生きた酵母細胞におけるミトコンドリア過酸化物のレシオメトリックバイオセンサーmtHyPer7のイメージング
2023年6月2日
過酸化水素(H2O2)は、酸化的損傷の原因であり、シグナル伝達分子でもあります。このプロトコルは生きているイーストのミトコンドリア目標とされたHyPer7 (mtHyPer7)の遺伝的にコードされたratiometricバイオセンサーを使用してミトコンドリアH2O2 を測定する方法を記述する。イメージング条件を最適化し、無料で入手できるソフトウェアを使用して定量的な細胞および細胞内解析を実行する方法について詳しく説明します。
ミトコンドリアは細胞内の細胞小器官であり、エネルギー動員、中枢代謝、重要な高分子の産生、カルシウム貯蔵、シグナル伝達を促進します。その結果、それらは細胞機能、適応度、および寿命の制御において重要な役割を果たします。本研究では、出芽酵母Saccharomyces cerevisiaeをモデル生物として、ミトコンドリアが老化に及ぼす影響を調べる研究を行っています。
ライブセルイメージングは、ミトコンドリア機能の変動を観察するための最良のツールです。ここでは、ミトコンドリアHyPer7と呼ばれる遺伝的にコードされた比率メトリックスペクトルシフトバイオセンサーを利用する方法について説明します。mtHyPer7は、細胞成分を損傷するだけでなく、生細胞のミトコンドリアのシグナル伝達分子としても機能する活性酸素種である過酸化水素を検出します。
mtHyPer7は過酸化水素に対する親和性が高く、pHに対する感受性が低い。酵母ゲノムに組み込まれているため、酵母細胞集団で安定した一貫した発現が得られます。最後に、ミトコンドリアを定量的に標的としており、細胞やミトコンドリアの機能やフィットネスに検出可能な影響はありません。
mtHyPer7のようなバイオセンサーは、ミトコンドリア機能を細胞内分解能で研究し、ミトコンドリアの品質管理の根底にあるメカニズムを発見し、そのプロセスが細胞の適応度、飼料、寿命にどのように影響するかを調べるために重要です。mtHyPer7染色剤は、活性酸素種検出に利用される有機色素とは対照的に、一貫した働きを提供します。フレットベースのセンサと比較して、mtHyPer7はよりコンパクトで、交差励起やブリードスルーなどの問題や、FRETの正確な位置決めと配向要件を回避します。
概要
本研究では、出芽酵母Saccharomyces cerevisiaeにおけるミトコンドリア機能を調査し、過酸化水素（H2O2）が損傷剤およびシグナル伝達分子の両方として果たす役割に焦点を当てています。研究者は、遺伝子組み換えによるレシオメトリック・バイオセンサーmtHyPer7を用い、生細胞内のミトコンドリアH2O2を定量的に測定する方法について述べています。
研究の主要構成要素
研究分野
- ミトコンドリア機能
- 酸化ストレス
- 酵母の老化
背景
- ミトコンドリアは細胞のエネルギー産生とシグナル伝達に不可欠である。
- H2O2は酸化ストレスによる損傷を引き起こすが、シグナル伝達経路においても機能する。
- ミトコンドリアの機能状態（フィットネス）は、細胞の寿命および健康状態に関連している。
使用した手法
- mtHyPer7バイオセンサーを用いた生細胞イメージング
- モデル生物：Saccharomyces cerevisiae
- 定量解析のための蛍光顕微鏡観察
主な結果
- 生きた酵母細胞におけるミトコンドリアH2O2レベルのイメージングに成功した。
- イメージングおよびイメージング解析のための最適条件を確立した。
- mtHyPer7が細胞機能や適応度に影響を与えないことを実証した。
結論
- 本研究では、ミトコンドリアH2O2を測定するための信頼性の高い手法と、それが細胞の健康に及ぼす影響について示しています。
- 本研究は、ミトコンドリアの品質管理とそれが老化に及ぼす影響の理解に寄与します。
よくある質問
産業界における重要性
生きた酵母細胞におけるミトコンドリア過酸化水素の定量イメージングは、細胞の健康状態や疾患モデリングの重要な決定要因であるミトコンドリアの還元状態の精密な解析を可能にします。mtHyPer7バイオセンサーは、酸化ストレスに関する堅牢で再現性の高いリードアウトを提供し、創薬パイプラインにおける初期段階のターゲットバリデーションおよびメカニズムのリスク低減を支援します。この機能により、老化、代謝疾患、および細胞品質管理に関連するミトコンドリア機能研究の予測信頼性が向上します。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- ミトコンドリア内のH2O2を直接測定でき、酸化還元駆動型のメカニズムを解明することが可能です。
- ミトコンドリア品質管理パスウェイの機能的検証をサポートします。
- シグナル伝達と損傷を引き起こす酸化事象を区別することで、メカニズムのデリスキングを促進します。
- ゲノム統合による安定したバイオセンサー発現により、一貫性のある生物学的解析を提供します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- アッセイの標準化と再現性に適した、定量的な比率形式（ラシオメトリック）の出力を提供します。
- ミトコンドリアのレドックス調節を標的とした化合物スクリーニングのための、バリデーション済み酵母モデルを構築します。
- 堅牢な信号安定性と最小限のバックグラウンド干渉により、ハイコンテントイメージングのワークフローを可能にします。
- 化合物の比較評価に向けた、プラットフォームに対応した拡張可能なリードアウトをサポートします。
トランスレーショナル・前臨床研究
- モデルシステムにおけるミトコンドリアの還元電位測定を、疾患関連表現型と整合させます。
- ミトコンドリア標的介入の探索から前臨床検証までの連続性を可能にします。
- ミトコンドリア研究ポートフォリオにおいて、リスク調整後の進展判断のための定量的エンドポイントを提供します。
- 酸化ストレスおよびミトコンドリア機能不全のバイオマーカー開発を促進します。
パイプラインおよびワークフローの統合
mtHyPer7のイメージングワークフローは、初期段階の発見からアッセイの開発、さらには前臨床研究までを統合し、仮説主導の研究とトランスレーショナルな継続性をサポートします。
- 発見生物学：定量的なバイオセンサーイメージングにより、ミトコンドリアのレドックス機構の仮説検証およびパスウェイマッピングが可能になります。
- スクリーニング：比率計量的な出力と安定した発現により、化合物スクリーニングのための再現性と拡張性のあるアッセイ開発がサポートされます。
- 分析：異なる条件下および細胞集団間におけるミトコンドリアH2O2レベルの堅牢な統計的比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：前臨床モデルのバリデーションのための、疾患に関連した定量的なエンドポイントを提供します。
- エンタープライズ再利用：ゲノム統合バイオセンサー株およびオープンソースの解析スクリプトにより、プロジェクト間およびチーム間での導入が促進されます。
運用および企業への影響
- 科学的価値：ミトコンドリア標的のバリデーションおよびメカニズム研究における予測の信頼性を向上させます。
- 運用的価値：イメージングおよび解析ワークフローを標準化し、再現性と拡張性を確保します。
- 戦略的価値：ミトコンドリア研究プログラムにおけるgo/no-go判断を改善し、後段階における生物学的リスクを低減します。
- ポートフォリオへの影響：ミトコンドリア標的および介入策のリスク調整後の優先順位付けを可能にします。
実施上の検討事項
- 生細胞イメージングおよび定量的蛍光解析の専門知識が必要である。
- 回転ディスク共焦点顕微鏡および互換性のある解析ソフトウェア（例：Fiji/ImageJ）へのアクセスが必要である。
- 再現性を確保するため、イメージングパラメータおよび解析スクリプトのチーム間での標準化が求められる。
- プロトコルの最適化により、他のバイオセンサーやモデルシステムへの適用が可能である。
- 信頼性の高い出力を得るには、一貫したゲノム統合および発現に依存する。
