Name: 生きた酵母細胞におけるミトコンドリア過酸化物のレシオメトリックバイオセンサーmtHyPer7のイメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-02T12:55:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: 学ぶ 生きた酵母細胞におけるミトコンドリア過酸化物の定量イメージング法。レシオメトリックバイオセンサーmtHyPer7を用いてSaccharomyces cerevisiaeで水素過酸化物レベルを測定し、ミトコンドリア機能と老化研究に貢献します。

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著者らは、Katherine Filpo Lopez氏の専門的な技術支援に感謝します。この研究は、米国国立衛生研究所(NIH)(GM122589およびAG051047)からLPへの助成金によって支援されました。
これらの研究は、NIH/NCIがんセンター支援助成金P30CA013696から一部資金提供を受け、コロンビア大学ハーバート・アーヴィング総合がんセンターの共焦点および特殊顕微鏡共有リソースを使用した。

mtHyper7を用いた生酵母細胞における過酸化ミトコンドリアのイメージング

著者らは、利益相反がないことを宣言します。

このプロトコルでは、生きている出芽酵母細胞のミトコンドリアH2O 2を評価するバイオセンサーとしてmtHyPer7を使用するための方法が記述されている。このバイオセンサーは、CRISPRベースの方法を用いて構築され、選択可能なマーカーを使用せずに、酵母ゲノムの保存された無遺伝子領域に導入されます。プラスミド由来のバイオセンサーと比較して、統合されたバイオセンサーはすべての細胞で一貫したレベルで発現するため、より信頼性の高い定量結果が得られます。mtHyPer7発現細胞の作製に選択可能なマーカーを使用しないため、より広い範囲の株バックグラウンドの使用が可能で、バイオセンサー発現細胞の遺伝子改変が容易になります。mtHyPer7タンパク質は、ミトコンドリアの形態、機能、分布、または細胞増殖速度に顕著な影響を与えることなく、ミトコンドリアを正しく標的としています。mtHyPer7は、外部から添加されたH2O2に対する用量依存的な応答を示す。さらに、mtHyPer7は、ミトコンドリア品質の不均一性を細胞内分解能で報告することができます。最後に、ミトコンドリアを標的としたバイオセンサーのイメージングに広視野顕微鏡とは対照的に、スピニングディスク共焦点顕微鏡を使用すると、蛍光色素への光退色が少なくなり、細胞内の違いを分析するための高解像度画像が得られます。
制限事項と代替アプローチ この方法は、カバーガラスの下で細胞が乾燥してしまうため、10分以上細胞をイメージングするのには適していません。長期間のイメージングには、寒天パッド法46 を使用するか、またはSC培地で満たされたガラス底培養皿に細胞を固定化するのがよい。
バイオセンサーの選択は、実験条件下でのターゲットの濃度によって導かれるべきです。HyPer7 の感度が高すぎる場合は、HyPer3 や HyPerRed47,48 など、別の HyPer バージョンをお勧めします。ただし、他のHyPerプローブはよりpHに敏感であることに注意する必要があります。より高い感度を得るには、ペルオキシレドキシンベースのroGFP(roGFP2Tsa2ΔCR)がより適切である可能性があります27。
H2O2センサの酸化定常状態は、酸化速度と還元速度の両方に結びついています。バイオセンサーの酸化速度は、主にH2O2によって引き起こされるが、還元速度は、細胞および細胞小器官において活性化する抗酸化還元システムに依存する。HyPer7は、酵母細胞質のチオレドキシン系によって主に還元され、その還元はroGFP2Tsa2ΔCRの還元よりも速いことが示されています27。したがって、H2O2バイオセンサーの測定値を解釈する際には、プローブのさまざまな還元メカニズムおよび応答ダイナミクスを考慮に入れる必要があります。特に、バイオセンサの読み出しからH2O2レベルを推測するには、還元システムが実験中に一定の容量を維持すると仮定しなければならない。 ここで説明するスクリプトの代替として、酸化還元センサ49の分析のために、他の様々なソフトウェアが自由に利用可能になっている。
重要な手順 どのようなバイオセンサーでも、バイオセンサー自体が測定対象のプロセスに影響を与えないことを実証することが重要です。したがって、各実験条件下での菌株の増殖とミトコンドリア形態の比較は重要です。ここでは、ミトコンドリアの形態をMitoTracker Redを用いて評価し、膜電位依存的にミトコンドリアを染色します。しかし、形質転換されていない細胞とバイオセンサーで形質転換された細胞のミトコンドリアの比較は、膜電位を感知するミトコンドリアバイタル色素であるテトラメチルローダミンメチルエステル(TMRM)、または膜電位とは無関係にミトコンドリアを染色するMitoTracker Greenで染色することで行うことができます。有害な影響が疑われる場合は、発現レベルを下げるか、統合部位を変更すると役立つ場合があります。
プローブの線量反応挙動とイメージング技術のS/N比を検証することも、堅牢な結果を得るために不可欠です。グループ内の変動性がグループ間の変動性を超えると、差の検出が困難になります。グループ内変動は、真の母集団変動、または検出プロセスのノイズに起因する可能性があります。S/N比を上げるための重要なステップは、画像取得(ピクセル値の範囲とノイズ)、バックグラウンド減算、およびしきい値処理です。
また、計算ステップ中にノイズの影響を減らすこともできます。最も簡単なアプローチは、比率画像測定値(Results.csv)から加重平均強度を計算することであり、各ピクセルは励起効率間の局所的な比率を表します。これにより、「ピクセル単位」の比率が生成されます。ただし、イメージ信号:雑音比が低い場合は、分子チャネルと分母チャネルの両方でROIの加重平均強度を計算し、これら2つの加重平均間の比(「領域方向」比)を計算することで、よりロバストな結果を得ることができます。
閾値処理方法を選択するには、Fiji コマンドの Image |調整 |自動しきい値 を使用すると、すべての組み込みフィジーメソッドを自動的に試すことができます。セグメンテーション (しきい値処理) を評価するには、[ 編集] |選考 |選択範囲を作成し、( T キーを押して) ROI マネージャーに追加し、生の画像ファイルでアクティブ化します。ミトコンドリアが適切に検出されない場合は、別のセグメンテーション方法を試す必要があります。
画像を比較する際には、同一の撮影条件ですべての画像を取得し、すべての画像を同一のコントラスト強調で表示することが不可欠です。
ミトコンドリアの動きは、イメージング条件を最適化する際に考慮する必要があります。ミトコンドリアが405 nmと488 nmの励起の間で大きく移動する場合、比率画像は正確ではありません。露光時間を<500msに保ち、利用可能な最速の方法(トリガーパルスや音響光学チューナブルフィルターなど)で励起を変更することをお勧めします。Zスタックをキャプチャする場合、次のZステップに進む前に、各Zステップで両方の加振を実行する必要があります。
結果を表示する場合、色相(色)の変化は、強度の変化よりも人間の目には明らかです。そのため、比率の値は、視覚的に解釈しやすいようにカラースケールに変換されます。カラー化された画像には、すべてのミトコンドリアピクセルが同じ明るさで表示される非変調と、元の画像のピクセル強度を使用してカラー化された画像の強度を設定する強度変調があります。
変更とトラブルシューティング パラコートによる挑戦によるミトコンドリア機能の確認の代替として、細胞を複製播種するか、発酵性および非発酵性の炭素源に接種することができます。
バックグラウンド減算の場合、ローリングボール減算 ( [プロセス] |背景を減算...)また、照明の不均一性を除去するためにも使用できます。セルの存在によって減算される背景が変わらないことを確認する必要があります( [背景の作成 ]オプションをオンにして結果を調べます)。
要約すると、mtHyPer7プローブは、生細胞における酵母ミトコンドリアの形態学的および機能的状態を関連付けるための一貫した低侵襲な方法を提供し、遺伝的に扱いやすく、簡単にアクセスできるモデルシステムにおける重要な細胞ストレッサーおよびシグナル伝達分子の研究を可能にします。

ミトコンドリアは真核生物の必須細胞小器官であり、酸化的リン酸化と電子輸送によってATPを産生する機能でよく知られています1。さらに、ミトコンドリアはカルシウム貯蔵、脂質、アミノ酸、脂肪酸、鉄硫黄クラスターの合成、およびシグナル伝達の部位です2,3。細胞内では、ミトコンドリアは細胞の種類や代謝状態に応じて変化する特徴的な形態と分布を持つ動的ネットワークを形成しています。さらに、ミトコンドリアは融合して分裂することができますが、細胞内のすべてのミトコンドリアが同等であるとは限りません。多くの研究により、膜電位や酸化状態などの属性における個々の細胞内のミトコンドリアの機能的不均一性が文書化されています4,5,6。このミトコンドリア機能の変動は、mtDNAの突然変異(核DNAよりも高い割合で発生する)によるオルガネラの損傷と、オルガネラの内外で発生する活性酸素種(ROS)による酸化的損傷に一部起因している7,8,9。オルガネラへの損傷は、損傷を修復するか、修復できないほど損傷したミトコンドリアを排除するミトコンドリア品質管理メカニズムによって軽減されます10。
過酸化水素(H2O2)は、細胞タンパク質、核酸、および脂質に対する酸化的損傷の原因である活性酸素種である。しかしながら、H2O2は、標的タンパク質中のチオールの可逆的酸化を介して細胞活動を調節するシグナル伝達分子としても機能する11,12。H2O2は、ミトコンドリアの電子伝達鎖から漏れる電子から、およびNADPHオキシダーゼおよびモノアミンオキシダーゼ13、14、15、16、17、18、19、20などの特定の酵素によって生成される。また、チオレドキシンやグルタチオン21,22,23に基づくものを含む抗酸化システムによっても不活性化されます。したがって、ミトコンドリアH2O2レベルの分析は、正常なミトコンドリアおよび細胞機能におけるこの代謝産物の役割を理解するため、ならびに酸化ストレス条件下で重要である。
このプロトコルの全体的な目標は、細胞小器官(mtHyPer7)を標的とする遺伝的にコードされたレシオメトリックH2O2バイオセンサー、HyPer7を使用してミトコンドリアH2O2を検出することである。mtHyPer7は、ATP9由来のミトコンドリアシグナル配列(Su9前配列)、環状に置換された緑色蛍光タンパク質(GFP)、および髄膜炎菌由来のOxyRタンパク質のH2O2結合ドメインからなるキメラです24(図1)。環状に置換されたGFPでは、天然GFPのN末端とC末端が融合し、発色団の近くに新しい末端が形成され、天然GFP25と比較して、タンパク質への移動度が高く、スペクトル特性の不安定性が向上します。mtHyPer7のOxyRドメインとH2O2との相互作用は、親和性が高く、H2O2選択的であり、保存されたシステイン残基の可逆的な酸化およびジスルフィド架橋形成をもたらす。OxyRの酸化に伴う立体配座変化は、mtHyPer7の環状に置換されたGFPに転移し、その結果、mtHyPer7発色団の励起最大値が還元状態の405nmからH2O2酸化状態の488nmにスペクトルシフトする26。したがって、488nm対405nmでの励起に応答したmtHyPer7からの蛍光の比は、H2O2によるプローブの酸化を反映している。
理想的には、バイオセンサーは、標的分子のリアルタイム、絶対的、定量的な読み取りを提供する必要があります。しかし、残念ながら、これは実際の測定では必ずしも可能ではありません。mtHyPer7などの酸化センサーの場合、リアルタイム読み出しはジスルフィド架橋の減少率の影響を受けます。ROSバイオセンサーで使用される還元系は異なり、チオレドキシン系によって還元されたHyPer7と、酵母細胞質中のグルタチオンによって還元されたroGFP2-Tsa2ΔCRの比較によって示されるように、これらはプローブ応答のダイナミクスを劇的に変化させる可能性があります27。したがって、mtHyPer7比から相対的なH2O 2濃度について結論を導き出すには、還元システムが実験中に一定の容量を維持すると仮定する必要があります。これらの考察にもかかわらず、HyPer7および関連プローブは、生細胞25、28、29におけるH2O2に関する情報を得るために、様々な状況で用いられてきた。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65428/65428fig01.jpg"> 図1:H2O2バイオセンサーmtHyPer7の設計、分子メカニズム、および励起/発光スペクトル。 (A)mtHyPer7プローブは、髄膜炎菌由来のOxyR-RDドメインに環状に置換されたGFPを挿入することによって得られます。Neurospora crassa(Su9)由来のATP合成酵素のサブユニット9由来のミトコンドリア標的配列が含まれています。 (b)mtHyPer7のH2O2感知機構の説明図。RDドメインにおけるシステイン酸化は、488 nmでの励起による蛍光発光を増加させ、405 nmでの励起による発光を減少させます。(C)酸化型および還元型におけるHyPer7の励起および発光スペクトル。この図は、Pak et al.24の許可を得て転載したものです。略語:GFP =緑色蛍光タンパク質;cpGFP = 循環順列GFP。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
mtHyPer7のこのレシオメトリックイメージングは、ミトコンドリアH2O 2定量に重要な利点を提供します24,27;プローブ濃度の内部制御を提供します。さらに、H2O2曝露によって生じる励起ピークのシフトは、H 2 O2の飽和濃度においてさえ完全ではない。したがって、レシオイメージングは、分析に2つのスペクトルポイントを組み込むことで感度を高めることができます。
ここで用いるmtHyPer7プローブは、H2O2に対して非常に高い親和性を有し、pH24に対する感度が比較的低く、Caenorhabditis elegansミトコンドリア30を首尾よく標的としている。このタンパク質は酵母でも使用されています27,31。しかし、以前の研究では、mtHyPer7のプラスミド媒介発現に依存していたため、プローブ発現に細胞間のばらつきが生じていました27。さらに、このプロトコルで記述されている構成物はマーカーのない統合のためのCRISPRベースのアプローチを使用して染色体X32の保存された、遺伝子のない領域に統合された。統合されたバイオセンサー遺伝子の発現は、強力な構成的TEF1プロモーターによっても制御されます(図2)。その結果、酵母細胞集団におけるバイオセンサーの発現は、プラスミド由来バイオセンサーの発現を用いて観察されたものと比較して、より安定で一貫したものであり、バイオセンサーを有する細胞は、選択的培地を必要とせずに増殖することができる。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65428/65428fig02.jpg"> 図2:CRISPRによるmtHyPer7発現細胞の作製。 Cas9およびsgRNA含有プラスミド(YN2_1_LT58_X2site)およびPCR増幅mtHyPer7含有バイオセンサーコンストラクトは、酢酸リチウム変換によって出芽酵母細胞に導入されます。X染色体(X2)上の無遺伝子挿入部位は、sgRNAを持つCas9タンパク質によって認識・切断され、相同組換えによりバイオセンサーがゲノムに組み込まれます。顕微鏡スクリーニング、コロニーPCR、およびシーケンシングによって成功した形質転換体を同定した後、Cas9プラスミドを非選択的培地中で増殖させることで除去(硬化)します。略語: sgRNA = single guide RNA;TEF = 転写エンハンサー因子。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
最後に、mtHyPer7は他のROSバイオセンサーよりも優れています。例えば、活性酸素の検出に使用される有機色素(ジヒドロエチジウム[DHE]2やMitoSOX3など)は、不均一または非特異的な染色を引き起こす可能性があり、多くの場合、エタノールやジメチルスルホキシドなどの溶媒で送液されるため、溶媒効果に対する追加の制御が必要です。ROSバイオセンサーの別のクラスは、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)ベースのバイオセンサー(例えば、細胞酸化還元状態4用のレドックス蛍光、および過酸化物センサーHSP-FRET5、OxyFRET6、およびPerFRET6)です。これらのプローブは遺伝的にコードされており、原理的に高感度であり、十分に特徴付けられたミトコンドリアシグナル配列を使用してミトコンドリアを定量的に標的にすることができます。しかし、FRETベースのプローブの使用には、交差励起やブリードスルーによるバックグラウンド、FRETが起こるための蛍光色素の近接性や配向に関する厳しい要件など、課題があります33,34。さらに、FRETプローブは2つの蛍光タンパク質で構成されており、スペクトルシフトプローブと比較して、目的の細胞での発現にはより大きなコンストラクトが必要です。ここで説明するプロトコルは、HyPer7ベースのバイオセンサーの強みを活用し、このコンパクトでレシオメトリック、高親和性、遺伝的にコードされたプローブを使用して、生きた酵母のミトコンドリア中の過酸化物の定量的イメージングに使用するために開発されました。

<table><tbody><tr><td>100x/1.45 Plan Apo ラムダ対物レンズ</td><td>ニコン</td><td>MRD01905</td><td></td></tr><tr><td>アデニン硫酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9126</td><td></td></tr><tr><td>バクト寒天</td><td>BD Difco</td><td>DF0145170</td><td></td></tr><tr><td>バクトペプトン</td><td>BD Difco</td><td>DF0118170</td><td></td></tr><tr><td>バクトトリプトン</td><td>BD Difco</td><td>DF211705</td><td></td></tr><tr><td>バクト酵母エキス</td><td>BD Difco</td><td></td><td></td>DF0127179</tr><tr><td>BamHI</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>R0136S</td><td></td></tr><tr><td>BglII</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>R0144S</td><td></td></tr><tr><td>カルベニシリン</td><td>シグマ - アルドリッチ</td><td>C1389</td><td></td></tr><tr><td>カールツァイス イマーソル イマージョン オイル</td><td>カール ツァイス</td><td>444960</td><td></td></tr><tr><td>デキストロース (D-(+)-グルコース)</td> <td>シグマ - アルドリッチ</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>E. クローニ 10G 化学competent cell</td><td>Bioserch Technologies</td><td>60108</td><td></td></tr><tr><td></td><td>FIJI NIH</td><td></td><td>Schindelin et al 2012</td></tr><tr><td>G418 (Geneticin)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1720</td><td></td></tr><tr><td>GFP 蛍光フィルター</td><td>Chroma</td><td></td><td>525/50</td></tr><tr><td>Gibson assembly</td><td>New England Biolabs</td><td>E2611</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad Prism 7</td><td>GraphPad</td><td></td><td>https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/</td></tr> <tr><td>H2O2 (stable)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>HO-pGPD-mito-roGFP-KanMX6-HO</td><td>Pon Lab</td><td>JYE057/EP41</td><td>Liao et al 20201</td></tr><tr><td>Incubator Shaker</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>E24</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HiFi PCR kit</td><td>Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems,マサチューセッツ州ウィルミントン</td><td>KK1006</td><td></td></tr><tr><td>L-アルギニン塩酸塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8094</td><td></td></tr><tr><td>レーザー</td><td>Agilent</td><td></td><td>405 および 488 nm</td></tr><tr><td>L-ヒスチジン塩酸塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5659</td><td></td></tr><tr><td>L-ロイシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8912</td><td></td></tr><tr><td>L-リジン塩酸塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8662</td><td></td></tr><tr><td>L-メチオニン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9625</td><td></td></tr><tr><td>L-フェニルアラニン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5482</td><td></td></tr><tr><td>L-トリプトファン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8941</td><td></td></tr><tr><td>L-チロシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8566</td><td></td></tr><tr><td>mHyPer7 プラスミド</td><td>この研究</td><td>JYE116</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡カバースリップ</td><td>ThermoScientific</td><td>3406</td><td>#1.5(170 &マイクロ;</td></tr><tr><td>顕微鏡のスライド</td><td>ThermoScientific</td><td>3050</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker Red CM-H2Xros</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>M7513</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NEBuilder HiFiアセンブリ マスターミックス</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>E2621</td><td></td></tr><tr><td>ニコンエレメント</td><td>ニコン</td><td></td><td>顕微鏡取得ソフトウェア</td></tr><tr><td>Nikon Ti Eclipse倒立顕微鏡</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraquat (Methyl viologen dichloride hydrate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat. 856177&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>RStudio</td><td>Posit.co</td><td>無料デスクトップ版</td><td></td></tr><tr><td>分光光度計</td><td>ベックマン</td><td>BU530</td><td></td></tr><tr><td>ステージトップインキュベーター</td><td>東海ヒット</td><td>INU</td><td></td></tr><tr><td>ウラシル</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U1128</td><td></td></tr><tr><td>アミノ酸を含まない硫酸アンモニウムを含む酵母窒素塩基(YNB)</td><td>BD Difco</td><td>DF0919073</td><td></td></tr><tr><td>YN2_1_LT58_X2site</td><td>Addgene</td><td>177705</td><td>Pianale et al 2021</td></tr><tr><td>Zyla 4.2 sCMOSカメラ</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

生きた酵母細胞におけるミトコンドリア過酸化物のレシオメトリックバイオセンサーmthyper7のイメージング

Imaging of mtHyPer7, a Ratiometric Biosensor for Mitochondrial Peroxide, in Living Yeast Cells

ミトコンドリアの機能不全、または機能変化は、神経変性障害や筋骨格系障害、癌、正常な老化など、多くの疾患や症状に見られます。ここでは、遺伝的にコードされた低侵襲レシオメトリックバイオセンサーを使用して、生きた酵母細胞のミトコンドリア機能を細胞および細胞内の解像度で評価するアプローチについて説明します。バイオセンサーであるミトコンドリア標的HyPer7(mtHyPer7)は、ミトコンドリア中の過酸化水素(H2O2)を検出します。これは、環状に置換された蛍光タンパク質および細菌OxyRタンパク質のH2O2応答性ドメインに融合したミトコンドリアシグナル配列からなる。このバイオセンサーは、プラスミド由来のコンストラクトと比較してより一貫した発現のために、CRISPR-Cas9マーカーフリーシステムを使用して生成され、酵母ゲノムに組み込まれます。
mtHyPer7は、ミトコンドリアを定量的に標的とし、酵母の増殖速度またはミトコンドリア形態に検出可能な影響を及ぼさず、通常の増殖条件下および酸化ストレスへの曝露時に、ミトコンドリアH2O2の定量的読み出しを提供する。このプロトコルでは、スピニングディスク共焦点顕微鏡システムを使用してイメージング条件を最適化し、無料で入手できるソフトウェアを使用して定量分析を行う方法について説明します。これらのツールにより、細胞内および集団内の細胞間のミトコンドリアに関する豊富な時空間情報を収集することができます。さらに、ここで説明するワークフローは、他のバイオセンサーの検証にも使用できます。

mtHyPer7がミトコンドリアH2O2を評価するのに適したプローブであることを確認するために、mtHyPer7の局在および酵母のミトコンドリアおよび細胞の健康に対するその影響を評価した。mtHyPer7の標的を評価するために、ミトコンドリアを重要なミトコンドリア特異的色素MitoTracker Redで染色し、mtHyPer7を発現する対照酵母細胞および酵母で染色しました。MitoTracker Red染色を用いて、ミトコンドリアを母芽軸に沿って整列し、芽の先端および芽の遠位にある母細胞の先端に蓄積する長い管状構造として分離した41。ミトコンドリアの形態は、対照細胞とmtHyPer7発現細胞で類似していた。さらに、mtHyPer7はMitoTrackerの赤色染色ミトコンドリアと共局在しました(図3A)。したがって、mtHyPer7は、正常なミトコンドリアの形態や分布に影響を与えることなく、効率的かつ定量的にミトコンドリアを標的としました。
次に、ミトコンドリアの細胞適応度および酸化ストレスに対する感受性に対するmtHyPer7の効果を評価するために、追加の検証実験を実施しました。リッチまたは合成グルコースベースの培地(それぞれYPDまたはSC)におけるmtHyPer7発現細胞の増殖速度は、形質転換されていない野生型細胞の増殖速度と同様です(図3B、D)。ミトコンドリアの酸化ストレスに対する可能性のある影響を評価するために、対照酵母とmtHyPer7発現酵母を、ミトコンドリアに蓄積し、オルガネラのスーパーオキシドレベルを上昇させる酸化還元活性小分子である低レベルのパラコートで処理しました24,27。mtHyPer7発現がミトコンドリアに酸化ストレスを誘発するか、ミトコンドリアを酸化ストレスから保護する場合、mtHyPer7発現細胞は、それぞれパラコート処理に対する感受性の増加または低下を示すはずです。低レベルのパラコートで処理すると、酵母の増殖速度が低下しました。さらに、パラコートの存在下での野生型細胞とmtHyPer7発現細胞の増殖速度は類似していました(図3C、E)。したがって、バイオセンサーの発現は、出芽酵母細胞に有意な細胞ストレスを生じさせず、ミトコンドリアの酸化ストレスに対する酵母の感受性を変化させませんでした。
mtHyPer7が出芽酵母におけるミトコンドリアH2O2の研究に適しているという証拠を考慮して、mtHyPer7が中対数期の野生型酵母におけるミトコンドリアH2O2および外部添加H2O2によって誘発されるミトコンドリアH2O2の変化を検出できるかどうかを試験した。H2O2滴定実験を行い、ミトコンドリアにおける平均酸化:還元(O/R)mtHyPer7比を測定した。
自動分析スクリプトは、いくつかの出力ファイルを生成しました。
比画像(ratio.tif):バックグラウンド補正、閾値化された488 nmおよび405 nmスタックの比からなるZスタック。このスタックは、フィジーで追加の処理なしで表示できます。ただし、表示前に、プロトコルステップ4.3または5.6で説明されているように、コントラストを強調したり、画像を色付けしたりすることをお勧めします。
マスク画像(mask.tif):解析に用いる閾値ミトコンドリア領域からなるZスタック。この画像は、しきい値処理の精度を評価するために使用する必要があります。
解析に使用される ROI (ROIs.zip): このファイルをフィジーで開くと、ソース画像とともに ROI が画像に重ね合わされ、結果テーブルとソース画像が相互参照されます。各 ROI は、セル番号と ROI 番号で名前が変更されます。
分子、分母、および比率画像の各スライスの閾値ミトコンドリアの面積、平均、および積分密度をそれぞれ含む測定テーブル(NumResults.csv、DenomResults.csv、Results.csv)。ミトコンドリアが存在しない、または焦点が合っていないスライスでは、NaNが記録されます。
バックグラウンドとノイズの補正、しきい値、および比率の計算に使用されるオプションを文書化したログファイル(Log.txt)。
mtHyPer7のO/R比は、H2O2濃度に対する用量依存的な反応を示し、外用H2O2で1〜2mMでプラトーに達した(図7)。驚くべきことに、HyPer7比は、0.1mMH2O2に曝露された細胞では、対照細胞よりも低かったが、この差は統計的に有意ではなかった。この現象の1つの説明は、低レベルのストレッサーへの曝露が抗酸化メカニズムなどのストレス応答を誘発し、プローブによって検出可能なROSの量を低下させるホルミシス応答である可能性があります。対照的に、ストレッサーのレベルが高いと、内部ストレス応答が圧倒され、HyPer7からの読み取り値が高くなる可能性があります。
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65428/65428fig07.jpg"> 図7:外部添加H2O2に対するmtHyPer7の応答。 (a)異なる濃度のH2O2に曝露された中対数期の細胞における405nmおよび488nmの励起画像の最大投影およびmtHyPer7のレシオメトリック画像の平均強度投影。疑似色は、酸化:還元されたmtHyPer7比を示します(下部の目盛り)。スケールバー = 1 μm。セルのアウトラインは白で表示されます。n &gt;条件ごとに 100 個のセル。(B)異なる濃度のH2O2で処理した出芽酵母細胞における酸化:減少した比率のmtHyPer7の定量。5 つの独立した試行の平均が、試行ごとに異なる形と色の記号で示されています。酸化:還元mtHyPer7の比率の平均±SEM:1.794±0.07627(無処理)、1.357±0.03295(0.1mM)、2.571±0.3186(0.5mM)、6.693±0.5194(1mM)、7.017±0.1197(2mM)。p &lt; 0.0001 (テューキーの多重比較検定による一元配置分散分析)。 p 値は ****p &lt; 0.0001 と表されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428fig07large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
最後に、これまでの研究により、より還元され、スーパーオキシドの含有量が少ないフィッティングミトコンドリアは、酵母娘細胞に優先的に受け継がれ4、細胞質カタラーゼは酵母娘細胞に輸送され、活性化されることが明らかになった42,43,44,45。これらの研究は、酵母細胞分裂中のミトコンドリアの非対称遺伝と、娘細胞の適応度と寿命、および母娘の年齢の非対称性におけるこのプロセスの役割を文書化しています。H2O2の違いが母細胞と芽の間に存在するかどうかを調べるために、mtHyPer7を芽と母細胞で測定した。酵母細胞内ではミトコンドリアH2O2の差が観察され、母細胞内のミトコンドリアと比較して、芽のミトコンドリアではH2O2バイオセンサーの読み出しの微妙ではあるが統計的に有意な減少が検出された(図8)。これらの知見は、蕾のミトコンドリアが酸化ストレスからよりよく保護されているというこれまでの知見と一致している。また、mtHyPer7は、出芽酵母における細胞内および細胞内分解能を有するミトコンドリアH2O2の定量的読み出しを提供できるという文書も提供している。
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65428/65428fig08.jpg"> 図8:ミトコンドリアH2O2レベルは、娘細胞においてより低い。 (A)代表細胞におけるmtHyPer7のレシオメトリック画像の最大投影。疑似色は、酸化:還元されたmtHyPer7比を示します(下部の目盛り)。比率の細胞内差は明らかです(矢印)。スケールバー = 1 μm。セルの輪郭:白。(B)芽と母細胞のmtHyPer7比の差。個々の細胞ごとに、芽の比率値から母比の値を減算し、点としてプロットしました。n = 193個の細胞を5つの独立した実験からプールし、実験ごとに異なる色の記号で示しました。芽細胞と母細胞のmtHyPer7比の差の平均±SEM:-0.04297±0.01266。p = 0.0008 (対応のあるt検定) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428fig08large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
補足表S1:本研究で用いた菌株。 使用した酵母菌株のリスト。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428_Supplemental%20Table%201%20Strains%20used%20in%20this%20study-R2.xls" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足表S2:この研究で使用したプラスミド。 使用したプラスミドのリスト。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/Supplemental%20Table%202%20Plasmids%20used%20in%20this%20study-R2.xls" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足表S3:本研究で使用したプライマー。 使用したプライマーのリスト。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428_Supplemental%20Table%203%20Primers%20used%20in%20this%20study-R2.xls" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル1: biosensorのプラスミッド構造のためのプロトコル。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/65428_Yang%20et%20al%20Supp%20Protocol%202023.docx" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル 2: 自動分析用のスクリプト。 スクリプトごとに、サンプル入力ファイルと出力ファイルが提供されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65428/biosensor-supplemental-coding-files.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

過酸化水素(H2O2)は、酸化的損傷の原因であり、シグナル伝達分子でもあります。このプロトコルは生きているイーストのミトコンドリア目標とされたHyPer7 (mtHyPer7)の遺伝的にコードされたratiometricバイオセンサーを使用してミトコンドリアH2O2 を測定する方法を記述する。イメージング条件を最適化し、無料で入手できるソフトウェアを使用して定量的な細胞および細胞内解析を実行する方法について詳しく説明します。

生きた酵母細胞におけるミトコンドリア過酸化物のレシオメトリックバイオセンサーmtHyPer7のイメージング

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, ...

ミトコンドリアは細胞内の細胞小器官であり、エネルギー動員、中枢代謝、重要な高分子の産生、カルシウム貯蔵、シグナル伝達を促進します。その結果、それらは細胞機能、適応度、および寿命の制御において重要な役割を果たします。本研究では、出芽酵母Saccharomyces cerevisiaeをモデル生物として、ミトコンドリアが老化に及ぼす影響を調べる研究を行っています。ライブセルイメージングは、ミトコンドリア機能の変動を観察するための最良のツールです。ここでは、ミトコンドリアHyPer7と呼ばれる遺伝的にコードされた比率メトリックスペクトルシフトバイオセンサーを利用する方法について説明します。mtHyPer7は、細胞成分を損傷するだけでなく、生細胞のミトコンドリアのシグナル伝達分子としても機能する活性酸素種である過酸化水素を検出します。mtHyPer7は過酸化水素に対する親和性が高く、pHに対する感受性が低い。酵母ゲノムに組み込まれているため、酵母細胞集団で安定した一貫した発現が得られます。最後に、ミトコンドリアを定量的に標的としており、細胞やミトコンドリアの機能やフィットネスに検出可能な影響はありません。mtHyPer7のようなバイオセンサーは、ミトコンドリア機能を細胞内分解能で研究し、ミトコンドリアの品質管理の根底にあるメカニズムを発見し、そのプロセスが細胞の適応度、飼料、寿命にどのように影響するかを調べるために重要です。mtHyPer7染色剤は、活性酸素種検出に利用される有機色素とは対照的に、一貫した働きを提供します。フレットベースのセンサと比較して、mtHyPer7はよりコンパクトで、交差励起やブリードスルーなどの問題や、FRETの正確な位置決めと配向要件を回避します。

imaging-mthyper7-ratiometric-biosensor-for-mitochondrial-peroxide

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)培養のためのプロトコール、蛍光標識された微小管増殖マーカーの一過性トランスフェクション、生細胞イメージング、および間期微小管成長ダイナミクスの自動分析が詳細に説明されています。...

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ミトコンドリアは、それらが細胞内の細胞質ゾルのCa 2+シグナル伝達を形成することができ、カルシウム（Ca 2+）隔離する彼らの内膜（ΔΨm）を横切って電気化学ポテンシャルを利用することができます。我々は、同時に、蛍光色素、共焦点顕微鏡を使用して、生細胞中のミトコンドリアの Ca 2+取り込みおよびΔΨmを測定するための方法を記載します。...

蛍光顕微鏡による生細胞内のミトコンドリアのカルシウムとミトコンドリア膜電位の同時測定

我々は、動的細胞突起の長さに沿った相対的なタンパク質濃度の半自動追跡のためのソフトウェアソリューションを提示する。...

動的細胞突起におけるソフトウェア支援トラッキングのためのグラフィカルユーザインタフェース

このプロトコルは、市販のDNAゲル染色を有するミトコンドリアヌクレオイドの特異的標識、超分解能構造照明顕微鏡(SR-SIM)による生細胞のタイムラプスシリーズの取得、およびヌクロイド運動の自動追跡を記述する。...

タイムラプス構造照明顕微鏡のためのミトコンドリアヌクレオイドの特異的標識

学ぶ 生きた酵母細胞におけるミトコンドリア過酸化物の定量イメージング法。レシオメトリックバイオセンサーmtHyPer7を用いてSaccharomyces cerevisiaeで水素過酸化物レベルを測定し、ミトコンドリア機能と老化研究に貢献します。

生きた酵母細胞におけるミトコンドリア過酸化物のレシオメトリックバイオセンサーmtHyPer7のイメージング

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