Name: がん細胞におけるイオンチャネルのスクリーニング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 19 s
Description: 学ぶイオンチャネル機能解析とがん細胞生存率アッセイ法。GABAA受容体作動薬の治療効果を評価し、固形がん治療への新たな標的治療アプローチを確立する方法です。

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著者らは、Thomas E. & Pamela M. Mischell Family FoundationからSSへの支援、およびHarold C. Schott FoundationがUC College of MedicineのHarold C. Schott寄付講座からSSへの資金提供を認めている。

固形腫瘍を治療するためのイオンチャネルの薬理学的標的化

<ol><li>Prevarskaya, N., Skryma, R., Shuba, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+channels+in+cancer%3A+Are+cancer+hallmarks+oncochannelopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Ion channels in cancer: Are cancer hallmarks oncochannelopathies.</a> Physiological Reviews. 98 (2), 559-621 (2018).</li>
<li>Rao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand-gated+neurotransmitter+receptors+as+targets+for+treatment+and+management+of+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Ligand-gated neurotransmitter receptors as targets for treatment and management of cancers.</a> Frontiers in Physiology. 13, 839437(2022).</li>
<li>Mohr, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-associated+intermediate+conductance+Ca2%2B-activated+K%2B+channel+KCa3.1%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Cancer-associated intermediate conductance Ca2+-activated K+ channel KCa3.1.</a> Cancers. 11 (1), 109(2019).</li>
<li>Fels, B., Bulk, E., Petho, Z., Schwab, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+TRP+channels+in+the+metastatic+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceuticals%22%5BJournal%5D)">The role of TRP channels in the metastatic cascade.</a> Pharmaceuticals. 11 (2), 48(2018).</li>
<li>Eil, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionic+immune+suppression+within+the+tumour+microenvironment+limits+T+cell+effector+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ionic immune suppression within the tumour microenvironment limits T cell effector function.</a> Nature. 537 (7621), 539-543 (2016).</li>
<li>Haustrate, A., Hantute-Ghesquier, A., Prevarskaya, N., Lehen'kyi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+targeting+ion+channels+and+their+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies targeting ion channels and their therapeutic potential.</a> Frontiers in Pharmacology. 10, 606(2019).</li>
<li>Kischel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+channels%3A+New+actors+playing+in+chemotherapeutic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Ion channels: New actors playing in chemotherapeutic resistance.</a> Cancers. 11 (3), 376(2019).</li>
<li>Tuszynski, J., Tilli, T. M., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+channel+and+neurotransmitter+modulators+as+electroceutical+approaches+to+the+control+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Design%22%5BJournal%5D)">Ion channel and neurotransmitter modulators as electroceutical approaches to the control of cancer.</a> Current Pharmaceutical Design. 23 (32), 4827-4841 (2017).</li>
<li>Kale, V. P., Amin, S. G., Pandey, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+ion+channels+for+cancer+therapy+by+repurposing+the+approved+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Targeting ion channels for cancer therapy by repurposing the approved drugs.</a> Biochimica Biophysica Acta. 1848 (10), 2747-2755 (2015).</li>
<li>Wickenden, A., Priest, B., Erdemli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+channel+drug+discovery%3A+Challenges+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ion channel drug discovery: Challenges and future directions.</a> Future Medicinal Chemistry. 4 (5), 661-679 (2012).</li>
<li>Rocha, P. R. F., Elghajiji, A., Tosh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+system+for+electrophysiology+of+cancer+cell+populations%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectricity%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive system for electrophysiology of cancer cell populations: A review.</a> Bioelectricity. 1 (3), 131-138 (2019).</li>
<li>Sengupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B15-GABAA+receptors+negatively+regulate+MYC-amplified+medulloblastoma+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">α5-GABAA receptors negatively regulate MYC-amplified medulloblastoma growth.</a> Acta Neuropathologica. 127 (4), 593-603 (2014).</li>
<li>Jonas, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+in+vivo+testing+of+compounds+targeting+Group+3+medulloblastomas+using+an+implantable+microdevice+as+a+new+paradigm+for+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">First in vivo testing of compounds targeting Group 3 medulloblastomas using an implantable microdevice as a new paradigm for drug development.</a> Journal of Biomedical Nanotechnology. 12 (6), 1297-1302 (2016).</li>
<li>Kallay, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulating+native+GABAA+receptors+in+medulloblastoma+with+positive+allosteric+benzodiazepine-derivatives+induces+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurooncology%22%5BJournal%5D)">Modulating native GABAA receptors in medulloblastoma with positive allosteric benzodiazepine-derivatives induces cell death.</a> Journal of Neurooncology. 142 (3), 411-422 (2019).</li>
<li>Pomeranz Krummel, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanoma+cell+intrinsic+GABAA+receptor+enhancement+potentiates+radiation+and+immune+checkpoint+response+by+promoting+direct+and+T+cell-mediated+anti-tumor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Oncology%2C+Biology%2C+Physics%22%5BJournal%5D)">Melanoma cell intrinsic GABAA receptor enhancement potentiates radiation and immune checkpoint response by promoting direct and T cell-mediated anti-tumor activity.</a> International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 109 (4), P1040-P1053 (2021).</li>
<li>Bhattacharya, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutically+leveraging+GABAA+receptors+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Therapeutically leveraging GABAA receptors in cancer.</a> Experimental Biology and Medicine. 246 (19), 2128-2135 (2021).</li>
<li>Mazia, D., Schatten, G., Sale, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+of+cells+to+surfaces+coated+with+polylysine.+Applications+to+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Adhesion of cells to surfaces coated with polylysine. Applications to electron microscopy.</a> Journal of Cell Biology. 66 (1), 198-200 (1975).</li>
<li>Wiatrak, B., Kubis-Kubiak, A., Piwowar, A., Barg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PC12+cell+line%3A+Cell+types%2C+coating+of+culture+vessels%2C+differentiation+and+other+culture+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">PC12 cell line: Cell types, coating of culture vessels, differentiation and other culture conditions.</a> Cells. 9 (4), 958(2020).</li>
<li>Baker, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+in+cytochemistry+and+electron-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Fixation in cytochemistry and electron-microscopy.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 6 (5), 303-308 (1958).</li>
<li>Chung, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histomorphological+and+molecular+assessments+of+the+fixation+times+comparing+formalin+and+ethanol-based+fixatives%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Histomorphological and molecular assessments of the fixation times comparing formalin and ethanol-based fixatives.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 66 (2), 121-135 (2018).</li>
<li>Crowley, L. C., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+mitochondrial+transmembrane+potential+by+TMRE+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Measuring mitochondrial transmembrane potential by TMRE staining.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (12), (2016).</li>
<li>Cory, A. H., Owen, T. C., Barltrop, J. A., Cory, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+an+aqueous+soluble+tetrazolium%2Fformazan+assay+for+cell+growth+assays+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Communications%22%5BJournal%5D)">Use of an aqueous soluble tetrazolium/formazan assay for cell growth assays in culture.</a> Cancer Communications. 3 (7), 207-212 (1991).</li>
<li>Maro, B., Marty, M. C., Bornens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+in+vitro+effects+of+the+mitochondrial+uncoupler+FCCP+on+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">In vivo and in vitro effects of the mitochondrial uncoupler FCCP on microtubules.</a> EMBO Journal. 1 (11), 1347-1352 (1982).</li>
<li>IUPHAR/BPS Guide to Pharmacology. , Available from: 
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<li>Zheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+for+regulation+of+melanoma+cell+death+via+activation+of+thermo-TRPV4+and+TRPV%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">Mechanism for regulation of melanoma cell death via activation of thermo-TRPV4 and TRPV.</a> Journal of Oncology. 2019, 7362875(2019).</li>
<li>Konno, K., Watanabe, M. Immunohistochemistry for ion channels and their interacting molecules: Tips for improving antibody accessibility. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKonno%2C+K+%22Receptor+and+Ion+Channel+Detection+in+the+Brain%22">Receptor and Ion Channel Detection in the Brain</a>. Luján, R., Ciruela, F. , Humana Press. New York, NY. (2016).</li>
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<li>Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonogenic+assay+of+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Clonogenic assay of cells in vitro.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2315-2319 (2006).</li>
<li>Rafehi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonogenic+assay%3A+Adherent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Clonogenic assay: Adherent cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), 2573(2011).</li>
<li>Scudiero, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+soluble+tetrazolium%2Fformazan+assay+for+cell+growth+and+drug+sensitivity+in+culture+using+human+and+other+tumor+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a soluble tetrazolium/formazan assay for cell growth and drug sensitivity in culture using human and other tumor cell lines.</a> Cancer Research. 48 (17), 4827-4833 (1988).</li>
<li>Wang, P., Henning, S. M., Heber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+of+MTT+and+MTS-based+assays+for+measurement+of+antiproliferative+activity+of+green+tea+polyphenols%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols.</a> PLoS One. 5, e10202(2010).</li>
<li>Berridge, M. V., Tan, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+cellular+reduction+of+3-%284%2C5-dimethylthiazol-2-yl%29-2%2C5-diphenyltetrazolium+bromide+%28MTT%29%3A+subcellular+localization%2C+substrate+dependence%2C+and+involvement+of+mitochondrial+electron+transport+in+MTT+reduction%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Characterization of the cellular reduction of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT): subcellular localization, substrate dependence, and involvement of mitochondrial electron transport in MTT reduction.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 303 (2), 474-482 (1993).</li>
<li>Plumb, J. A., Milroy, R., Kaye, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+pH+dependence+of+3-%284%2C5-dimethylthiazol-2-yl%29-2%2C5-diphenyl-tetrazolium+bromide-formazan+absorption+on+chemosensitivity+determined+by+a+novel+tetrazolium-based+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Effects of the pH dependence of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide-formazan absorption on chemosensitivity determined by a novel tetrazolium-based assay.</a> Cancer Research. 49 (16), 4435-4440 (1989).</li>
<li>Chakrabarti, R., Kundu, S., Kumar, S., Chakrabarti, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+A+as+an+enzyme+that+catalyzes+the+reduction+of+MTT+to+formazan+by+vitamin+C%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Vitamin A as an enzyme that catalyzes the reduction of MTT to formazan by vitamin C.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 80 (1), 133-138 (2000).</li>
<li>Dong, G. W., Preisler, H. D., Priore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+limitations+of+in+vitro+clonogenic+drug+sensitivity+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Chemotherapy+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Potential limitations of in vitro clonogenic drug sensitivity assays.</a> Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 13 (3), 206-210 (1984).</li>
<li>Sun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STIM1-+and+Orai1-Mediated+Ca2%2Boscillation+orchestrates+invadopodium+formation+and+melanoma+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">STIM1- and Orai1-Mediated Ca2+oscillation orchestrates invadopodium formation and melanoma invasion.</a> Journal of Cell Biology. 207 (4), 535-548 (2014).</li>
</ol>

D.A.P.K.はAmlal Pharmaceuticals Inc.の共同設立者、社長、CEOであり、Amlal Pharmaceuticals Inc.の共同設立者であり、Bexion Pharmaceuticals, Inc.の医薬品安全性監視委員会のメンバーです。

イオンチャネル機能の変化は、細胞内シグナル伝達カスケードを変化させ、細胞の全体的な機能に影響を与える可能性があります。過去10年間で、イオンチャネルが癌細胞の成長と転移に重要であることがますます明らかになっています。重要なことに、多くのイオンチャネルは、広範囲の障害を標的とする承認された治療薬の主要な標的である24。研究者らは、イオンチャネルが抗がん標的になり得るかどうかを調査しており、初期の結果は有望である2,16,25。この分野は、がんの発生と治療標的としてのイオンチャネルの役割を調査し始めたばかりであり、両方の面で未来は明るいように見えます。
この研究では、がん細胞内のイオンチャネルを分析し、チャネルが治療上の脆弱性であるかどうかを判断するための詳細な手順が提供されています。これらのアッセイは、がん細胞のイオンチャネルの研究に役立つガイドとして...

膜輸送タンパク質は、細胞間のコミュニケーションや細胞の恒常性の維持に不可欠です。膜輸送タンパク質の中で、イオンチャネルは細胞の成長と発達を促進し、困難で変化する環境で細胞の状態を維持するのに役立ちます。イオンチャネルは、全身および中枢神経系(CNS)の両方で固形腫瘍の発生を促進し、サポートすることも報告されています1,2。例えば、KCa3.1チャネルは、膜電位の調節と細胞周期の調節に重要な細胞体積の制御に関与しています。欠陥のあるKCa3.1チャネルは、腫瘍細胞の異常な増殖に寄与することが報告されています3。さらに、イオンチャネルは癌の転移性播種に寄与し得る。一過性受容器電位(TRP)チャネルは、例えば、Ca2+およびMg2+流入に関与している。この流入は、腫瘍を取り囲む細胞外マトリックスを調節するように機能するいくつかのキナーゼとヒートショックタンパク質を活性化し、これは癌転移の開始に重要です4。
イオンチャネルはがんの発症に寄与する可能性があるため、薬物関連のがん治療の標的にもなり得る。例えば、化学療法および新規免疫療法を含む治療法に対する耐性は、イオンチャネル機能調節不全に関連している5,6,7。さらに、イオンチャネルは、がんの成長と発生を妨げる重要な創薬標的として浮上しており、再利用された低分子(FDA承認)薬や、モノクローナル抗体を含む生体高分子が検討されています1,2,8,9。この面では多くの進歩がありましたが、イオンチャネルがんの創薬は未発達のままです。これは、がん細胞のイオンチャネルを研究するという独特の課題に一部起因しています。例えば、遅効性化合物の電気生理学アッセイの設定には技術的な限界があり、チャネル活性化と薬物作用の時間的な違いがあります。さらに、今日一般的に使用されている自動電気生理学システムのほとんどは疎水性基質を利用しているため、化合物の溶解性も進行を妨げる可能性があり、化合物吸着の結果としてアーティファクトに寄与する可能性があります。さらに、天然物、ペプチド、モノクローナル抗体などの大規模な生物有機分子治療薬は、従来の電気生理学アッセイ10を使用してスクリーニングすることが技術的に困難です。最後に、がん細胞の生体電気的特性はよくわかっていません11。
一方、イオンチャネルの免疫蛍光染色はしばしば困難です。これは、部分的には、それらの構造の複雑さと膜内のコンテキストによるものであり、顕微鏡研究のための抗体の生成と使用の両方の能力に影響を与えます。イオンチャネルの染色に使用される抗体が、特異性、親和性、再現性について検証されていることが特に重要です。イオンチャネル用の市販抗体は、その検証戦略と発表記録に基づいて検討する必要があります。実験には、標的タンパク質のノックダウンまたはノックアウトのいずれかによる非特異的結合の欠如を実証するためのネガティブコントロールを含める必要があります。あるいは、標的タンパク質が存在しない、またはmRNAまたはタンパク質の決定に基づいて存在量が少ない細胞株は、ネガティブコントロールとして役立ち得る。例えば、この研究は、髄芽腫細胞株(D283)における(GABA)受容体サブユニットGabra5の局在を示す。siRNAノックダウンを有するD283細胞および別の小脳髄芽腫細胞株であるDaoy細胞をGabra5について染色したが、認識可能な染色は示されなかった(データ示さず)。
ここでは、イオンチャネル機能、ならびに癌細胞に対するイオンチャネルモジュレーターの効果を分析およびアッセイするための方法が提示される。(1)イオンチャネルの細胞の染色、(2)ミトコンドリアの分極状態の検査、(3)電気生理学を用いたイオンチャネル機能の確立、および(4)in vitro薬物検証のためのプロトコルが提供されています。これらのプロトコルは、A型ガンマアミノ酪酸(GABAA)受容体2,12,13,14,15,16、塩化物アニオンチャネルおよび主要な抑制性神経伝達物質受容体の研究を強調しています。ただし、ここで紹介する方法は、他の多くの癌細胞やイオンチャネルの研究に適用されます。

<table><tbody><tr><td>ABS SpectraMax プレートリーダー</td><td>分子デバイス</td><td>ABS</td><td></td></tr><tr><td>アキュターゼ</td><td>Invitrogen</td><td>00-4555-56</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Flor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A32723</td><td>ヤギ 抗ウサギ</td></tr><tr><td>抗生物質-抗真菌</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>100x</td></tr><tr><td>B27 サプリメント</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td>ビタミンAが不足している</td></tr><tr><td>バイオセーフティキャビネット</td><td>LABCONCO</td><td>302381101</td><td>Class II, Type A2</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1606-100</td><td></td></tr><tr><td>CO2 インキュベーター</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-998-211</td><td>Heracell VIOS 160i</td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>Fisher Scientific</td><td>C7902</td><td>二水和</td></tr><tr><td>物細胞培養皿、150 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-600-004</td><td>細胞培養処理</td></tr><tr><td>済み細胞培養フラスコ、75 cm2</td><td>Fisher Scientific</td><td>430641U</td><td>細胞培養処理</td></tr><tr><td>済み細胞培養プレート、6 ウェル</td><td>Fisher Scientific</td><td>353046</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>処理済み 細胞培養プレート、96 ウェル</td><td>Fisher Scientific</td><td>353072</td><td>細胞培養処理</td></tr>済み<tr><td>遠心分離機</td><td>Eppendorf</td><td>EP-5804R</td><td>冷蔵</td></tr><tr><td>コーニング CoolCell</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-210-0006</td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ、22 x 22 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-553-450</td><td>コーニングブランド</td></tr><tr><td>D283 Med</td><td>ATCC</td><td>HTB-185</td><td></td></tr><tr><td>DABCO 封入剤</td><td>EMS</td><td>17989-97</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma Life Sciences</td><td>D9434</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td>細胞培養グレード</td></tr><tr><td>DMEM/F12、ベース培地</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>11330-032</td><td>フェノールレッド</td></tr><tr><td>DMEM/F12、フェノールレッドフリー</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>21041-025</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>上皮成長因子</td><td>STEMCELL</td><td>78006.1</td><td></td></tr><tr><td>FCCP</td><td>アブカム</td><td></td><td></td>AB120081</tr><tr><td>ウシ胎児血清、認定</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>線維芽細胞成長因子、塩基性</td><td>ミリポア</td><td>GF003</td><td></td></tr><tr><td>GARBA5 抗体</td><td>アビバ</td><td>ARP30687_P050</td><td>ウサギ ポリクローナル</td></tr><tr><td>グルタマックス</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール封入培地</td><td>EMS</td><td>17989-60</td><td>DAPI+DABCO</td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>ミリポア シグマ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヘパリン</td><td>STEMCELL</td><td>7980</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>HyClone</td><td>SH3023701</td><td>ソリューション</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP310-500</td><td>Solid</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>オープンプラットフォーム</td><td></td><td>フィジープラグイン付き</td></tr><tr><td>イムノマウント</td><td>DAPI EMS</td><td>17989-97</td><td></td></tr><tr><td>KRM-II-08</td><td></td><td></td><td>市販のソースから入手できない実験化合物</td></tr><tr><td>ライカアプリケーションスイートX</td><td>ライカマイクロシステム</td><td></td><td></td></tr>ズ <tr><td>白血病抑制因子</td><td>Novus</td><td>N276314100U</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9272</td><td>六水和物</td></tr><tr><td>顕微鏡、共焦点</td><td>ライカ</td><td>SP8</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡、ライト</td><td>VWR</td><td>76382-982</td><td>DMiL倒立</td></tr><tr><td>MTS - Promega One Step</td><td>Promega</td><td>G3581</td><td></td></tr>マルチ<tr><td>チャンネルピペット、0.5-10 & マイクロ;L</td><td>Eppendorf</td><td>Z683914</td><td></td></tr><tr><td>マルチチャンネルピペット、10-100 & マイクロ;L</td><td>Eppendorf</td><td>Z683930</td><td></td></tr><tr><td>マルチチャンネルピペット、30-300 & マイクロ;L</td><td>Eppendorf</td><td>Z683957</td><td></td></tr><tr><td>Nest-O-Patch</td><td>Heka</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal-A Medium</td><td>Gibco</td><td>10888022</td><td>Without Vitamin A</td></tr><tr><td>Neurobasal-A Medium</td><td>Gibco</td><td>12348-017</td><td>Phenol red free</td></tr><tr><td>Non-Essential Amino Acids</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>NOR-QH-II-66</td><td></td><td></td><td>実験化合物商用ソースから入手可能</td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>50-998-944</td><td>4インチ幅</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td></td><td>EMS RT-15710</td><td></td></tr><tr><td>PATHCHMASTER</td><td>ヘカ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>灌流システム</td><td>Nanion</td><td>4000120</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>EMS</td><td>RT-15710</td><td></td></tr><tr><td>リン酸ブファード生理食塩水</td><td>フィッシャー科学</td><td>AAJ75889K2</td><td>試薬グレード</td></tr><tr><td>ポリ-D-リジン</td><td>フィッシャー科学</td><td>A3890401</td><td></td></tr><tr><td>ポリ-L-リジン</td><td>シグマ ライフサイエンス</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>ポート・ア・パッチ</td><td>ニニオン</td><td>21000072</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>シグマ・ライフサイエンス</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>一次抗体</td><td>Invitrogen</td><td>MA5-34653</td><td>ウサギモノクローナル</td></tr><tr><td>プリズム</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>プロポフォール</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>NC0758676</td><td>1 mL アンプル</td></tr><tr><td>QH-II-66</td><td></td><td></td><td>市販の化合物から入手できない実験化合物</td></tr><tr><td>試薬リザーバー</td><td>VWR</td><td>89094-664</td><td>滅菌</td></tr><tr><td>スライド、75 x 25 mm</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-544-7</td><td>つや消し片面</td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>コーニング</td><td>25-035-Cl</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>シンセ-A-フリーズ ミディアム</td><td>Gibco</td><td>R00550</td><td>凍結保存</td></tr><tr><td>TMRE</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>50-196-4741</td><td>試薬</td></tr><tr><td>TMRE キット</td><td>Abcam</td><td>AB113852</td><td>キット</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>NC0704309</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Gibco</td><td>15-250-061</td><td>溶液、0.4%</td></tr> <tr><td>トリプシン /EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-072</td><td>溶液、0.25%</td></tr> <tr><td>Vortex ミキサー</td><td>VWR</td><td>97043-562</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 濾紙</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>09-927-841</td><td></td></tr></tbody></table>

がん細胞におけるイオンチャネルのスクリーニング

Screening Ion Channels in Cancer Cells

イオンチャネルは、細胞の発生と細胞の恒常性の維持に不可欠です。イオンチャネル機能の摂動は、広範囲の障害またはチャネル障害の発症に寄与する。がん細胞は、イオンチャネルを利用して自身の発生を促進し、腫瘍として改善し、さまざまな非がん細胞を含む微小環境に同化します。さらに、腫瘍微小環境内の成長因子およびホルモンのレベルの増加は、イオンチャネル発現の増強をもたらし、癌細胞の増殖および生存に寄与する。したがって、イオンチャネルの薬理学的標的化は、原発性および転移性脳腫瘍を含む固形悪性腫瘍を治療するための有望なアプローチとなる可能性があります。ここでは、癌細胞におけるイオンチャネルの機能を特徴付けるためのプロトコル、および癌生存率への影響を決定するためにイオンチャネルのモジュレーターを分析するためのアプローチについて説明します。これらには、イオンチャネルの細胞の染色、ミトコンドリアの分極状態のテスト、電気生理学を使用したイオンチャネル機能の確立、および薬物効力を評価するための生存率アッセイの実行が含まれます。

上記は、がん細胞のイオンチャネルの特性評価に使用できる手順です。最初のプロトコルは、イオンチャネルの染色を強調しています。詳述したように、イオンチャネル、さらに言えば、細胞外膜に存在するタンパク質を染色する場合、多くの課題があります。図1に示すのは、五量体GABAA受容体のサブユニットに対する染色である。2番目のプロトコルは、癌細胞におけるミトコンドリアの分極状態を試験した結果を強調しています。ミトコンドリアは、細胞の生存率と増殖、および細胞死に不可欠な役割を果たしています。哺乳類細胞では、ミトコンドリアは、ミトコンドリアの内膜と外膜の間に見られるBcl-2ファミリータンパク質の放出を介して、細胞ストレスに応答してアポトーシスを活性化します。サイトゾルでは、Bcl-2ファミリータンパク質がカスパーゼプロテアーゼを活性化し、プログラムされた細胞死を媒介します。原形質膜イオンチャネル機能の変化は、ミトコンドリア内のイオンレベルを含む細胞内イオン恒常性の破壊をもたらし、膜電位の喪失につながり、アポトーシスを引き起こす可能性があります<sup class="xre...

イオンチャネルの薬理学的標的化は、固形腫瘍を治療するための有望なアプローチです。がん細胞におけるイオンチャネル機能を特徴付け、がんの生存率に対するイオンチャネルモジュレーターの効果をアッセイするための詳細なプロトコルが提供されています。

Ion channels are critical for cell development and maintaining cell homeostasis. The perturbation of ion channel function contributes to the development ...

イオンチャネルの機能は細胞生物学において非常に重要であり、癌の成長に大きな影響を与えます。私たちのチームは、がん治療を支援するためにイオンチャネルを標的とすることに焦点を当てています。この分野は最近、腫瘍の微小環境と癌細胞が健康な組織にどのように定着するかについての理解を深めており、癌におけるイオンチャネルの重要性を強調しています。現在の実験における最大の課題の1つは、治療を効果的にテストできる免疫適格動物モデルの利用可能性です。私たちは、GABAA受容体が異種の癌に対する治療上の脆弱性であることを確立し、癌細胞を効果的に損なう新しいクラスのGABAA受容体活性化因子を特定しました。イオンチャネルは、がん細胞の挙動を調節する重要な役割を担っており、がん治療の標的として大きな可能性を秘めています。私たちの研究は、癌を効果的に治療するために確立されたクラスの薬をどのように使用できるかを強調しています。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

内向き整流カリウム（KIR）ハイスループット化合物スクリーニングのためのチャネルの活性を測定するための定量的な蛍光アッセイを開発し、検証するための方法が提示されます。...

内向き整流カリウムチャネルの小分子モジュレーターのためのハイスループットスクリーニング

このビデオは、DAPI染色アッセイを使用して電離放射線(IR)誘発がん細胞株の主要な細胞死プロファイルをスクリーニングする方法を示しています。細胞死を受けている標的細胞のDAPI染色された核は、明確な形態を示し、蛍光顕微鏡で容易に同定できます。...

DAPI染色を用いた細胞死スクリーニング:がん細胞株におけるIR誘導クローン性細胞死の迅速スクリーニング法

細胞プロセスのシステム·レベルの理解を達成することは、現代の細胞生物学の目標です。我々はここでゲノム規模のRNAiライブラリーを用いた遺伝子の機能を調べるために、様々な細胞機能のエンドポイントのルシフェラーゼレポーターを多重化するための戦略について説明します。...

培養細胞における癌関連シグナル伝達を問い合わせるための多重ルシフェラーゼベースのスクリーニング·プラットフォーム

ここでは、腫瘍細胞代謝のリアルタイムモニタリングと、転移のin vivoニワトリ胚絨毛膜-尿膜(CAM)モデルを組み合わせて、腫瘍細胞をDNA損傷化学療法に感作する能力について、新規の抗がん標的/薬剤を評価するために使用されます。...

がん薬感の有効性を評価<em&gt;インビトロ</em&gt;と<em&gt;インビボ</em

前臨床試験からヒト試験に移行する新規薬物標的を特定することは、科学的な優先事項です。そのために、ここでは、遺伝子の枯渇ががん細胞株スフェロイドに与える影響を調べるための機能ゲノミクスアプローチについて説明します。これは、in...

癌細胞スフェロイド培養における潜在的に新規薬剤標的を同定するためのスクリーニング機能ゲノミクスを利用

ここのプロトコルでは、小分子脂質リガンド ホスファチジルイノシトール 4, 5-ビスリン酸 (PIP2) と精製 hEAG1 イオン チャネル蛋白質の相互作用について説明します。測定は、バリでした小分子イオン チャネル...

バイオ層干渉法による小分子とイオン チャネル蛋白質の相互作用の動力学をキャプチャ

ここで我々 はプロトコルを記述する腫瘍溶解性ウイルス治療を高めるために操作することができますホスト ターゲットを明らかにするハイスループット RNAi スクリーニングを採用するため特に rhabodvirus ワクシニア...

腫瘍溶解性ウイルス治療を調節するホストの要因を識別するために全ゲノム RNAi スクリーニング

このプロトコルは、プローブベースのリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、スルフォルホダミンB(SRB)アッセイ、3'未翻訳領域(3'UTR)クローニング、および目的のmiRNAの標的遺伝子を検証し、miRNAの機能を理解するためにルシフェラーゼアッセイを使用します。...

腫瘍細胞におけるマイクロRNAレベル、機能、および関連する標的遺伝子を評価するためのインビトロプロトコル

これは、抑制剤または癌転移のドライバーをスクリーニングするための効果的な方法です。発現ライブラリーを用いて細胞を導入し、鶏絨毛管内膜血管構造中に注入して転移性コロニーを形成する。浸潤性の減少または増加を有するコロニーは、切除、拡張、再注入して表現型を確認し、最後に、ハイスループットシーケンシングを用いて分析する。...

迅速かつ定量的なチック絨毛管内膜モデルを用いた転移性調節因子の発見

私たちは、遺伝子改変マウスモデルで発生した腫瘍の治療標的と対応するヒト腫瘍の種類を同定および比較するために、ゲノム解析と機能的ゲノムスクリーニングを利用した種間比較腫瘍ゲノミクスアプローチを開発しました。...

悪性末梢神経鞘腫瘍のマウスモデルにおける治療標的を特定するための遺伝子プロファイリングおよびゲノムスケールドロップアウトスクリーニング

ここでは、新規化合物が鉄をキレート化する能力を迅速かつ安価に確認できる蛍光アッセイについて説明します。このアッセイは、化合物が弱鉄キレート蛍光プローブCalceinの鉄結合活性を凌駕する能力を測定し、キレート化が起こると蛍光が定量化可能に増加します。...

新規化合物の鉄キレート化能力を確認するための定量可能で安価な無細胞蛍光法 

学ぶイオンチャネル機能解析とがん細胞生存率アッセイ法。GABAA受容体作動薬の治療効果を評価し、固形がん治療への新たな標的治療アプローチを確立する方法です。

がん細胞におけるイオンチャネルのスクリーニング

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