Name: 悪性末梢神経鞘腫瘍のマウスモデルにおける治療標的を特定するための遺伝子プロファイリングおよびゲノムスケールドロップアウトスクリーニング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-25T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: 学ぶゲノム規模shRNAスクリーニングとバイオインフォマティクスを用いた悪性末梢神経鞘腫瘍の治療標的の同定。erbB3などの重要な受容体を発見し、新規治療開発に貢献します。

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この研究は、国立神経疾患・脳卒中研究所(R01 NS048353およびR01 NS109655 to S.L.C.;R01 NS109655-03S1 から D.P.J.)、国立がん研究所 (R01 CA122804 から S.L.C.)、および国防総省 (X81XWH-09-1-0086 および W81XWH-12-1-0164 から S.L.C. へ)。

腫瘍の治療標的を同定し比較するためのゲノムスケールスクリーニング

<ol><li>Carroll, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+promoting+the+pathogenesis+of+Schwann+cell+neoplasms%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms promoting the pathogenesis of Schwann cell neoplasms.</a> Acta Neuropathol. 123 (3), 321-348 (2012).</li>
<li>Longo, J. F., Weber, S. M., Turner-Ivey, B. P., Carroll, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+Advances+in+the+Diagnosis+and+Pathogenesis+of+Neurofibromatosis+Type+1+%28NF1%29-associated+Peripheral+Nervous+System+Neoplasms%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Anat+Pathol%22%5BJournal%5D)">Recent Advances in the Diagnosis and Pathogenesis of Neurofibromatosis Type 1 (NF1)-associated Peripheral Nervous System Neoplasms.</a> Adv Anat Pathol. 25 (5), 353-368 (2018).</li>
<li>Longo, J. F., Carroll, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RASopathies%3A+Biology%2C+genetics+and+therapeutic+options%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The RASopathies: Biology, genetics and therapeutic options.</a> Adv Cancer Res. 153, 305-341 (2022).</li>
<li>Birindelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rb+and+TP53+pathway+alterations+in+sporadic+and+NF1-related+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Rb and TP53 pathway alterations in sporadic and NF1-related malignant peripheral nerve sheath tumors.</a> Lab Invest. 81 (6), 833-844 (2001).</li>
<li>Legius, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TP53+mutations+are+frequent+in+malignant+NF1+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Chromosomes+Cancer%22%5BJournal%5D)">TP53 mutations are frequent in malignant NF1 tumors.</a> Genes Chromosomes Cancer. 10 (4), 250-255 (1994).</li>
<li>Menon, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+17p+deletions+and+p53+gene+mutations+associated+with+the+formation+of+malignant+neurofibrosarcomas+in+von+Recklinghausen+neurofibromatosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chromosome 17p deletions and p53 gene mutations associated with the formation of malignant neurofibrosarcomas in von Recklinghausen neurofibromatosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (14), 5435-5439 (1990).</li>
<li>Upadhyaya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+and+somatic+NF1+gene+mutation+spectrum+in+NF1-associated+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors+%28MPNSTs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mutat%22%5BJournal%5D)">Germline and somatic NF1 gene mutation spectrum in NF1-associated malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs).</a> Hum Mutat. 29 (1), 74-82 (2008).</li>
<li>Kourea, H. P., Orlow, I., Scheithauer, B. W., Cordon-Cardo, C., Woodruff, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletions+of+the+INK4A+gene+occur+in+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors+but+not+in+neurofibromas%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Deletions of the INK4A gene occur in malignant peripheral nerve sheath tumors but not in neurofibromas.</a> Am J Pathol. 155 (6), 1855-1860 (1999).</li>
<li>Nielsen, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malignant+transformation+of+neurofibromas+in+neurofibromatosis+1+is+associated+with+CDKN2A%2Fp16+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Malignant transformation of neurofibromas in neurofibromatosis 1 is associated with CDKN2A/p16 inactivation.</a> Am J Pathol. 155 (6), 1879-1884 (1999).</li>
<li>Gregorian, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTEN+dosage+is+essential+for+neurofibroma+development+and+malignant+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">PTEN dosage is essential for neurofibroma development and malignant transformation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (46), 19479-19484 (2009).</li>
<li>Lee, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRC2+is+recurrently+inactivated+through+EED+or+SUZ12+loss+in+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">PRC2 is recurrently inactivated through EED or SUZ12 loss in malignant peripheral nerve sheath tumors.</a> Nat Genet. 46 (11), 1227-1232 (2014).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+mutations+of+SUZ12+in+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Somatic mutations of SUZ12 in malignant peripheral nerve sheath tumors.</a> Nat Genet. 46 (11), 1170-1172 (2014).</li>
<li>Varela, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+structural+rearrangements+in+genetically+engineered+mouse+mammary+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Somatic structural rearrangements in genetically engineered mouse mammary tumors.</a> Genome Biol. 11 (10), 100(2010).</li>
<li>Johnson, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-species+genomics+matches+driver+mutations+and+cell+compartments+to+model+ependymoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cross-species genomics matches driver mutations and cell compartments to model ependymoma.</a> Nature. 466 (7306), 632-636 (2010).</li>
<li>Kim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+oncogenomics+identifies+NEDD9+as+a+melanoma+metastasis+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comparative oncogenomics identifies NEDD9 as a melanoma metastasis gene.</a> Cell. 125 (7), 1269-1281 (2006).</li>
<li>Zender, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+validation+of+oncogenes+in+liver+cancer+using+an+integrative+oncogenomic+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification and validation of oncogenes in liver cancer using an integrative oncogenomic approach.</a> Cell. 125 (7), 1253-1267 (2006).</li>
<li>Uren, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+mutagenesis+in+p19%28ARF%29-+and+p53-deficient+mice+identifies+cancer+genes+and+their+collaborative+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Large-scale mutagenesis in p19(ARF)- and p53-deficient mice identifies cancer genes and their collaborative networks.</a> Cell. 133 (4), 727-741 (2008).</li>
<li>Starr, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transposon-based+genetic+screen+in+mice+identifies+genes+altered+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A transposon-based genetic screen in mice identifies genes altered in colorectal cancer.</a> Science. 323 (5922), 1747-1750 (2009).</li>
<li>Dupuy, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+sleeping+beauty+transposon+system+that+can+be+used+to+model+a+wide+variety+of+human+cancers+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A modified sleeping beauty transposon system that can be used to model a wide variety of human cancers in mice.</a> Cancer Res. 69 (20), 8150-8156 (2009).</li>
<li>Carroll, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Challenge+of+Cancer+Genomics+in+Rare+Nervous+System+Neoplasms%3A+Malignant+Peripheral+Nerve+Sheath+Tumors+as+a+Paradigm+for+Cross-Species+Comparative+Oncogenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">The Challenge of Cancer Genomics in Rare Nervous System Neoplasms: Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumors as a Paradigm for Cross-Species Comparative Oncogenomics.</a> Am J Pathol. 186 (3), 464-477 (2016).</li>
<li>Huijbregts, R. P., Roth, K. A., Schmidt, R. E., Carroll, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypertrophic+neuropathies+and+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors+in+transgenic+mice+overexpressing+glial+growth+factor+beta3+in+myelinating+Schwann+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Hypertrophic neuropathies and malignant peripheral nerve sheath tumors in transgenic mice overexpressing glial growth factor beta3 in myelinating Schwann cells.</a> J Neurosci. 23 (19), 7269-7280 (2003).</li>
<li>Kazmi, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mice+overexpressing+neuregulin-1+model+neurofibroma-malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+progression+and+implicate+specific+chromosomal+copy+number+variations+in+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Transgenic mice overexpressing neuregulin-1 model neurofibroma-malignant peripheral nerve sheath tumor progression and implicate specific chromosomal copy number variations in tumorigenesis.</a> Am J Pathol. 182 (3), 646-667 (2013).</li>
<li>Brosius, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuregulin-1+overexpression+and+Trp53+haploinsufficiency+cooperatively+promote+de+novo+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Neuregulin-1 overexpression and Trp53 haploinsufficiency cooperatively promote de novo malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis.</a> Acta Neuropathol. 127 (4), 573-591 (2014).</li>
<li>Hart, T., Brown, K. R., Sircoulomb, F., Rottapel, R., Moffat, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+error+rates+in+genomic+perturbation+screens%3A+gold+standards+for+human+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Measuring error rates in genomic perturbation screens: gold standards for human functional genomics.</a> Mol Syst Biol. 10 (7), 733(2014).</li>
<li>Hart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+Design+of+Genome-Wide+CRISPR%2FSpCas9+Knockout+Screens%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Evaluation and Design of Genome-Wide CRISPR/SpCas9 Knockout Screens.</a> G3. 7 (8), Bethesda. 2719-2727 (2017).</li>
<li>Longo, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+genomic+characterization+of+a+sporadic+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Establishment and genomic characterization of a sporadic malignant peripheral nerve sheath tumor cell line.</a> Sci Rep. 11 (1), 5690(2021).</li>
<li>Maser, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomally+unstable+mouse+tumours+have+genomic+alterations+similar+to+diverse+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chromosomally unstable mouse tumours have genomic alterations similar to diverse human cancers.</a> Nature. 447 (7147), 966-971 (2007).</li>
<li>Rahrmann, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+genetic+screen+for+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+formation+identifies+new+genes+and+pathways+driving+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Forward genetic screen for malignant peripheral nerve sheath tumor formation identifies new genes and pathways driving tumorigenesis.</a> Nat Genet. 45 (7), 756-766 (2013).</li>
</ol>

著者には開示すべき利益相反はありません。

ここで紹介する詳細な方法は、末梢神経系腫瘍とMPNSTの病因を研究するために開発されました。これらの方法は効果的であることがわかりましたが、ここで説明する方法にはいくつかの潜在的な制限があることを認識する必要があります。以下では、これらの制限のいくつかと、他のモデルシステムでそれらを克服するための潜在的な戦略について説明します。
我々は、全エクソームシーケンシングがP 0-GGFβ3マウスの目的の変異を効果的に同定することを見出しました。ただし、全エクソームシーケンシング自体には限界があることを認識する必要があります。第一に、全エクソームシーケンシングは、融合遺伝子産物を同定するための効果的なアプローチではありません。これは、染色体切断とその後の融合の大部分が、ゲノムの大部分を占める遺伝子間領域とイントロンが主に関与しているためです。その代わりに、ペアエンドリードのRNA-Seqの方が、融合遺伝子をより効果的に同定できることを発見しました。また、全エクソームシーケンシングが染色体喪失の比較的大きな領域をどの程度効果的に同定するかという問題もあります。
...

悪性末梢神経鞘腫瘍(MPNST)は、腫瘍感受性症候群神経線維腫症1型(NF1)に関連して発生する非常に攻撃的な紡錘細胞腫瘍であり、一般集団および以前の放射線療法の部位で散発的に発生します1,2,3。NF1患者は、NF1腫瘍抑制遺伝子の野生型コピーと、機能喪失変異を有する第2のNF1対立遺伝子を持って生まれる。このハプロ不全の状態により、NF1患者は野生型NF1遺伝子の2回目の機能喪失変異の影響を受けやすくなり、腫瘍形成を引き起こします。この「セカンドヒット」NF1変異がシュワン細胞系統の細胞に発生すると、結果として生じる腫瘍は、皮膚に発生する真皮神経線維腫か、大神経または神経叢に発生する網状神経線維腫のいずれかである。皮膚神経線維腫と網状神経線維腫の病理は同じですが、それらの生物学的挙動はまったく異なります-真皮神経線維腫と網状神経線維腫はどちらも良性ですが、網状神経線維腫のみが形質転換を受け、MPNSTを引き起こす可能性があります。NF1遺伝子によってコードされるRas GTPase活性化タンパク質であるニューロフィブロミンの喪失に加えて、MPNSTは、TP53 4,5,6,7、CDKN2A 8,9、およびPTEN 10、ポリコーム抑制複合体の構成要素をコードする遺伝子の変異を含む、他の複数の腫瘍抑制遺伝子の変異を運びます2 11,12 (PRC2; SUZ12およびEED遺伝子)および受容体チロシンキナーゼの異常な発現1,2。NF1および上記の他の遺伝子の変異は、散発性および放射線誘発性MPNSTにも存在する11,12。
MPNSTのゲノム異常の理解におけるこれらの進歩は、その病因を理解する上で非常に貴重ですが、MPNSTの効果的な新しい治療法の開発にはまだ至っていません。新しい治療法の開発を妨げる大きな障壁は、MPNSTがまれながんであるという事実です。このため、The Cancer Genome Atlas(TCGA)で実施されているような主要なドライバー変異を定義する全体的な解析に必要な多数の患者サンプルを入手することは困難です。私たちの経験では、適度な数のヒトMPNST標本を蓄積するだけでも何年もかかることがあります。このような限界を克服するために、他の希少がん種を研究する多くの研究者は、種間比較腫瘍ゲノミクスを使用して、必須のドライバー遺伝子変異を同定し、目的の腫瘍に必須の細胞質シグナル伝達経路を定義し、新しい治療標的を特定しています。腫瘍形成に不可欠なシグナル伝達経路は、ヒトと他の脊椎動物種の間で高度に保存されているため、ゲノムスケールのshRNAスクリーニングなどの機能ゲノミクスアプローチを適用することは、これらの新しいドライバー変異、シグナル伝達経路、および治療標的を特定するための効果的な手段となり得ます13,14,15,16,17,18,19、特に限られた数で入手可能なまれなヒト腫瘍タイプを研究する場合20.
ここで紹介する方法論では、成長因子ニューレグリン-1(NRG1)のシュワン細胞特異的な過剰発現が叢状神経線維腫の病因とその後のMPNSTへの進行を促進する遺伝子改変マウスモデル(GEM)であるP0-GGFβ3マウスに由来するヒトMPNST細胞株および早期継代MPNST培養においてゲノムプロファイリングを実施するためのこのアプローチについて説明します21。22,23。このアプローチの最初のステップは、P 0-GGFβ3 MPNST、ヒトMPNST細胞株、および外科的に切除されたヒトMPNSTの候補ドライバー遺伝子を同定することです。次に、これらの変異の影響を受けるシグナル伝達経路を機能的に検証するために、ゲノムスケールのshRNAスクリーニングを使用して、ヒトおよびマウスのMPNST細胞株における増殖と生存に必要な遺伝子を同定します。増殖と生存に必要な遺伝子を同定した後、Drug Gene Interaction Databaseを用いて「ヒット」の集合体の中から創薬可能な遺伝子産物を同定します。また、ヒトとマウスのMPNST細胞の「ヒット」を比較して、GEMモデルとヒトMPNSTが同じ遺伝子とシグナル伝達経路に同様の依存性を示すかどうかを判断します。増殖と生存に必要な遺伝子の重複と、影響を受けるシグナル伝達経路を同定することは、P 0-GGFβ3マウスモデルを分子レベルで検証する手段として役立ちます。また、このアプローチでは、ヒトとマウスのスクリーニングを組み合わせて新しい治療標的を同定することの有効性も強調されており、マウスモデルはヒトのスクリーニングを補完する役割を果たすことができます。この異種間アプローチの価値は、ヒト腫瘍や細胞株の入手が困難な希少腫瘍の治療標的を探す場合に特に顕著です。

<table><tbody><tr><td>Bioruptor 超音波処理装置</td><td>Diagenode&nbsp;</td><td>UCD-600</td><td></td></tr><tr><td>CASAVA 1.8.2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cbot</td><td>Illumina, San Diego, CA</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Celigo Image Cytometer</td><td>Nexcelom</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Cellecta バーコードアナライザーおよびデコンボリューターソフトウェア</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Citrisolve Hybrid</td><td>Decon Laboratories</td><td>5989-27-5</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96ウェルブラックマイクロプレート</td><td>ミリポア シグマ</td><td>CLS3603</td><td></td></tr><tr><td>ディアゲノード バイオラプター 15ml コニカルチューブ</td><td>ディアゲノード&nbsp;</td><td></td><td></td>C30010009</tr><tr><td>dNTP mix</td><td>Clontech</td><td>639210</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y</td><td>Thermo Scientific</td><td>7111</td><td></td></tr><tr><td>Elution buffer</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>19086</td><td></td></tr>エ<tr><td>タノール(200プルーフ)</td><td>デコンラボラトリーズ</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>エクセル&nbsp;</td><td>マイクロソフト&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FWDGEX 5'-CAAGCAGACGGCATACGAGA-3'</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FWDHTS 5'-TTCTCTGGCAAGCAAAGACGGCATA-3'</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GexSeqS (5'AGAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGAA-3'</td><td></td><td></td><td>HPLC 精製</td></tr><tr><td>GraphPad プリズム</td><td>ドットマティクス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ハリス ヘマトキシリン</td><td>フィッシャーブランド</td><td>245-677</td><td></td></tr><tr><td>イルミナ HiScanSQ</td><td>イルミナ</td> サンディエゴ <td>該当なし パラ</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド (4%)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>J19943-K2</td><td></td></tr><tr><td>PLUS トランスフェクション試薬</td><td>Thermo Scientific</td><td>11514015</td><td></td></tr><tr><td>ポリブレントランスフェクション試薬</td><td>ミリポアシグマ</td><td>TR1003G</td><td></td></tr><tr><td>PureLink Quick PCR Purification Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K310001</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen Buffer P1</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>19051</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen ゲル抽出キット</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>RevGEX 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGA-3'</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>リビジョンHTS1 5'-TAGCCAACGCATCGCACAAGCCA-3'</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>チタンTaqポリメラーゼ</td>Clontech639210Trimmomatic<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ソフトウェア</td><td></td><td>www.usadellab.org</td><td></td></tr></tbody></table>

悪性末梢神経鞘腫瘍のマウスモデルにおける治療標的を特定するための遺伝子プロファイリングおよびゲノムスケールドロップアウトスクリーニング

Genetic Profiling and Genome-Scale Dropout Screening to Identify Therapeutic Targets in Mouse Models of Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor

悪性末梢神経鞘腫瘍(MPNST)は、シュワン細胞またはその前駆細胞に由来する。腫瘍感受性症候群神経線維腫症1型(NF1)の患者では、MPNSTは最も一般的な悪性腫瘍であり、主要な死因です。これらのまれで侵攻性の軟部肉腫は、5年無病生存率が34〜60%であり、厳しい未来を提供します。MPNST患者の治療選択肢は残念なことに限られており、外観を損なう手術が最も重要な治療選択肢です。Rasシグナル伝達の阻害剤であるチピファルニブなど、かつては有望視されていた多くの治療法が臨床的に失敗しています。同様に、上皮成長因子(EFGR)を標的とするエルロチニブ、血管内皮増殖因子受容体(VEGF)、血小板由来成長因子受容体(PDGF)、およびRafを標的とするソラフェニブを標準化学療法と併用した第II相臨床試験でも、患者に反応を示すことができませんでした。 
近年、がん細胞株の遺伝子プロファイリングと組み合わせた機能的ゲノムスクリーニング法は、必須の細胞質シグナル伝達経路の同定や標的特異的治療法の開発に有用であることが証明されています。稀な腫瘍型の場合、異種間比較腫瘍ゲノミクスとして知られるこのアプローチのバリエーションが、新規治療標的の同定にますます用いられている。異種間比較腫瘍ゲノミクスでは、遺伝子プロファイリングと機能ゲノミクスが遺伝子改変マウス(GEM)モデルで実施され、その結果が入手可能な希少なヒト検体および細胞株で検証されます。 
この論文では、全エクソームシーケンシング(WES)を使用して、ヒトおよびマウスのMPNST細胞における候補ドライバー遺伝子変異を同定する方法について説明します。次に、ゲノムスケールのshRNAスクリーニングを実施して、マウスおよびヒトMPNST細胞の重要なシグナル伝達経路を同定および比較し、これらの経路における創薬可能な標的を同定する方法について説明します。これらの方法論は、さまざまな種類のヒトがんにおける新しい治療標的を特定するための効果的なアプローチを提供します。

図5のプロットは、スクリーニングした各ヒト細胞株において、TRUEとラベル付けされたコア必須遺伝子(CEG)の枯渇スコアを、非CEG(FALSEとラベル付け)と比較したものです。ポイントは、個々の遺伝子の倍数枯渇スコアのlog2を表し、全体的なスコア分布の箱ひげ図表現にプロットされます。スチューデントの t検定は、各細胞株の2つのグループ間の枯渇スコアの平均の有意差を検定するために使用されました。結果の p値は、各パネルに示されます。平均フォールド枯渇スコアは、CEGの方が非CEGよりも有意に高いことに注意してください。これは、コア必須遺伝子が、定義上、ほとんどの細胞タイプで増殖および/または生存に一貫して必要であるため、予想されます。
図6Aは、3つのヒトMPNST細胞株の「ヒット」のベン図を示しています。通常、多数の遺伝子が複数の系統間で共有されていることがわかります。これらのヒットは、MPNSTの大きなサブセットの増殖およ...

私たちは、遺伝子改変マウスモデルで発生した腫瘍の治療標的と対応するヒト腫瘍の種類を同定および比較するために、ゲノム解析と機能的ゲノムスクリーニングを利用した種間比較腫瘍ゲノミクスアプローチを開発しました。

Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumors (MPNSTs) are derived from Schwann cells or their precursors. In patients with the tumor susceptibility syndrome ...

散発性およびNF1関連悪性末梢神経鞘腫瘍の病態解明に取り組んでいます。私たちの目標は、これらの非常に攻撃的な新生物に対する新しい治療法を論理的に開発することです。現在、研究を進めるために導入している技術には、ゲノムスケールのshRNAスクリーニングなどの偏りのない方法、シングルセルシーケンシング、BaseScope in situプローブ、バイオインフォマティクスなどがあります。現在、さまざまなアプローチを用いて、悪性末梢神経鞘腫瘍の増殖と生存に不可欠であり、治療標的となる複数の受容体を特定しました。これらの受容体には、ニューレグリン受容体、ErbB3、およびリゾホスファチジン酸受容体3が含まれる。このアプローチを使用する利点は、MPNST癌細胞株における15, 000以上の遺伝子の増殖性の重要性を調べる能力にあります。これは、MPNSTの治療における未開拓の標的を特定する偏りのないアプローチです。 今後、私たちの研究室の焦点は、私たちのスクリーンで特定された標的の検証に集中します。これには、細胞株や培養物に阻害剤を使用すること、そして最終的にはそれを動物実験に変換することが含まれます。

genetic-profiling-genome-scale-dropout-screening-to-identify

Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

私たちは、遺伝子改変マウスの神経系新生物がヒトの病理を正確に再現しているかどうかを評価するための方法論を開発しました。本研究では、これらの組織学的手法、定義された病理学的基準、および培養方法論を、P...

遺伝子改変マウスモデルにおける悪性末梢神経鞘腫瘍の同定、診断、および悪性度判定

このプロトコルは、 ショウジョウバエの眼/触角成虫（EAD）に蛍光マークされ、遺伝的に定義されたクローンの腫瘍を生成する方法を示します。なお、第3齢幼虫とどのように遺伝子発現の変化と腫瘍侵襲性を可視化し、定量化するためにそれらを処理するからEADと脳を分析する方法について説明します。...

ザ<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;成虫盤腫瘍モデル：遺伝的モザイクを用いた遺伝子発現と腫瘍侵襲性の可視化と定量化

前臨床試験からヒト試験に移行する新規薬物標的を特定することは、科学的な優先事項です。そのために、ここでは、遺伝子の枯渇ががん細胞株スフェロイドに与える影響を調べるための機能ゲノミクスアプローチについて説明します。これは、in...

癌細胞スフェロイド培養における潜在的に新規薬剤標的を同定するためのスクリーニング機能ゲノミクスを利用

ここで我々 はプロトコルを記述する腫瘍溶解性ウイルス治療を高めるために操作することができますホスト ターゲットを明らかにするハイスループット RNAi スクリーニングを採用するため特に rhabodvirus ワクシニア...

腫瘍溶解性ウイルス治療を調節するホストの要因を識別するために全ゲノム RNAi スクリーニング

がん転移臨床生体内で追跡のためのプロトコルについて述べる。それは、非侵襲的 [18F] テトラフルオロホウ酸-ペット、および合理化された前のヴィヴォ確認のため蛍光蛋白質によって検出されたナトリウム...

放射性核種蛍光レポーターの遺伝子齧歯動物腫瘍モデルで腫瘍の進行を追跡するイメージング

デジタルのポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) は、単一のヌクレオチドの亜種と DNA コピー数変異体の高感度検出のための便利なツールです。ここでは、管内チップ形式でデジタル PCR...

チップ チューブ形式を使用して散発的な家族性大腸腺腫症患者の遺伝的変異のデジタル ポリメラーゼ連鎖反応分析

神経内分泌腫瘍(NETs)は神経堤の神経内分泌細胞に由来する。彼らは成長が遅く、文化に挑戦しています。我々は、スフェロイドとしてそれらを培養することにより、小腸からNETを成長させるための代替戦略を提示します。これらのスフェロイドは、小さな腸ネットマーカーを有し、薬物検査に使用することができます。...

小腸神経内分泌腫瘍スフェロイドの確立と特徴付け

ここでは、遺伝子操作されたマウスモデル由来腫瘍において、インビボで胚致死性である遺伝子ノックアウトを行い、そのノックアウトが腫瘍の成長、増殖、生存、遊走、浸潤、およびトランスクリプトームに及ぼす影響をインビトロおよびインビボで評価するためのプロトコルを提示する。...

悪性末梢神経鞘腫瘍細胞におけるフロックス対立遺伝子の Ex vivo アブレーションによる腫瘍形成における遺伝子機能の定義

最近の研究では、高等度の小児神経膠腫(pHGG)細胞とそれらの相互相互作用に対する神経細胞の影響を明らかにする。本研究は、イン ビトロ...

グルタミン酸ニューロンと小児の高品位グリオーマ細胞の微小流体デバイスへの共培養による電気的相互作用の評価

この方法論文の目標は、外科的に切除された胸膜中皮腫からの原発性腫瘍細胞株の濃縮、生成、および拡大のための堅牢で再現可能な方法論を実証することである。...

原発性悪性胸膜中皮腫腫瘍ラインの生成と拡張

学ぶゲノム規模shRNAスクリーニングとバイオインフォマティクスを用いた悪性末梢神経鞘腫瘍の治療標的の同定。erbB3などの重要な受容体を発見し、新規治療開発に貢献します。

悪性末梢神経鞘腫瘍のマウスモデルにおける治療標的を特定するための遺伝子プロファイリングおよびゲノムスケールドロップアウトスクリーニング

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