促進する骨形成タンパク質2(BMP-2)を培地に補充することにより、骨形成性骨髄ニッチに向けて調整できます。この細胞モデルは、さまざまながん細胞を培養し、それらが骨および骨髄特異的な血管ニッチとどのように相互作用するかを研究するためのプラットフォームとして使用できます。また、自動化やハイコンテント解析にも適しており、再現性の高い培養条件下での抗がん剤スクリーニングが可能です。

血管ニッチ培養は、96ウェルイメージングプレート内に剛性勾配を有するプレキャストPEGベースのヒドロゲル上にhBM-MSCおよびGFP-HUVECを順次播種することによって確立されました(図1)。培養物を生落射蛍光顕微鏡で縦方向にモニターし、選択した時点でさらに特性評価しました。細胞外コンパートメントは、直接カラー染色および抗体ベースの染色によって評価した。ALP活性は、生成されたニッチから細胞を取り出し溶解した後に定量化した。さらに、抗血管新生薬感受性アッセイおよびがん共培養モデルの基礎としてのこのプラットフォームの適合性を実証します。
hBM-MSCとGFP発現HUVECの共培養は、プロトコルに記載されているように、成長因子の非存在下、またはFGF-2またはBMP-2のいずれかの存在下で50 ng/mLで3 x 104 細胞/ウェルを播種することによって確立されました。初期の時点から、GFP-HUVECのみを示す明視野画像と蛍光画像の両方から培養物の違いを観察することができました(図2A)。同じ領域を縦方向に観察することにより、FGF-2の存在下でのより速い発達など、培養の発達の違いに気付くことができました。一般に、培養物は、成長因子が存在しない場合、発達が遅れているように見え、どちらのタイプの細胞も広がりが少なく、無細胞領域が存在するように見えました。対照的に、明視野画像は、BMP-2の存在下で最も密度の高い培養を示した。しかし、成長因子含有条件の両方で血管様ネットワークが形成され、FGF-2で最も広範で相互接続されたネットワークが形成された。これらの観察された違いは、ImageJの 血管新生分析装置 を使用して定量化することもできます。実際、総ネットワーク長はFGF-2の存在下で最も高く、成長因子がない場合で最も低かった(図2B)。ネットワーク内の分岐点を示すジャンクションの数は、全長と同じ傾向をたどりました(図2C)。逆に、両方の成長因子含有条件は、成長因子を含まない条件よりも有意に少ない孤立セグメントを示し、より高い相互接続性を示しました(図2D)。さらに、3D共焦点イメージングにより、FGF-2刺激条件では深さの点で内皮細胞の浸透が強いことが明らかになりました(図2E)。
hBM-MSC/GFP-HUVEC 共培養を FGF-2 または BMP-2 存在下で 7 日間維持した後、固定し、ECM 成分を染色しました。免疫細胞化学染色とそれに続く共焦点レーザー走査型顕微鏡法は、成長因子補給の種類によって培養形態に顕著な違いを示しました(図3A)。FGF-2では、培養は内皮細胞と間葉系細胞の両方で高密度の凝縮微小血管様構造に組織化されましたが、BMP-2の存在下では、hBM-MSCははるかに広い領域にまたがっていました。ECMタンパク質のフィブロネクチンとコラーゲンIは同様の方法で局在していましたが、ラミニンとコラーゲンIVは内皮構造の周りにより集中していました。しかしながら、内皮構造周囲のこの増加した濃度は、BMP-2の存在下よりもFGF-2の存在下ではるかに顕著であった。抗体ベースの染色に加えて、ECMの全体的な線維化状態を評価するために直接カラー染色を実施しました(ピクロシリウスレッド染色; 図3B)、ならびにECM上へのCaの沈着(アリザリンレッド染色; 図3C)形成されたニッチの。ピクロシリウスレッド染色は、BMP-2で培養したニッチでより強く、より広範囲であり、アリザリンレッド染色も同じ傾向に従いました。
次に、培養物を、初期の骨形成マーカーとしてのALP活性を評価することにより、骨形成能の観点から特徴付けました。共培養の4日目と7日目に、ヒドロゲルをトリプシンで消化することによって細胞をニッチから回収しました。ALP活性を定量するために、回収した細胞を溶解し、pNPPアッセイを実施した。得られた値は、条件間の細胞数の潜在的な違いを説明するために、各サンプルの総DNAに対して正規化されました。実際、条件のDNA含量の間にわずかな差が観察され、成長因子を含まない条件から最も少ない細胞が回収された(図示せず)。しかし、正規化されたALP活性は条件によって大きく異なり、BMP-2の濃度が高いほど活性が上昇し、100 ng/mLでプラトーになる傾向がありました(図4A、B)。最も低い活性レベルは、50 ng/mLのFGF-2を含む状態で特定されました。評価された両方の時点で同様の傾向が観察されましたが、すべての値は、4日目から7日目までの培養で時間とともに有意に増加しました。定量的アッセイに加えて、BCIP/NBT基質変換に基づく直接色染色を用いてALP活性を定性的に可視化することができた。FGF-2と比較して、BMP-2の存在下でより広範囲でより強い紫色染色が観察された(図4C)。
特徴付けられた骨形成ニッチの2つの潜在的な用途を実証するために、概念実証薬物感受性研究と癌共培養が実施されました。薬物感受性アッセイのために、ベバシズマブまたはベバシズマブ製剤の希釈液からなる対照溶液を、新鮮なBMP-2を含む培養液に添加した。4日目に、50 ng/mL BMP-2の存在下で確立されたネットワークが形成されたとき、通常の培地交換中にコントロール溶液またはベバシズマブ含有培地のいずれかを添加し、蛍光イメージングを使用して培養をモニターしました。10 μg/mLのベバシズマブの添加は、以前に形成されたネットワークの収縮またはアブレーションをもたらしましたが、対照条件は培地交換の2日後に依然として広範なネットワークを特徴としていました(図5A、B)。これらの変化は、毎日取得される蛍光画像上でImageJの 血管新生分析装置 を使用してネットワークの全長を追跡することによっても定量化できました(図5C)。あるいは、ベバシズマブまたは他の化合物を共培養の最初から添加して、ネットワークの形成に対するそれらの影響を評価することもできます。ベバシズマブの場合、これは内皮ネットワークの形成を完全に阻害した(図示せず)。
2番目のアプリケーションでは、MDA-MB-231乳がんまたはU2OS骨肉腫細胞を、50 ng/mL BMP-2を含む新鮮な培養培地中で1.5 x 103 細胞/ウェルの密度で4日目の共培養に加えました。GFP標識されたHUVECおよび非標識hBM-MSCと区別するために、癌細胞を骨形成ニッチに播種する直前にCellTrace FarRedでインキュベートしました。培養物を蛍光顕微鏡でモニターした。当初、ほとんどの癌細胞は基質の表面近くに局在していましたが、2日後には、血管共培養を含む層の近くに見つけることができました。したがって、2日目をタイムラプス顕微鏡検査の開始点として選択し、癌細胞と血管ニッチ内の細胞との間の相互作用のダイナミクスを示しました。興味深いことに、MDA-MB-231細胞は内皮構造に近づいたり遠ざかったりしているのを見ることができ、したがって、それらの環境をプローブまたはリモデリングしている可能性があります(図5D)。CellTrace FarRedをがん細胞の標識として、GFPをHUVECの標識として、およびF-アクチンの追加染色を使用して、共焦点レーザー走査型顕微鏡を使用してすべての細胞型を区別することができました(図5E)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65413/65413fig01.jpg"> 図1:血管新生、骨形成ニッチの信頼性の高い生成のための簡単なアプローチ。 詳細な剛性勾配を備えたプレキャスト合成ヒドロゲルにより、直接カプセル化を必要とせずに、シーケンシャルセルシーディングを介して3D培養物を生成できます。hBM-MSCは、GFP発現HUVECを添加する前に3日間前培養されます。培養物は、明視野およびGFPシグナルを縦方向に取得することによって監視されます。選択された時点で、ニッチはそれらのECM沈着および骨形成状態についてさらに評価される。アルカリホスファターゼ活性は、直接カラー染色、ニッチから細胞を回収し、細胞溶解物に対してpNPPアッセイを行うことによって評価されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65413/65413fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65413/65413fig02.jpg"> 図2:FGF-2またはBMP-2による血管様ネットワークの刺激。 (A)明視野および蛍光(GFP)画像は、成長因子非存在下またはFGF-2またはBMP-2の存在下で増殖した細胞の共培養の2日目、4日目、および6日目に、いずれも50 ng/mLで取得されました。スケールバー:400 μm。 (B-D)共培養4日目に画像化されたGFP-HUVECネットワークの定量化されたパラメータを、ImageJ用血管新生分析装置を用いて分析した。データは平均±標準偏差として表されます。統計解析はGraphPad Prism 9.5.1を用いて行った。ダネットの多重比較検定による通常の一元配置分散分析は、n≥4で実行されました。* P &lt; 0.05;** P &lt; 0.01;P &lt; 0.001(E)FGF-2-(上段)およびBMP-2-(下段)のGFPおよびF-アクチンシグナルの共焦点スタック(全高:547.5 μm、zステップ:2.5 μm)から生成された3次元再構成。スケールバー:300 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65413/65413fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65413/65413fig03.jpg"> 図3:BMP-2による非局在hBM-MSC拡散およびECM沈着の誘導。 (A-C)FGF-2またはBMP-2のいずれかの存在下で増殖させた7日間の共培養物を、(A)免疫蛍光法または(B、C)直接色染色に供した。(A)培養物をF-アクチンおよびECMタンパク質フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲンI、およびコラーゲンIVについて染色した。画像は、共焦点スタックの最大強度投影を示しています(全高:100 μm、zステップ:5 μm)。スケールバー:200μm。 (B、C)培養物を、(B)ピクロシリウスレッドおよび(C)アリザリンレッドを用いて染色した。上段は、2.5倍の倍率(スケールバー:1,000 μm)で取得した画像のウェル全体の概観をステッチして示し、下段は5倍の倍率(スケールバー:400 μm)で取得した1つの視野を示しています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65413/65413fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65413/65413fig04.jpg"> 図4:直接色染色によるBMP-2誘導性ALP活性の生化学的評価。 (A,B)ALP活性は、成長因子の非存在下または異なる濃度のBMP-2またはFGF-2の存在下で(A)4日間、または(B)50 ng/mLで増殖させた培養物の細胞ライセートで測定されました。)7日間の共培養。ALP活性を、各ライセートサンプルのDNA含量に対して標準化して示す。データは平均±標準偏差として表されます。統計解析はGraphPad Prism 9.5.1を用いて行った。ダネットの多重比較検定による通常の一元配置分散分析は、n = 5で実行されました。P &lt; 0.0001 です。(C)50 ng/mL FGF-2またはBMP-2の存在下で7日間の共培養で増殖させたニッチにおけるALP活性の直接色染色。左側の画像は、2.5倍の倍率(スケールバー:1,000 μm)で取得した画像のウェル全体のオーバービューをステッチして示し、右側の画像は、5倍の倍率(スケールバー:400 μm)で取得した1つの視野を示しています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65413/65413fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65413/65413fig05.jpg"> 図5:進行がんモデルにおける骨形成性血管新生ニッチの採用。 (A)BMP-2存在下で増殖させた培養物のGFPシグナルを共培養4日目に画像化し、対照溶液(左)または10 μg/mLのベバシズマブ(右)を2日間添加した後、培養物を再び画像化しました(共培養6日目)。スケールバー:600 μm。 (B)ベバシズマブ処理培養物の高倍率画像を Aに示す。スケールバー:250 μm。 (C) Aに示す内皮ネットワークの全長を、毎日取得された画像からImageJの 血管新生分析装置 を使用して定量化しました。n ≥ 3.(D)CellTrace FarRed標識MDA-MB-231乳癌細胞をBMP-2存在下で増殖させた4日間の共培養に添加し、癌細胞添加後2日目からタイムラプス画像を取得しました。スケールバー:100 μm。 (E) D に記載されているように生成され、F-アクチンについて固定および染色されたトリプル共培養の共焦点スタック(全高:70 μm、zステップ:2.4 μm)の最大強度突起。左:MDA-MB-231乳がん細胞を特徴とするニッチ。右:U2OS骨肉腫細胞を特徴とするニッチ。左側の画像のスケールバー:200 μm;右の画像のスケールバー:50 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65413/65413fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

骨髄血管ニッチの in vitro モデルは、間葉系細胞および内皮細胞をプレキャスト3D PEGヒドロゲル上に播種することによって確立される。内皮ネットワーク、ECM成分、およびニッチのALP活性は、使用される成長因子によって異なります。このプラットフォームは、高度ながんモデルに使用できます。

イメージングマイクロプレート中のプレキャストポリ(エチレングリコール)(PEG)ヒドロゲルを用いた血管化骨形成骨髄ニッチの簡単な確立

The bone and bone marrow are highly vascularized and structurally complex organs, and are sites for cancer and metastasis formation. In vitro models ...

ほとんどのin vitro血管新生研究は、天然由来のマトリックスを使用します。典型的には生物学的プロセスに対して非常に伝導性であるが、それらの固有の生物学的活性は単一パラメータの影響の研究を複雑にする。ここでは、関心のあるプレーヤーを選択的に追加し、システムがどのように変化するかを評価できます。ブランクスレート合成ヒドロゲル上に細胞を順次播種することで、非常に明確なニッチの形成が可能になります。ここで、hBMMSはヒドロゲルにコロニーを形成し、それらの固有の細胞外マトリックスを沈着させる。これは、その後に播種された内皮細胞のための基質を提供する。この機能は、他の3D in vitroモデルでは一般的に見られません。異なる細胞タイプを順次追加できるため、非常に複雑なハイスループット対応のin vitroモデルを作成できます。これらのモデルは、より特異的な骨形成血管新生ニッチを生成し、細胞および分子プレーヤーの機能を調べるために適合させることができます。

simple-establishment-vascularized-osteogenic-bone-marrow-niche-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

ここでは、ヒトの骨髄(hBM)から中胚葉前駆細胞（MPCs）を単離するための最適化された、再現性の高いプロトコルについて説明します。MPCは、フローサイトメトリーおよびネスチン発現によって特徴付けられました。その結果、血管新生能を保持しながら、指数関数的に増殖するMSC様細胞培養を生じさせる能力が示されました。...

ヒト骨髄から単離することMesangiogenic前駆細胞（MPCは）

ここでは、血管形成生体内可視化するプロトコルを提案と多光子顕微鏡による 3 D 足場でリアルタイム。重要な性マウス頭蓋骨骨欠損モデルにおける血管新生遺伝子組み換え足場を調べた。コントロールの治療群よりもより新しい血管を認めた.

頭蓋骨の重要な骨欠損修復の多光子顕微鏡In Vivo遺伝子組み換え 3 D-PLGA/nHAp 足場による血管新生を可視化

マウスにおける異なるヒト化骨髄ニッチを作成し、ライブイメージする方法が提示される。ヒト間葉系細胞によって作り出された支持的ニッチに基づいて、ヒト内皮細胞の添加はヒト血管の形成を誘導するが、rhBMP-2の添加はヒト - マウスキメラ成熟骨組織の形成を誘導する。...

マウスにおけるヒト化骨髄微小環境のバイオエンジニアリングとライブイメージングによるそれらの可視化

骨肉腫 (OS) の骨細胞外マトリックス (BEM) モデルは、よく確立され、表示をここでです。原発腫瘍の成長の in vitro真似をして OS の組織学的および cytogenic...

骨肉腫に対する三次元骨細胞外マトリックス モデル

本研究では、骨形成タンパク質-2をロードしたゼラチン足場をトリガーとする in vivo...

治療用造血幹細胞/前駆細胞を回収するためのin vivoオステオオルガノイドアプローチ

このプロトコルは、メタクリル化ゼラチン(GelMA)ハイドロゲルに埋め込まれたヒト骨細胞を用いて、脱細胞化細胞外マトリックスを補完した3D骨構造の製造を説明しています。この方法は低コストで拡張性が高く、基本的な実験機器と互換性があり、筋骨格系疾患の研究のための翻訳プラットフォームを提供します。...

ヒト骨細胞と脱細胞化細胞外マトリックスを用いて筋骨格系疾患をモデル化する3D骨培養プラットフォーム

次のプロトコルは、チオール -...

ステップ成長PEG-ペプチドハイドロゲルからβ細胞のスフェロイドの発生と復旧

今日まで、厚い組織の欠陥は通常、自家組織フラップまたは人工組織を適用することによって再構築されています。このプロトコルでは、自家皮弁の代わりとして機能するために、自家椎弓根を持つ血管新生組織皮弁をエンジニアリングするための新しい方法を提示します。...

操作された血管柄マッスルフラップ

ヘパリンとプロタミンから製造された自己組織化高分子電解質複合体(PEC)をアルギン酸ビーズ上に堆積させ、骨形成成長因子の放出を閉じ込めて調節しました。この送達戦略により、脊椎固定術の用途でBMP-2の投与量を20倍に減らすことができます。この記事では、PECの利点と製造について説明します。...

ヘパリン結合ドメイン骨形成成長因子の送達のための高分子電解質複合体

この原稿は、新たな三次元肝細胞培養プラットフォーム、逆コロイド結晶足場、および肝細胞の振る舞いを評価するための付随する技術の製造のための詳細なプロトコルを提示します。サイズ制御可能な細孔、相互接続性、および細胞外マトリックスタンパク質をポリ(エチレングリコール)(PEG)足場に結合する能力により、Huh-7.5細胞の性能が向上します。...

肝組織工学のための三次元細胞培養プラットフォーム：逆コロイド結晶ポリ（エチレングリコール）足場の作製

学ぶ PEGヒドロゲルを用いた血管化骨髄ニッチの構築法。hBM-MSCとGFP-HUVECを逐次播種し、成長因子の影響を評価するハイスループットモデルを確立します。

イメージングマイクロプレート中のプレキャストポリ(エチレングリコール)(PEG)ヒドロゲルを用いた血管化骨形成骨髄ニッチの簡単な確立

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