Name: ミトコンドリア接触部位を単離するための改良された方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-16T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: 学ぶミトコンドリア接触部位の単離法とCQD1による新規接触部位の形成機構。酵母を用いた実験で、脂質輸入とミトコンドリア膜構造の理解に貢献する知見を得る方法です。

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M.E.H.は、Deutsche Forschungsgemeinschaft(DFG)プロジェクト番号413985647の資金援助に感謝します。著者らは、ミュンヘンのルートヴィヒ・マクシミリアン大学のミヒャエル・キーブラー博士の寛大で広範な支援に感謝します。ウォルター・ノイペルト氏の科学的なインプット、有益な議論、そして継続的なインスピレーションに感謝します。J.F.は、ミュンヘン生命科学大学院(LSM)の支援に感謝します。

1. バッファーとストック溶液
<ol><li>1 M 3-モルホリノプロパン-1-スルホン酸(MOPS)溶液を脱イオン水(pH 7.4)で調製します。4°Cで保存してください。</li>
	<li>500 mM エチレンジアミン四酢酸(EDTA)を脱イオン水、pH 8.0 で調製します。室温で保存してください。</li>
	<li>脱イオン水に2.4 Mソルビトールを調製します。オートクレーブ後、室温で保存してください。</li>
	<li>脱イオン水で2.5Mスクロースを調製します。オートクレーブ後、室温で保存してください。</li>
	<li>イソプロパノール中に 200 mM フェニルメチルスルホニルフッ化物(PMSF)を調製します。-20°Cで保存してください。 注意: PMSFは飲み込むと有毒であり、重度の皮膚火傷や眼の損傷を引き起こします。ほこりを吸い込まず、保護手袋とゴーグルを着用してください。</li>
	<li>脱イオン水で72%トリクロロ酢酸(TCA)を調製します。4°Cで保存してください。 注意: TCAは、呼吸器への刺激、重度の皮膚の火傷、および目の損傷を引き起こす可能性があります。ほこりを吸い込まず、保護手袋とゴーグルを着用してください。</li>
	<li>SMバッファー(20 mM MOPSおよび0.6 Mソルビトール、pH 7.4)を調製します。</li>
	<li>膨潤バッファー(20 mM MOPS、0.5 mM EDTA、1 mM PMSF、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル(pH 7.4))を調製します。</li>
	<li>スクロースグラジエントバッファー(0.8 M、0.96 M、1.02 M、1.13 M、1.3 M スクロース)を 20 mM MOPS で調製し、0.5 mM EDTA、pH 7.4 で溶液を調製します。 注:すべてのバッファーは4°Cで保存できます。ただし、真菌の増殖を防ぐために、スクロース含有バッファーを-20°Cで保存することを推奨します。プロテアーゼ阻害剤は、使用前に新たに添加する必要があります。</li>
</ol>2. 服従軟骨小胞の生成
<ol><li>粗酵母ミトコンドリアを確立されたプロトコルに従って新たに分離します34,35。 注:この実験では、ミトコンドリアを 出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)から単離しました。他の細胞小器官を欠いた勾配の純粋なミトコンドリアの生成は必要ありません。</li>
	<li>単離したばかりのミトコンドリア10 mgを1.6 mLのSMバッファー(4°C)にピペッティングで再懸濁します(図2、ステップ1)。</li>
	<li>ミトコンドリア懸濁液を予冷した100 mL三角フラスコに移します。</li>
	<li>20 mLのガラスピペットを使用して、16 mLの膨潤緩衝液をゆっくりと加えます。添加中は、氷上で絶えず穏やかに攪拌します。この浸透圧処理により、マトリックス空間に水分が取り込まれます。ミトコンドリアの内膜の腫れは外膜を破壊します。ただし、両方の膜は接触部位9で接触したままになります(図2、ステップ2)。</li>
	<li>氷上で30分間、一定の穏やかな攪拌下でサンプルをインキュベートします。</li>
	<li>5 mLのガラスピペットを使用して、5 mLの2.5 Mショ糖溶液をゆっくりと加え、サンプル中のスクロース濃度を約0.55 Mに上げます。この浸透圧処理は、マトリックス36からの水の流出をもたらす。内膜の収縮は、外膜の残留断片までの距離を最大化することを目的としています。これにより、超音波処理によって内膜と外膜の人工ハイブリッド小胞が生成される可能性が低下します(図2、ステップ3)。</li>
	<li>氷上で15分間穏やかに撹拌しながらサンプルをインキュベートします。</li>
	<li>ミトコンドリアを超音波処理して、提出軟骨膜小胞を生成します(図2、ステップ4)。<ol><li>ミトコンドリア懸濁液を予冷したロゼットセルに移します。</li>
		<li>ミトコンドリア懸濁液を10%の振幅で30秒間超音波処理し、ロゼットセルを氷浴で冷却します。</li>
		<li>懸濁液を氷浴で30秒間休ませます。.</li>
		<li>手順2.8.2と手順2.8.3をさらに3回繰り返します。 注:超音波処理条件は、使用する超音波処理装置によって異なります。個々のマシンに対して最適化が必要になります。過酷すぎる超音波処理は、ミトコンドリアの内膜と外膜からなる小胞の人工的な形成につながります。</li>
	</ol></li>
</ol>3. 服従軟骨小胞の分離
<ol><li>生成された小胞を、20,000 x g で4°Cで20分間遠心分離することにより、残りの無傷のミトコンドリアから分離します。 無傷のミトコンドリアはペレット化し、小胞は上清にとどまります。</li>
	<li>小胞混合物を濃縮します。<ol><li>上清を新しい超遠心分離チューブに移します。</li>
		<li>0.8 mm x 120 mmのカニューレを装備した1 mLのシリンジを使用して、チューブの底部に0.3 mLの2.5 Mショ糖溶液のクッションをロードします。</li>
		<li>118,000 x g で4°Cで100分間遠心分離します。 注:ここでは、最大半径153.1mmのスイングバケットローターを使用しました。遠心分離条件はローターに大きく依存し、別のローターを使用する場合は適合させる必要があります。</li>
	</ol></li>
	<li>小胞は、遠心分離後、スクロースクッションの上部にディスクとして現れます。上澄み液の約90%を捨てる。次に、ピペッティングで上下に動かし、2.5 Mスクロースを含む残りのバッファーに再懸濁することにより、濃縮小胞を回収します。懸濁液を氷冷したDounceホモジナイザーに移します。</li>
	<li>ポリテトラフルオロエチレンポッターを使用して、少なくとも10回のストロークで懸濁液を均質化します。</li>
	<li>スクロースグラジエントを準備します。<ol><li>5 ステップ(20 mM MOPS および 0.5 mM EDTA、pH 7.4 中の 1.3 M、1.13 M、1.02 M、0.96 M、0.8 M スクロース)を含む 11 mL のステップグラジエントの場合、各層には 2.2 mL のスクロース溶液があります。 注意: スクロース濃度を測定および調整するには、屈折計をお勧めします。ただし、必須ではありません。10 μLの緩衝液を屈折計に塗布し、それぞれの屈折率を検出します。ショ糖濃度の計算は次のとおりです。 <img alt="モル濃度のショ糖濃度方程式;屈折率測定解析の図。" src="/files/ftp_upload/65444/65444eq01v2.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1"> 1.3333は水の屈折率を表します。0.048403は、水溶液中のモル屈折率からスクロース濃度への線形スケーリングから得られるスクロース特異的変換指数 である37。</li>
		<li>遠心分離チューブに最高濃度のショ糖を加え、チューブを-20°Cに保ちます。 レイヤーが完全にフリーズするまで待ってから、次のレイヤーを適用します。最後の層が追加されるまで適宜進み、グラジエントを-20°Cで保存します。 注:実験を開始するときは、グラジエントを融解するために、凍結グラジエントを 4 °C に移すことを忘れないでください。これには約3時間かかります。ここでの遠心分離には、容量13.2 mLのスイングバケットローターを使用しました。別のローターを使用する場合は、グラジエントステップボリュームをそれに応じて調整する必要があります。</li>
	</ol></li>
	<li>屈折計を使用してサンプルのスクロース濃度を測定します。屈折計にアクセスできない場合は、スクロース濃度が2 Mであると仮定することもできます。この想定されるスクロース濃度は、次のステップの基礎となります。</li>
	<li>適切な量の 20 mM MOPS、0.5 mM EDTA、1 mM PMSF、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル(pH 7.4)を添加して、スクロース濃度を 0.6 M に調整します。スクロース濃度が測定されずに2 Mと推定される場合は、調整後に濃度が十分に低いかどうかをテストすることをお勧めします。試験管内の200 μLの0.8 Mスクロースの上に、サンプルの少量のアリコート(約50 μL)を塗布します。サンプルは 0.8 M スクロースの上に留まる必要があります。</li>
	<li>サンプル(約 1 mL)をスクロースグラジエントの上にロードします(後で参照できるように 10% を保持します)。グラジエントの乱れを避けるためには、慎重なピペッティングが重要です(図2、ステップ5)。</li>
	<li>200,000 x g 、4°Cで12時間遠心分離して小胞を分離します。可能であれば、遠心分離機をゆっくりと加速および減速に設定して、グラジエントの乱れを回避します(図2、ステップ6)。 注:ここでは、最大半径153.1mmのスイングバケットローターを使用しました。遠心分離条件はローターに大きく依存し、別のローターを使用する場合は適合させる必要があります。</li>
	<li>1 mLのピペットを使用して、上から下へのグラジエントを700 μLのフラクションで回収します。これにより、17 のフラクションが得られ、十分な分離能が得られます。</li>
</ol>4. 服従軟骨小胞の解析
<ol><li>各画分を2回連続して実施されたTCA沈殿38に供することにより、タンパク質を濃縮し、SDS-PAGEサンプルを調製する。<ol><li>200 μL の 72% TCA を個々のフラクションに加え、溶液が均一になるまで混合します。フラクションを氷上で30分間インキュベートし、沈殿したタンパク質を20,000 x g および4°Cで20分間遠心分離してペレット化します。上清を廃棄し、500 μLの28%TCA溶液を加え、よく混合し、遠心分離ステップを繰り返します。</li>
		<li>ペレットを1 mLのアセトン(-20°C)で洗浄し、20,000 x g 、4°Cで10分間遠心分離します。 上澄みを捨て、ペレットを自然乾燥させます。ペレットを60 μLのSDSサンプルバッファーに再懸濁し、サンプルを95°Cで5分間インキュベートします。 注:最初のTCA沈殿後、特に高密度画分に大量のスクロースが残ります。これは、追加のTCA降水によって除去されます。</li>
	</ol></li>
	<li>各画分20 μLをSDS-PAGE39およびイムノブロッティング40、41、42、43で分析します。</li>
</ol>

ミトコンドリア接触部位の分離

著者らは、利益相反がないことを宣言します。

ミトコンドリアの分画は、いくつかの非常に複雑なステップからなる複雑な実験です。したがって、確立された方法32をさらに改善し、ある程度簡素化することを目指しました。ここでの課題は、複雑で高度に専門化された機器が必要であり、多くの場合、個別の構造であり、膨大な時間とエネルギーを消費することでした。そのために、線状勾配の鋳造と収穫に用いたポンプや個々の構造物を撤去し、段階勾配に変更しました。重要なことは、少なくともここで説明したように調製した場合、遠心分離中にグラジエントが線形になり、これが有効な代替品になることに気づいたことです。この方法では、(i)グラジエントミキサーが不要になり、必要な機器が削減されます。(ii)グラジエントを事前に準備できるため、実験当日の時間を節約できます。(iii)は、記載されている方法に従って調製した場合に再現性が高く(図3)、次のステップを上に重ねる前に個々のステップを凍結します。これらの勾配は、−20°Cで無期限に保存することもできます。 さらに、ここで提案された沈降勾配の負荷は、同様の方法<sup c...

ミトコンドリアは真核生物においてさまざまな機能を果たしており、最もよく知られているのは酸化的リン酸化によるATPの産生です。その他の機能には、鉄-硫黄クラスターの生成、脂質合成、および高等真核生物ではCa2+シグナル伝達、およびアポトーシスの誘導が含まれます1,2,3,4。これらの機能は、その複雑な超微細構造と不可分に結びついています。
ミトコンドリアの超微細構造は、電子顕微鏡5によって最初に記述された。ミトコンドリアは、ミトコンドリア外膜とミトコンドリア内膜の2つの膜からなるかなり複雑な細胞小器官であることが示されました。したがって、2つの水性区画がこれらの膜によって形成される:膜間空間およびマトリックス。ミトコンドリアの内膜は、さらに異なるセクションに分けることができます。内側の境界膜は外側の膜に近接しており、クリステは陥入を形成します。いわゆるクリスタ接合部は、内側の境界膜とクリステをつなぎます(図1)。さらに、浸透圧的に縮小したミトコンドリアの電子顕微鏡写真は、ミトコンドリア膜が緊密に結合している部位が存在することを明らかにした6,7。これらのいわゆるコンタクトサイトは、2つの膜にまたがるタンパク質複合体によって形成されます(図1)。これらの相互作用部位は、ミトコンドリアの動態と遺伝の調節、ならびに細胞質とマトリックスの間の代謝産物とシグナルの伝達にとって重要であるため、細胞の生存に不可欠であると考えられている8。
ミトコンドリア内膜のMICOS複合体は、おそらく最もよく特徴付けられ、最も用途の広いコンタクトサイト形成複合体です。MICOSは2011年に酵母で記載され、Mic60、Mic27、Mic26、Mic19、Mic12、Mic10の6つのサブユニット9,10,1で構成されています。これらは約1.5MDaの複合体を形成し、クリスタ接合部9,10,11に局在する。Mic10またはMic60のいずれかのコアサブユニットが欠失すると、この複合体が欠損する9,11ため、これら2つのサブユニットがMICOSの安定性に不可欠である。興味深いことに、MICOSは、TOM複合体11,12、TOB/SAM複合体9,12,13,14,15,16、Fzo1-Ugo1複合体9、Por1 10、OM45 10、Miro 17など、様々なミトコンドリア外膜タンパク質および複合体と1つだけでなく複数の接触部位を形成します.このことは、MICOS複合体が、タンパク質の取り込み、リン脂質代謝、ミトコンドリアの超微細構造の生成など、様々なミトコンドリアプロセスに関与していることを強く示唆している18。後者の機能は、MIC10またはMIC60の欠失によって誘導されるMICOS複合体の欠如が、事実上完全に規則的なクリステを欠く異常なミトコンドリアの超微細構造をもたらすため、おそらくMICOSの主要な機能である。その代わりに、内界膜と接続していない内膜小胞が蓄積する19、20。重要なことに、MICOSは酵母からヒトまで形態と機能が保存されています21。MICOSサブユニットの変異と重篤なヒト疾患との関連は、高等真核生物にとっての重要性も強調している22,23。MICOSは非常に用途が広いですが、追加の接触サイトが存在する必要があります(未発表の観察に基づく)。実際、ミトコンドリア特異的リン脂質カルジオリピンの生合成に関与するミトコンドリア融合機構Mgm1-Ugo1/Fzo124,25,26またはMdm31-Por1など、他のいくつかの接触部位が同定されている27。最近、我々はMICOSの同定に至った手法を改良し、外膜複合体Por1-Om14と形成される新規接触部位の一部としてCqd1を同定した28。興味深いことに、この接触部位は、ミトコンドリア膜の恒常性、リン脂質代謝、コエンザイムQ28,29の分布などの複数のプロセスにも関与しているようです。
ここでは、先に述べたミトコンドリア9,30,31,32,33の分画の変形を用いた。ミトコンドリアの浸透圧処理は、ミトコンドリア外膜の破壊とマトリックス空間の収縮をもたらし、2つの膜は接触部位でのみ近接した状態になります。これにより、ミトコンドリア外膜またはミトコンドリア内膜のみからなる、または軽度の超音波処理による両方の膜の接触部位を含む小胞の生成が可能になります。ミトコンドリア内膜はタンパク質と脂質の比率がはるかに高いため、ミトコンドリア内膜小胞はミトコンドリア外膜小胞と比較してより高い密度を示します。密度の差を利用して、スクロース浮力密度勾配遠心分離により膜小胞を分離することができます。したがって、ミトコンドリア外膜小胞は低スクロース濃度で蓄積し、ミトコンドリア内膜小胞は高スクロース濃度で濃縮されます。接触部位を含む小胞は、中程度のスクロース濃度で濃縮されます(図2)。以下のプロトコルは、以前に確立されたもの32と比較して、より少ない専門機器、時間、およびエネルギーを必要とするこの改良された方法を詳細に説明し、可能な接触部位タンパク質の同定のための有用なツールを提供します。

<table><tbody><tr><td>13.2 mL, オープントップ薄壁ウルトラクリアチューブ, 14 x 89mm</td><td>Beckman Instruments, ドイツ</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>50 mL, オープントップ厚壁ポリカーボネートオープントップチューブ, 29 x 104mm</td><td>Beckman Instruments, ドイツ</td><td>363647</td><td></td></tr><tr><td>A-25.50 固定角ローター - アルミニウム, 8 x 50 mL, 25,000 rpm, 75,600 x g</td><td>Beckman Instruments, ドイツ</td><td>363055</td><td></td></tr><tr><td>Abbe 屈折計</td><td>Zeiss,ドイツ</td><td></td><td>販売終了, 任意のアッベ屈折計が使用可能</td></tr><tr><td>accu-jet pro ピペットコントローラー</td><td>Brandtech, 米国</td><td>BR26320</td><td>販売終了, どのピペットコントローラーでも十分</td></tr><tr><td>ビーカー 1000mL</td><td>DWK ライフサイエンス, ドイツ</td><td>C118.1</td><td></td></tr><tr><td>ブランソン&nbsp;デジタル超音波器 W-250 D</td><td>Branson Ultrasonics, USA</td><td>FIS15-338-125</td><td></td></tr><tr><td>Branson Ultrasonic 3mm TAPERED MICROTIP</td><td>Branson Ultrasonics, USA</td><td>101-148-062</td><td></td></tr><tr><td>Branson Ultrasonics 200-and 400-Watt Sonifiers: Rosette Cooling Cell</td><td>Branson Ultrasonics, USA</td><td>15-338-70</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge Avanti JXN-26</td><td>Beckman Instruments, Germany</td><td>B37912</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge Optima XPN-100 ultra</td><td>Beckman Instruments, Germany</td><td>8043-30-0031</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Proteaseinhibtor-Cocktail</td><td>Roche, Switzerland</td><td>11697498001</td><td></td></tr><tr><td>D-Sorbit</td><td>Roth, Germany</td><td>6213</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (Ethylendiamin-tetraacetic acid isoodium salt dihydrate)</td><td>Roth, Germany</td><td>8043</td><td></td></tr><tr><td>Erlenmeyer flask, 100 mL</td><td>Roth, Germany</td><td>X747.1</td><td></td></tr><tr><td>目盛り付きピペット, Kl. B, 25:0, 0.1</td><td>Hirschmann, ドイツ</td><td>1180170</td><td></td></tr><tr><td>目盛り付きピペット, Kl. B, 5:0, 0.05</td><td>Hirschmann, Germany</td><td>1180153</td><td></td></tr><tr><td>ice bath</td><td>neoLab, Germany</td><td>&nbsp;S12651</td><td></td></tr><tr><td>マグネチックスターラー RCT ベーシック</td><td>IKA-Werke GmbH, ドイツ</td><td>Z645060GB-1EA</td><td></td></tr><tr><td>MOPS (3-(N-モルフォリノ)プロパンスルホン酸)</td><td>Gerbu, ドイツ</td><td>1081</td><td></td></tr><tr><td>MyPipetman Select P1000</td><td>ギルソン, アメリカ</td><td>FP10006S</td><td></td></tr><tr><td>MyPipetman Select P20</td><td>ギルソン, アメリカ</td><td>FP10003S</td><td></td></tr><tr><td>MyPipetman Select P200</td><td>ギルソン, アメリカ</td><td></td><td></td>FP10005S</tr><tr><td>Omnifix 1 mL</td><td>ブラウン、ドイツ</td><td>4022495251879</td><td></td></tr><tr><td>フェニルメチルスルホニルフッ化物 (PMSF)</td><td>Serva, ドイツ</td><td>32395.03</td><td></td></tr><tr><td>STERICAN カニューレ 21 Gx4 4/5 0.8x120 mm</td><td>ブラウン、ドイツ</td><td>4022495052414</td><td></td></tr><tr><td>攪拌バー、15 mm</td><td>VWR、米国</td><td>442-0366</td><td></td></tr><tr><td>スクロース</td><td>メルク、ドイツ</td><td>S8501</td><td></td></tr><tr><td>SW 41 Ti スウィングバケットローター</td><td>ベックマンインスツルメンツ、ドイツ</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>試験管</td><td>エッペンドルフ、ドイツ</td><td>3810X</td><td></td></tr><tr><td>ティッシュグラインダー、ポッター・エルヴェイェムタイプ、2 mLガラス容器</td><td>VWR、アメリカ</td><td>432-0200</td><td></td></tr><tr><td>ティッシュグラインダー、ポッター・エルヴェイェムタイプ、2 mL プランジャー、鋸歯状チップ</td><td>付き VWR、アメリカ</td><td>432-0212</td><td></td></tr><tr><td>トリクロロ酢酸 (TCA)</td><td>Sigma Aldrich, Germany</td><td>33731</td><td>販売終了, 任意の TCA で十分です (CAS: 73-03-9)</td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Roth, Germany</td><td>4855</td><td></td></tr></tbody></table>

ミトコンドリア接触部位を単離するための改良された方法

An Improved Method to Isolate Mitochondrial Contact Sites

ミトコンドリアは、事実上すべての真核細胞に存在し、例えば、鉄硫黄クラスター、脂質、またはタンパク質の合成、Ca2+ 緩衝、およびアポトーシスの誘導など、エネルギー生産をはるかに超える重要な機能を果たします。同様に、ミトコンドリアの機能不全は、癌、糖尿病、神経変性などの重篤な人間の病気を引き起こします。これらの機能を実行するために、ミトコンドリアは、2つの膜からなるエンベロープを介して細胞の残りの部分と通信する必要があります。したがって、これら2つの膜は常に相互作用する必要があります。ミトコンドリアの内膜と外膜の間のタンパク質接触部位は、この点で不可欠です。これまでのところ、いくつかの接触サイトが特定されています。本明細書に記載の方法では、 出芽酵母ミトコンドリア(Saccharomyces cerevisiae mitochondria)を用いて接触部位を単離し、したがって、接触部位タンパク質に適格な候補を同定する。この手法を用いて、酵母からヒトまで保存されているミトコンドリア内膜における主要なコンタクトサイト形成複合体の1つであるミトコンドリアコンタクトサイトとクリステ組織システム(MICOS)複合体を同定しました。最近では、この手法をさらに改良し、Cqd1とPor1-Om14複合体からなる新規コンタクトサイトを同定しました。

ミトコンドリアの内膜と外膜を分離することは比較的簡単です。しかし、接触部位を含む小胞の生成と分離ははるかに困難です。私たちの意見では、超音波処理条件と使用される勾配の2つのステップが重要かつ不可欠です。
通常、線形グラデーションは、ステップグラデーションと比較して解像度が高いと考えられています。しかし、再現性のある生産は面倒で、特別な機器が必要です。そこで、個々のステップ間の差が比較的小さいステップ勾配を生成する方法を確立しました(ステップ3.5参照)。遠心分離時にステップグラジエントのバランスが取れ、ほぼ直線的なグラジエントになるのではないかと推測しました。驚くべきことに、屈折計を使用して遠心分離後の個々のフラクションのスクロース濃度を測定したところ、200,000 x g で12時間の遠心分離後にステップグラジエントが実際にほぼ直線的になることが明らかになりました(図3)。
軽度の超音波処理の重要性は、これらの代表的な結果で明らかです。穏やかな超...

ミトコンドリアコンタクトサイトは、ミトコンドリアの内膜および外膜タンパク質と相互作用するタンパク質複合体です。これらの部位は、ミトコンドリア膜間のコミュニケーション、したがって細胞質とミトコンドリアマトリックスの間のコミュニケーションに不可欠です。ここでは、この特定のクラスのタンパク質に適格な候補を同定する方法について説明します。

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the ...

私たちは、ミトコンドリアの2つの膜間のコミュニケーションを可能にするミトコンドリア接触部位の分子機能の理解を目指しています。これは、ミトコンドリアの生合成機能、ひいては細胞の生存率を把握するための前提条件です。我々は、Cqd1とOm14-Por1によって作られたミトコンドリアの内膜と外膜の間に新しい接触部位を発見しました。私たちのデータは、この部位がホスファチジン酸のような脂質の輸入を助ける可能性があることを示唆しています。MICOS複合体の同定に基づき、ミトコンドリア膜構造がどのように生成されるのかをより深く理解することに貢献しました。これにより、ミトコンドリアクリステの2つの形態、ラメラと管状クリステがどのように形成されるかを説明する作業モデルを開発することができました。私たちの研究は、過去に酵母で行われました。しかし、正しいミトコンドリア構造の形成は、高等真核生物にとっても重要であると確信しています。そこで、私たちの研究の次のステップは、一次ニューロンのようなより複雑なモデルにおけるミトコンドリア構造要素の役割を分析することです。

an-improved-method-to-isolate-mitochondrial-contact-sites

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

哺乳動物の組織生検からのミトコンドリアの迅速な単離のための方法が記載されている。ラット肝臓または骨格筋​​調製物は、商業的な組織解離をホモジナイズし、ミトコンドリアをナイロンメッシュフィルターを通して差動濾過により単離した。代替的な方法を用いて100分間 - ミトコンドリアの分離時間は60と比較して&lt;30分である。...

組織解離と差動濾過により移植のためにミトコンドリアの迅速な単離および精製

ここで説明するフローサイトメトリーによりげっ歯類組織分析から単離されたミトコンドリアの免疫標識によってミトコンドリア外膜タンパク質を検出および定量するための方法である。この方法は、ミトコンドリア亜​​集団の機能的側面を評価するために拡張することができる。...

単離されたミトコンドリアのフローサイトメトリーによる外膜タンパク質の免疫検出

サンプル間のミトコンドリア膜電位の比較は、細胞の状態に関する貴重な情報をもたらします。ミトコンドリアを単離し、蛍光を使用して阻害剤およびアンカプラーに対する反応を評価するための詳細な手順について説明します。このプロトコルの方法と有用性は、細胞培養と細胞ストレスの動物モデルの使用によって説明されています。...

培養細胞およびマウス組織から単離とミトコンドリアの機能解析

広筋のヘイケボタルの生検、精製されたミトコンドリアの準備、および呼吸計測プロファイリングのための方法が記載されている。小さな筋肉量の使用は、臨床研究用途のためにこの技術に適しています。...

経皮針生検によって得られた骨格筋組織から単離されたミトコンドリアの調製と呼吸計測評価

ここでは、以前に報告された方法の修正版を提示し、少量のマウス骨格筋から高品質で精製されたミトコンドリアを分離することを可能にします。この手順により、マイクロプレートベースの呼吸器アッセイ中に高機能で呼吸する高度に結合したミトコンドリアが得られます。...

ハイスループットマイクロプレート呼吸測定のためのマウスの骨格筋の最小量からミトコンドリアの単離

ミトコンドリアは、植物細胞のわずかな割合は、彼ら研究の範囲を精製する必要があります。ミトコンドリアは、均質化、続いて高純度ミトコンドリア分画を取得する微分と密度勾配遠心法によってさまざまな植物器官から分離できます。...

分離とシロイヌナズナ由来のミトコンドリアの呼吸測定

ここでは、洗剤とクマシーブルーへの暴露を最小限に抑えるミトコンドリア supercomplexes...

ミトコンドリアの呼吸鎖 Supercomplexes の分離と分析のためのハイブリッドクリア/ブルーネイティブ電気泳動

プロテオームスケールでのタンパク質の発見と定量に適合する高品質のミトコンドリア単離のための2段階プロトコルを提示します。私たちのプロトコルは遺伝子工学を必要としないため、あらゆる初代細胞や組織からのミトコンドリアの研究に適しています。...

タンパク質の発見と定量を改善するためのミトコンドリアの2段階タグフリー分離

このプロトコルは、少量のサンプルしか利用できない場合の呼吸スーパーコンプレックスの分析技術について説明しています。...

ミトコンドリアスーパーコンプレックス解析のためのミトコンドリアの単離 (Small Tissue and Cell Culture Samples) 

ミトコンドリアの生体エネルギーおよびメタボローム研究により、多くの疾患におけるミトコンドリアの多面的な役割が明らかになっていますが、これらのオルガネラの単離方法はさまざまです。ここで詳述する方法は、複数の組織源から高品質のミトコンドリアを精製することができます。品質は、高解像度呼吸測定で評価される呼吸制御比やその他の指標によって決定されます。...

げっ歯類の心臓組織からの堅牢なミトコンドリア単離 

学ぶミトコンドリア接触部位の単離法とCQD1による新規接触部位の形成機構。酵母を用いた実験で、脂質輸入とミトコンドリア膜構造の理解に貢献する知見を得る方法です。

ミトコンドリア接触部位を単離するための改良された方法

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