Name: マウス骨格筋の未分画バルク培養によるニッチおよび幹細胞の静止を再現 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 11 s
Description: 学ぶマウス骨格筋の未分画バルク培養法。衛星細胞のニッチと静止状態を再現し、単細胞RNAシーケンスやFACSを用いて細胞集団を解析する。筋再生と恒常性の研究に応用できる。

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図 2 では、Servier Medical Art (https://smart.servier.com/) のテンプレートを使用しました。FRラボは、Association Française contre les Myopathies - AFM via TRANSLAMUSCLE(助成金19507および22946)、Fondation pour la Recherche Médicale - FRM(EQU202003010217、ENV202004011730、ECO201806006793)、Agence Nationale pour la Recherche - ANR(ANR-21-CE13-0006-02、ANR-19-CE13-0010、ANR-10-LABX-73)、およびLa Ligue Contre le Cancer(IP/SC-17130)の支援を受けています。上記の資金提供者は、この研究のデザイン、収集、分析、解釈、報告、またはこの原稿の執筆に何の役割も果たしていませんでした。

すべての実験は、Institut Mondor de Recherche Biomédicale(INSERM U955)のフランスおよびEUの動物規制、特に指令2010/63/UEに準拠しています。動物は、認証番号A94、028、379およびD94-028-028の動物施設で管理され、充実した環境で飼育されました。それらは許可された研究者と動物の世話人によってのみ取り扱われ、動物飼育施設の職員によって目視検査が行われ、生涯にわたって不快感の兆候がないか確認されました。彼らは解剖前に子宮頸部脱臼によって安楽死させられた。動物の生涯の間に介入処置は行われなかった。したがって、倫理委員会とフランス高等教育研究イノベーション省から手続きの承認を得る必要はありませんでした。実際、指令2010/63/UEによると、安楽死と死後解剖には倫理的クリアランスは必要ありません。本稿で発表した結果は、野生型C57BL/6NRj系統( 材料表参照)とトランスジェニック Tg:Pax7-nGFP 系統12(我々のチームで作製)によるものです。プロトコルは、8〜12週齢の雄および雌のマウスに適用されました。
1. 試薬および装置調製、前消化
<ol><li>解剖器具(直線および湾曲したハサミ、鉗子、 材料表を参照)に70%エタノールをスプレーし、紙で乾かします。コルク板にアルミホイルを塗り、10cmのシャーレ(1匹につき1枚)を近くに置いておく。紙と70%エタノールを手の届くところに用意してください。 注意: 解剖の最後に、解剖ツールを水ですすぎ、70%エタノールをスプレーし、紙で乾かします。</li>
	<li>回転式ウォーターバスを 37 °C に設定し、DMEM と 1% ペニシリン-ストレプトマイシン、0.5 U/mL コラゲナーゼ、3 U/mL ディスパーゼ( 材料表を参照)、0.2% BSA を 50 mL チューブに混ぜて消化ミックス(20 mL/動物)を調製します。</li>
	<li>消化ミックスを細胞培養フード内の0.22 μmフィルターに通します。 注意: 消化ミックスは毎回新鮮に準備することをお勧めします。</li>
</ol>2. 試薬と機器の準備:消化後
<ol><li><li> </li></ol><ol><li></li><li> </li><li> </li></ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65433/65433fig01.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65433/65433fig01large.jpg" target="_blank"></a><ol><li><li><li> </li></ol><ol><li><li></li><li><li> </li><li> </li></ol><ol><li><li> </li><li></li></ol><ol><li><li> </li><li> </li><li> </li></ol><ol><li> </li><li> </li></ol><ol><li><li></ol><ol><li> </li><li><li></li><li> </li></ol>

マウス骨格筋を採取して幹細胞とそのニッチを培養

<ol><li>Frontera, W. R., Ochala, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle%3A+A+brief+review+of+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Calcified+Tissue+International%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle: A brief review of structure and function.</a> Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).</li>
<li>Forcina, L., Cosentino, M., Musarò, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+regulating+muscle+regeneration%3A+Insights+into+the+interrelated+and+time-dependent+phases+of+tissue+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Mechanisms regulating muscle regeneration: Insights into the interrelated and time-dependent phases of tissue healing.</a> Cells. 9 (5), 1297(2020).</li>
<li>Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cell+of+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biophysical+and+Biochemical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Satellite cell of skeletal muscle fibers.</a> Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).</li>
<li>Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+absolute+requirement+for+Pax7-positive+satellite+cells+in+acute+injury-induced+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration.</a> Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).</li>
<li>McCarthy, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+fiber+hypertrophy+in+satellite+cell-depleted+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Effective fiber hypertrophy in satellite cell-depleted skeletal muscle.</a> Development. 138 (17), 3657-3666 (2011).</li>
<li>Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cells%2C+connective+tissue+fibroblasts+and+their+interactions+are+crucial+for+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration.</a> Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).</li>
<li>Sambasivan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pax7-expressing+satellite+cells+are+indispensable+for+adult+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration.</a> Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).</li>
<li>Hicks, M. R., Pyle, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emergence+of+the+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The emergence of the stem cell niche.</a> Trends in Cell Biology. 33 (22), 112-123 (2022).</li>
<li>Relaix, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+on+skeletal+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Perspectives on skeletal muscle stem cells.</a> Nature Communications. 12 (1), 692(2021).</li>
<li>Gama, J. F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+regulatory+T+cells+in+skeletal+muscle+regeneration%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Role of regulatory T cells in skeletal muscle regeneration: A systematic review.</a> Biomolecules. 12 (6), 817(2022).</li>
<li>Loreti, M., Sacco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+jam+session+between+muscle+stem+cells+and+the+extracellular+matrix+in+the+tissue+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">The jam session between muscle stem cells and the extracellular matrix in the tissue microenvironment.</a> NPJ Regenerative Medicine. 7 (1), 16(2022).</li>
<li>Sambasivan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+regulatory+cascades+govern+extraocular+and+pharyngeal+arch+muscle+progenitor+cell+fates%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct regulatory cascades govern extraocular and pharyngeal arch muscle progenitor cell fates.</a> Developmental Cell. 16 (6), 810-821 (2009).</li>
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<li>Scholzen, T., Gerdes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ki-67+protein%3A+From+the+known+and+the+unknown%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">The Ki-67 protein: From the known and the unknown.</a> Journal of Cellular Physiology. 182 (3), 311-322 (2000).</li>
<li>Abou-Khalil, R., Le Grand, F., Chazaud, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+and+murine+skeletal+muscle+reserve+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Niche%22%5BJournal%5D)">Human and murine skeletal muscle reserve cells.</a> Stem Cell Niche. 1035, 165-177 (2013).</li>
<li>Pasut, A., Oleynik, P., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+muscle+stem+cells+by+fluorescence+activated+cell+sorting+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation of muscle stem cells by fluorescence activated cell sorting cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 798, 53-64 (2011).</li>
<li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li>
<li>Montarras, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+isolation+of+satellite+cells+for+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration.</a> Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).</li>
<li>Qu, Y., Edwards, K., Barrow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+use+of+primary+murine+myoblasts+in+small-molecule+screens%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and use of primary murine myoblasts in small-molecule screens.</a> STAR Protocols. 4 (2), 102149(2023).</li>
<li>Danoviz, M. E., Yablonka-Reuveni, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+satellite+cells%3A+Background+and+methods+for+isolation+and+analysis+in+a+primary+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle satellite cells: Background and methods for isolation and analysis in a primary culture system.</a> Methods in Molecular Biology. 798, 21-52 (2011).</li>
<li>Saclier, M., Theret, M., Mounier, R., Chazaud, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+macrophage+conditioned-medium+on+murine+and+human+muscle+cells%3A+analysis+of+proliferation%2C+differentiation%2C+and+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Effects of macrophage conditioned-medium on murine and human muscle cells: analysis of proliferation, differentiation, and fusion.</a> Methods in Molecular Biology. 1556, 317-327 (2017).</li>
<li>Giordani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-dimensional+single-cell+cartography+reveals+novel+skeletal+muscle-resident+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">High-dimensional single-cell cartography reveals novel skeletal muscle-resident cell populations.</a> Molecular Cell. 74 (3), 609-621 (2019).</li>
<li>Tabula Muris Consortium et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomics+of+20+mouse+organs+creates+a+Tabula+Muris%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris.</a> Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).</li>
<li>Brunetti, J., Koenig, S., Monnier, A., Frieden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanopattern+surface+improves+cultured+human+myotube+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">Nanopattern surface improves cultured human myotube maturation.</a> Skeletal Muscle. 11 (1), 12(2021).</li>
<li>Denes, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+C2C12+myotubes+on+micromolded+gelatin+hydrogels+accelerates+myotube+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">Culturing C2C12 myotubes on micromolded gelatin hydrogels accelerates myotube maturation.</a> Skeletal Muscle. 9 (1), 17(2019).</li>
<li>LaFramboise, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+muscle+origin+and+phenotype+on+satellite+cell+muscle-specific+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Effect of muscle origin and phenotype on satellite cell muscle-specific gene expression.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 35 (10), 1307-1318 (2003).</li>
<li>Azhar, M., Wardhani, B. W. K., Renesteen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regenerative+potential+of+Pax3%2FPax7+on+skeletal+muscle+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Generic+Engineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The regenerative potential of Pax3/Pax7 on skeletal muscle injury.</a> Journal of Generic Engineering and Biotechnology. 20 (1), 143(2022).</li>
<li>Hardy, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+injury+models+for+studying+muscle+regeneration+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparative study of injury models for studying muscle regeneration in mice.</a> PLoS One. 11 (1), e0147198(2016).</li>
</ol>

著者は利益相反がないことを宣言します。

成人の骨格筋の機能は、精巧に調整された一連の細胞間相互作用と分子シグナルによって支えられています。ここでは、生理学的微小環境によく似た ex vivo 環境でこれらのパラメータの研究を可能にする方法を提示する。
いくつかのグループは、筋原性細胞を培養するためのin vitro法を報告しています。これらの方法は、サテライト細胞を単離して、その筋原性前駆細胞特性を研究することを目的としていました。ポジティブセレクションにはPax7、CD34、a7-インテグリン、ネガティブセレクションにはCD45、CD31、Sca1の抗体パネルを使用して、ヒラメ筋および/またはEDL筋18、またはFACS単離サテライト細胞からバルク筋から純粋なサテライト細胞を単離するために、2つの主要なアプローチが使用されます19,20,21.また、F...

運動、呼吸、代謝、姿勢、体温の維持はすべて骨格筋に依存しており、骨格筋の機能不全は衰弱性の病状(ミオパチー、筋ジストロフィーなど)を引き起こす可能性があります。1.骨格筋は、その本質的な機能と豊富さから、正常な筋肉機能をサポートし、治療標的として役立つ重要な側面を理解しようと努力する世界中の研究機関の注目を集めています。さらに、骨格筋は、主にその常在幹細胞2により、健康な筋肉が完全な損傷や変性の後に完全に自己修復できるため、再生と幹細胞機能を研究するために広く使用されているモデルです。これらはサテライト細胞とも呼ばれ、筋線維3の周辺の基底層の下に局在している。
成人の骨格筋の中核となる細胞は、筋線維(長い合胞体多核細胞)とサテライト細胞(筋原性を有する幹細胞で、損傷によって活性化されるまで静止している)です。後者の細胞は筋肉再生の中心細胞であり、このプロセスはそれらがない場合には起こり得ません4,5,6,7。その身近な微小環境には、複数の細胞タイプとそれらにシグナルを送る分子因子があります。このニッチは、発達を通じて成人期8まで徐々に確立されます。成体筋には、複数の細胞タイプ(内皮細胞、周皮細胞、マクロファージ、線維脂肪形成前駆細胞-FAP、制御性T細胞など)が含まれています。9,10および細胞外マトリックス成分(ラミニン、コラーゲン、フィブロネクチン、フィブリリン、ペリオスチンなど)11は、健康、病気、および再生の文脈で互いに、および衛星細胞と相互作用します。
この複雑なニッチを実験環境で維持することは、基本的ではあるが困難である。同様に難しいのは、サテライトセル9にとって重要なセル状態である静止状態を維持または回復させることである。これらの課題に部分的に取り組むためにいくつかの方法が導入されており、それぞれに長所と短所があります(説明のセクションで詳しく説明します)。ここでは、これら2つの障壁を部分的に克服できる方法を紹介します。筋肉は最初に採取され、次に機械的および酵素的に分解されてから、不均一な細胞混合物が培養されます。培養の過程で、ニッチの多くの細胞タイプが検出され、静止状態に戻ったサテライト細胞が観察されます。プロトコルの最後のステップとして、広く受け入れられているマーカーを使用して各細胞タイプの検出を可能にする免疫蛍光法のステップが提示されます。

<table><tbody><tr><td>抗CD31</td><td>BD</td><td>550274</td><td>希釈 1:100</td></tr><tr><td>抗 FOSB</td><td>サンタクルーズ</td><td>sc-7203</td><td>希釈 1:200</td></tr><tr><td>反 GFP</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td>希釈 1:1000</td></tr><tr><td>反 Ki67</td><td>Abcam</td><td>ab16667</td><td>希釈 1:1000</td></tr><tr><td>反 MyHC</td><td>DSHB</td><td>MF20-c</td><td>希釈 1:400</td></tr><tr><td>抗MYOD</td><td>アクティブ モチーフ</td><td>39991</td>希釈<td>1:200</td></tr><tr><td>anti-MYOG</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-576</td>希釈<td>1:150</td></tr><tr><td>anti-Pax7</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-81648</td>希釈<td>1:100</td></tr><tr><td>anti-PDGFR&alpha;</td><td>Invitrogen</td><td>PA5-16571</td><td>希釈 1:50</td></tr><tr><td>b-FGF</td><td>Peprotech</td><td>450-33</td><td>濃度 4 ng/mL</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA) &ndash; 消化に使用&nbsp;</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>A7906-1006</td><td>濃度 0.2%</td></tr><tr><td>BSA IgGフリー、プロテアーゼフリー &ndash; 染色に使用</td><td>ジャクソン免疫研究</td><td>001-000-162</td><td>濃度 5%</td></tr><tr><td>セルストレーナー 40 um</td><td>Dominique Dutscher</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>セルストレーナー 70 um</td><td>Dominique Dutscher</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>セルストレーナー 100 um</td><td>Dominique Dutscher</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ</td><td>ロシュ</td><td>10103586001</td><td>濃度 0.5 U/mL</td></tr><tr><td>培養プレート</td><td>Sarstedt</td><td>94.6140.802</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド (DMSO)</td><td>Euromedex</td><td>UD8050-05-A</td><td></td></tr><tr><td>ディスパーゼ</td><td>ロシュ</td><td>4942078001</td><td>濃度 3 U/mL</td></tr><tr><td>解剖鉗子 サイズ 5</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>解剖鉗子サイズ55</td>ファイン<td>サイエンスツール</td><td>11295-51</td><td></td></tr>解<tr><td>剖はさみ(大、ストレート)</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>9146-11</td><td></td></tr>解<tr><td>剖はさみ(小、湾曲)</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>15017-10</td><td></td></tr>解<tr><td>剖はさみ(小、ストレート)</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコの修正Eagle's Medium (DMEM)</td><td>ThermoFisher</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>EdU Click-iT kit</td><td>ThermoFisher</td><td>C10340</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 &ndash; オプション 1</td><td>Eurobio</td><td>CVF00-01</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 &ndash; オプション 2</td><td>Gibco</td><td>10270-106&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>マトリゲル</td><td>コーニング ライフサイエンス</td><td>354234コーティング</td><td>ソリューション</td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td>ドミニク・ダッチャー</td><td>090261</td><td>フレキシブルフィルム</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド &ndash; オプション 1</td><td>PanReac AppliChem ITW 試薬</td><td>211511.1209</td><td>濃度 4%</td></tr><tr><td>パラホルマルデイド &ndash; オプション 2</td><td>ThermoFisher</td><td>28908</td><td>濃度 4%</td></tr><tr><td>ペニシリン連鎖球</td>菌 <td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>振とう湯浴</td><td>サーモフィッシャー</td><td>TSSWB27</td><td></td></tr><tr><td>TritonX100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8532-500 ML</td><td>濃度 0.5%</td></tr> <tr><td>野生型マウス</td><td>Janvier</td><td>C57BL/6NRj</td><td></td></tr></tbody></table>

マウス骨格筋の未分画バルク培養によるニッチおよび幹細胞の静止を再現

Unfractionated Bulk Culture of Mouse Skeletal Muscle to Recapitulate Niche and Stem Cell Quiescence

骨格筋は体の中で最大の組織であり、運動から体温調節まで、複数の機能を果たします。その機能と損傷からの回復は、多数の細胞タイプと、コア筋細胞(筋繊維、筋幹細胞)とそのニッチの間の分子シグナルに依存しています。ほとんどの実験環境では、この複雑な生理学的微小環境は維持されず、筋幹細胞にとって重要な細胞状態である休止状態のex vivo 研究も許可されていません。ここでは、ニッチの細胞成分を持つ筋幹細胞の ex vivo 培養のためのプロトコルが概説されています。筋肉の機械的および酵素的分解を通じて、細胞タイプの混合物が得られ、それは2D培養に入れられます。免疫染色は、1週間以内に、筋線維、そして重要なことに、静止筋幹細胞の特徴を示すPax7陽性細胞とともに、複数のニッチ細胞が培養中に存在することを示しています。これらの独特な特性はこのプロトコルに基本的で、translational質問に演説するのに使用することができる静止そっくりの幹細胞の細胞拡大そして生成のための強力な用具をする。

このプロトコルは内生ニッチから衛星細胞そしてほとんどのセルを維持している間筋肉細胞培養を可能にする。図 2 はプロトコルの主なステップをまとめたもので、図 1 は解剖と消化の重要な部分を示しています。後肢の筋肉組織の解剖が推奨されます(図1A-C)、この筋肉群はよく研究されており、発達の起源と分子階層を共有しているためです14。すべての混合物を無菌条件下で調製することをお勧めします。さらに、消化ミックスを細胞培養フードの下の 0.22 μm フィルターに通すと、培養コンタミネーションの低下が認められました。
バルク調製物の1/30をコーティングされた1cm2 ウェルプレートに播種すると、培養開始から3〜4日後に細長い細胞が見えます。ただし、これは細胞濃度によって異なる場...

骨格筋は、常在幹細胞を含む複数の細胞タイプで構成されており、それぞれが筋肉の恒常性と再生に特別な貢献をしています。ここでは、生理学的、in vivo、および環境的特性の多くを保持するex vivo環境での筋幹細胞および筋細胞ニッチの2D培養について説明します。

Skeletal muscle is the largest tissue of the body and performs multiple functions, from locomotion to body temperature control. Its functionality and ...

私たちの研究は、健康な骨格筋と病気の骨格筋の研究を含み、特にサテライト細胞に重点を置いています。私たちが研究している基本的な側面の1つは、細胞特異的な遺伝子発現を調整する転写エンハンサーの同定です。このプロトコルにより、特異性を判断するための迅速なテストを実施できます。骨格筋研究の分野では、ホメオスタシス、再生、および疾患におけるさまざまな細胞集団を研究するために、単一細胞および単一核のRNAシーケンシングアプローチが頻繁に使用されます。また、サテライト細胞は、蛍光活性化セルソーティング(FACS)によって単離し、仮説検証やシーケンシング結果の検証のために培養することができます。サテライト細胞をin vitroで研究することは、大きな課題です。最近の研究では、サテライト細胞の生理機能におけるニッチの役割が強調されています。FACS単離サテライト細胞の培養は一般的ですが、サテライト細胞のニッチなin vitroでの複製はまだ達成されていません。私たちのプロトコルは、内皮細胞や線維edoprogenetic前駆細胞などの非筋原性細胞を含む全筋肉組織を、培養する効率的で実用的な方法を提供します。培養後1週間以内に静止したような細胞が現れることを示しました。このプロトコルは、他の細胞がこの静止状態のようにプールを再確立することに対する影響を研究するためにも使用できます。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

ミクロ解剖植技術は、骨格筋幹細胞のソースとして、若年成人や胚の筋肉から増殖性骨格筋細胞を単離するための堅牢で信頼性の高い方法です。一意に、これらの細胞は、クローン的に生体移植のために使用される骨格筋幹細胞株を生成するために導出されている。...

大人と胚骨格筋のMicroexplantの文化と骨格筋幹細胞の単離

筋線維の単離および培養は、ゴールドスタンダードである...

成人骨格筋からの個々の筋線維とその衛星細胞の単離および培養

静止衛星細胞の純粋な集団の単離および培養、筋肉幹細胞集団は、筋肉幹細胞生物学および再生、ならびに筋ジストロフィーおよび他の変性疾患における治療のための幹細胞移植の理解に不可欠である。...

筋衛星細胞の単離、培養、および移植

ヒトの筋肉に由来する主な接着細胞タイプは、筋原性細胞と線維芽細胞です。ここでは、CD56抗原に基づく磁気活性化細胞ソーティングを用いて細胞集団を濃縮します。その後、特異的抗体による免疫標識と画像解析技術の使用により、個々の細胞の細胞質および核特性を定量化できます。...

ヒト骨格筋からの一次筋原細胞および線維芽細胞の単離および定量的免疫組織化学的特性評価

ミオブラストは、多核化ミオチューブと最終的に骨格筋筋筋筋繊維を形成するために分化する前駆細胞を増殖させる。ここでは、若年成人マウス骨格筋からの原発筋芽生の効率的な単離および培養のためのプロトコルを提示する。この方法は、培養中の筋肉細胞の分子的、遺伝的、代謝的研究を可能にする。...

マウス骨格筋移植からの原発性筋芽生の単離と分化

ここでは、出生後初期の発達段階で単一の筋線維を効率的に得る方法を、エメリー・ドレイフス型筋ジストロフィー(EDMD)の非常に重篤なモデルであるホモジューザイゴウス変異体ラミンΔ8-11マウスモデルから提案する。...

出生後初期の発達におけるエメリー・ドレイフス型筋ジストロフィーのマウスモデルからの単一の筋繊維の分離と培養

このプロトコルでは、筋肉幹細胞のインビトロ培養および機能解析方法が記載されており、内因性ニッチとの相互作用のほとんどを維持する。...

成人筋幹細胞機能評価のための単一筋繊維培養アッセイ Ex Vivo

線維脂肪原性前駆細胞(FAP)および筋幹細胞(MuSC)の正確な同定は、生理学的および病理学的状態におけるそれらの生物学的機能を研究するために重要です。このプロトコルは、成体マウスの筋肉からのFAPおよびMuSCの分離、精製、および培養のためのガイドラインを提供します。...

FACSによる無動および損傷マウス骨格筋からの線維脂肪原性前駆細胞および筋幹細胞の単離および培養

このプロトコルは、マウスの個々の骨格筋からの筋幹細胞および線維脂肪原性前駆細胞の単離について説明しています。このプロトコルには、単一筋解剖、蛍光活性化細胞選別による幹細胞の単離、免疫蛍光染色による純度評価、および5-エチニル-2'-デオキシウリジン取り込みアッセイによるS期侵入の定量的測定が含まれます。...

個々の骨格筋からの静止幹細胞集団の分離

本プロトコルは、マウス由来の非常に均質な骨髄間葉系幹細胞(BMSC)を精製、増殖、および特徴付けるための費用対効果の高い方法を説明しています。このアプローチにより、高い増殖と分化の可能性のある大量のBMSCの取得が容易になり、マウスモデルをサポートし、前臨床研究を前進させることができます。...

マウス由来骨髄間葉系幹細胞の精製、増殖、およびフローサイトメトリーに基づく表現型解析

このプロトコルは、組織解離、逐次ろ過、プレプレート処理、定義された培養条件を通じて、成体および新生マウスの骨格筋から一次筋芽細胞を単離・濃集する標準化された方法を提供し、衛星細胞由来の筋肉芽細胞培養の確立と維持を可能にし、下流の実験応用を可能にします。...

In vitro 筋形成研究のための骨格筋サテライト細胞の単離

学ぶマウス骨格筋の未分画バルク培養法。衛星細胞のニッチと静止状態を再現し、単細胞RNAシーケンスやFACSを用いて細胞集団を解析する。筋再生と恒常性の研究に応用できる。

マウス骨格筋の未分画バルク培養によるニッチおよび幹細胞の静止を再現

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