Name: 出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)におけるシングルコピー遺伝子座クロマチン精製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-17T13:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: 学ぶ 出芽酵母Saccharomyces cerevisiaeにおけるシングルコピー遺伝子座のクロマチン精製法。架橋処理を行わず自然状態のままタンパク質-DNA相互作用を解析し、ゲノム安定性の研究に貢献します。

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S.H.研究所での作業は、SFB1064(プロジェクトID 213249687)、欧州研究会議(ERC Starting Grant 852798 ConflictResolution)、およびHelmholtz Gesellschaftを通じてDFGの支援を受けました。

酵母細胞からの遺伝子座特異的クロマチン単離

<ol><li>Kornberg, R. D., Lorch, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Twenty-five+years+of+the+nucleosome%2C+fundamental+particle+of+the+eukaryote+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Twenty-five years of the nucleosome, fundamental particle of the eukaryote chromosome.</a> Cell. 98 (3), 285-294 (1999).</li>
<li>Gauchier, M., van Mierlo, G., Vermeulen, M., Déjardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+enrichment+of+specific+chromatin+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Purification and enrichment of specific chromatin loci.</a> Nature Methods. 17 (4), 380-389 (2020).</li>
<li>Korthout, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+the+chromatin+proteome+of+a+single+genomic+locus+by+DNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Decoding the chromatin proteome of a single genomic locus by DNA sequencing.</a> PLoS Biology. 16 (7), e2005542(2018).</li>
<li>Antão, J. M., Mason, J. M., Déjardin, J., Kingston, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+landscape+at+Drosophila+melanogaster+telomere-associated+sequence+repeats%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein landscape at Drosophila melanogaster telomere-associated sequence repeats.</a> Molecular and Cellular Biology. 32 (12), 2170-2182 (2012).</li>
<li>Déjardin, J., Kingston, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+proteins+associated+with+specific+genomic+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Purification of proteins associated with specific genomic loci.</a> Cell. 136 (1), 175-186 (2009).</li>
<li>Ide, S., Dejardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((End-targeting+proteomics+of+isolated+chromatin+segments+of+a+mammalian+ribosomal+RNA+gene+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">End-targeting proteomics of isolated chromatin segments of a mammalian ribosomal RNA gene promoter.</a> Nature Communications. 6, 6674(2015).</li>
<li>Unnikrishnan, A., Gafken, P. R., Tsukiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+changes+in+histone+acetylation+regulate+origins+of+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26amp%3B+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamic changes in histone acetylation regulate origins of DNA replication.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 17 (4), 430(2010).</li>
<li>Buxton, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+protein-DNA+interactions+in+human+alphoid+chromatin+via+hybridization+capture+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Elucidating protein-DNA interactions in human alphoid chromatin via hybridization capture and mass spectrometry.</a> Journal of Proteome Research. 16 (9), 3433-3442 (2017).</li>
<li>Kennedy-Darling, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+chromatin-associated+proteins+via+sequence-specific+capture+and+mass+spectrometric+protein+identification+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Discovery of chromatin-associated proteins via sequence-specific capture and mass spectrometric protein identification in Saccharomyces cerevisiae.</a> Journal of Proteome Research. 13 (8), 3810-3825 (2014).</li>
<li>Liu, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPRi-based+genome-scale+identification+of+functional+long+noncoding+RNA+loci+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CRISPRi-based genome-scale identification of functional long noncoding RNA loci in human cells.</a> Science. 355, 7111(2017).</li>
<li>Hamperl, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+specific+chromatin+domains+from+single-copy+gene+loci+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Functional+Analysis+of+DNA+and+Chromatin%22%5BJournal%5D)">Purification of specific chromatin domains from single-copy gene loci in Saccharomyces cerevisiae.</a> Functional Analysis of DNA and Chromatin. 1094, 329-341 (2014).</li>
<li>Hamperl, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compositional+and+structural+analysis+of+selected+chromosomal+domains+from+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Compositional and structural analysis of selected chromosomal domains from Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Research. 42 (1), 2(2014).</li>
<li>Weiβ, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-copy+locus+proteomics+of+early-+and+late-firing+DNA+replication+origins+identifies+a+role+of+Ask1%2FDASH+complex+in+replication+timing+control%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Single-copy locus proteomics of early- and late-firing DNA replication origins identifies a role of Ask1/DASH complex in replication timing control.</a> Cell Reports. 42 (2), 112045(2023).</li>
<li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+yeast+transformation+using+the+LiAc%2FSS+carrier+DNA%2FPEG+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method.</a> Nature Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li>
<li>Western blot membrane stripping for restaining protocol. Abcam. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/protocols/western-blot-membrane-stripping-for-restaining-protocol">https://www.abcam.com/protocols/western-blot-membrane-stripping-for-restaining-protocol</a> (2023).</li>
<li>Vermeulen, M., Déjardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locus-specific+chromatin+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Locus-specific chromatin isolation.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 21 (5), 249-250 (2020).</li>
</ol>

著者には開示すべき利益相反はありません。

特定の標的ゲノム領域の因子とクロマチンランドスケープの同定は、クロマチン研究において大きな課題を提起し続けています18。このプロトコルはとりわけイースト染色体からの明瞭なchromatinの範囲を切除し、浄化する有効なシステムを記述する。私たちの知る限り、このシングルステップ精製の純度と収率は、遺伝子座特異的なクロマチン精製法の多くの制限を克服し、他の無関係なゲノム領域と比較して、標的遺伝子座の非常に高い濃縮を達成することを可能にします。
部位特異的なR-リコンビナーゼを用いた追加の切除ステップにより、ゲノム中の組換え部位の正確な位置に応じて、どのゲノム領域が精製されるかを正確に決定できるという利点もあります。対照的に、他の方法は超音波処理によるDNAの剪断に依存しており、その結果、分子の長さが不均一になります。この不均一性により、これらの方法は、明確に定義された標的遺伝子座の精製に関して精度が低くなります。 
最後に、この精製戦略では、ホルムアルデヒドなどの化学架橋剤を含まずに...

真核生物のゲノムをクロマチンに動的に組織化することで、DNAが核の範囲内に収められるように圧縮され、遺伝子発現に十分な動態と調節因子へのアクセス性が確保されます。この汎用性の一部は、クロマチンの基本単位であるヌクレオソームによって媒介されており、このヌクレオソームは、ヒストン八量体1の周囲に1~1.7倍のDNAが包まれたコア粒子で構成されています。ヌクレオソームは、その組成に関して非常にダイナミックな構造であり、N末端およびC末端のヒストンテールに多数のヒストン変異体と翻訳後修飾(PTM)があります。さらに、真核生物のクロマチンは、転写因子、DNAおよびRNAプロセシング機構、建築タンパク質、クロマチンのリモデリングおよび修飾に関与する酵素、クロマチンに関連するRNA分子など、他の多くの必須成分と相互作用します。転写、複製、修復に関与するこれらの重要な機構はすべて、これらのプロセスの天然基質として機能するクロマチンへのアクセスを必要とします。したがって、これらのDNAトランザクションの根底にある分子メカニズムを理解するには、これらの機構が収束し、生物学的反応を促進する特定のゲノム領域におけるクロマチン構造の集団的変化を正確に定義する必要があります。
遺伝学やタンパク質間相互作用の研究を通じて多数のクロマチン因子が同定されているにもかかわらず、特定のゲノム部位におけるクロマチン相互作用の直接的、偏りのない、包括的な分析を行うことは、依然として大きな障害となっています2,3。当初は、ゲノムの非常に豊富な領域(すなわち、反復遺伝子座)またはマルチコピープラスミドのみが、関連するタンパク質の質量分析同定に十分な量と純度で単離できました4,5,6,7。捕捉プローブのクロマチン化DNAへの直接ハイブリダイゼーション、CRISPR-dCas9システムを用いた近接ビオチン化、または配列特異的アダプタータンパク質の目的遺伝子座への結合に基づく一連の新しいアプローチにより、酵母および哺乳類のゲノムからのシングルコピー遺伝子座のプロテオームが解明され始めています8,9,10.しかし、これらすべての方法では、タンパク質とDNAの相互作用を安定化させるためのホルムアルデヒド架橋と、その後の精製のためにクロマチンを可溶化するための超音波処理が必要です。一緒に、両方の操作は、精製されたクロマチンのその後の構造的および機能的研究の可能性を排除する。
これらの限界を克服するために、我々は以前、酵母から標的染色体ドメインを抽出するために部位特異的組換えを採用する方法論を考案した11,12。要するに、関心のあるゲノム領域は、Zygosaccharomyces rouxi由来の部位特異的R-リコンビナーゼの認識部位(RS)に囲まれており、同時に原核生物の転写リプレッサーLexAタンパク質(LexA)の3つのDNA結合部位のグループを同じ領域内に組み込んでいます。酵母細胞には、R-リコンビナーゼとLexAタンパク質を同時に発現するための発現カセットが含まれており、タンデムアフィニティー精製(TAP)タグに融合しています。R-リコンビナーゼの誘導後、酵素は環状クロマチンドメインの形で染色体から標的領域を効率的に切除します。このドメインは、LexA DNA結合部位、およびアフィニティー担体に結合するLexA-TAPアダプタータンパク質を介して精製できます。この方法は、酵母染色体IIIの選択された複製起点を含む異なるクロマチンドメインを単離するために最近使用されています13。
この ex vivo アプローチの大きな利点の1つは、単離された材料の機能分析を可能にすることです。例えば、この方法で精製された複製起点ドメインを in vitro 複製アッセイに供して、天然の in vivo で組み立てられたクロマチンテンプレートから試験管内での起点焼成の効率を評価することができます。最終的に、単離された物質の生化学的および機能的特性評価により、精製されたタンパク質と天然クロマチンテンプレートを使用して核プロセスを再構成できる可能性があります。要約すると、この方法論は、特定の染色体トランザクションを受けている特定のゲノム領域の集合的な組成および構造クロマチンの変化を追跡することが可能になるため、クロマチン研究にエキサイティングな道を開きます。

<table><tbody><tr><td>酵母株</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Control株: MATa; ura3&Delta;0;leu2&デルタ;0;彼の3&デルタ;1;met15&デルタ;0;バー1::kanMX4;Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR</td><td></td><td></td><td>Section 1, 参考文献 13 および 14</td></tr><tr><td>Recombination Strain: MATa; ura3&Delta;0;leu2&デルタ;0;彼の3&デルタ;1;met15&デルタ;0;バー1::kanMX4;RS_LEXA_NS-3_ARS316_NS+3_RS;Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR</td><td></td><td></td><td>Section 1, 参考文献 13 および 14</td></tr><tr><td>Plasmid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>K238 Plasmid</td><td></td><td></td><td>Section 1, 参考文献 13 Storage: Store at -20 >C</td></tr><tr><td>K071 Spike-in プラスミド DNA</td><td></td><td></td><td>セクション 7.1、参考文献 13 Storage: Store at -20 &deg;C</td></tr><tr><td>試薬</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>アセトン</td><td>カールロス</td><td>5025.1</td><td>セクション2 保管:室温で保存</td></tr><tr><td>酢酸アンモニウム(NH4Ac)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7262</td><td>セクション6および7.1 保管:室温で保存</td></tr><tr><td>アンモニウム溶液(NH4OH) 25%</td><td>Merck Millipore</td><td>533003</td><td>セクション 6 保管: 室温で保管</td></tr><tr><td>硫酸アンモニウム</td><td>サンタクルーズ</td><td>Sc-29085</td><td>セクション 2 保管: 室温で保管</td></tr><tr><td>バクト寒天</td><td>BD (VWR)</td> <td>90000-760</td><td>セクション 3 保管: 室温で保管</td></tr><tr><td>バクト ペプトン</td><td>BD (VWR)</td> <td>211820</td><td>セクション 3 保管: 室温で保管</td></tr><tr><td>&beta;-メルカプトエタノール</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>07604</td><td>セクション7.2 ストレージ:4&degで保存します。C</td></tr><tr><td>化学発光基質キット</td><td>ThermoFisher</td><td>34580</td><td>セクション 7.2 保管: 4 °C で保管します。C</td></tr><tr><td>リン酸二ナトリウム水素十二水和物</td><td>メルク</td><td>1.06579.1000</td><td>セクション 2 および 7.1 保存: 室温で保存</td></tr><tr><td>ジチオスレイトール (DTT)</td><td>ThermoFisher</td><td>15508013</td><td>セクション 4 保存: 4 >C</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>メルク</td><td>100983</td><td>セクション 7.1 保存: 室温で保存</td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)</td> <td>シグマ アルドリッチ</td><td>ED</td><td>セクション 7.1 保存: 室温で保存</td></tr><tr><td>ガラクトース (20% (w/v) ストック)</td> <td>シグマ アルドリッチ</td><td>G0625-1KG&nbsp; /&nbsp; 5KG</td><td>セクション 3 保存: 室温で保存</td></tr><tr><td>ゲルローディング染料 (6x)</td><td>BioLabs</td><td>B7024A</td><td>セクション 7.1 保管: -20 °C で保管。C</td></tr><tr><td>グルソー</td><td>ス Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>Section 保存方法: 室温で保存</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Carl Roth.0079.4</td><td></td> <td>Section 2 保存方法: 室温で保存</td></tr><tr><td>グリコーゲン (5 mg/mL)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9510</td><td>セクション 7.1 保存方法: -20 °C;C</td></tr><tr><td>塩酸 (HCl)</td><td>PanReac AppliChem</td><td>182109.1211</td><td>セクション 2、4、7.1 保存: 室温で保存</td></tr><tr><td>酢酸マグネシウム (MgAc)</td> <td>Bernd Kraft</td><td>15274.2600/C035</td><td>セクション 4 保存: 室温で保存</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム (MgCl2)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266</td><td>セクション 6 保存方法: 室温で保存</td></tr><tr><td>Nu PAGE LDS サンプルバッファー (4x)</td><td>Invitrogen</td><td>2399549</td><td>セクション 7.2 保存: 室温で保存</td></tr><tr><td>フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール (25:24:1 v/v)</td><td>Invitrogen</td><td>15593-031</td><td>セクション 7.1 保存: 4 °C;C</td></tr><tr><td>塩化カリウム (KCl)</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td>セクション 4 保存:室温で保存</td></tr><tr><td>放射性標識 &α;-32P dATP (3,000 Ci/mmol, 10 mCi/mL)</td><td>Hartmann Analytic</td><td>SRP-203</td><td>セクション 7.1 保存:4 °C;C</td></tr><tr><td>RadPrimeラベリングシステム</td><td>ThermoFisher</td><td>18428-011</td><td>セクション7.1 保管:-20°Cで保管してください。C</td></tr><tr><td>ラフィノース(20%(w / v)ストック)</td><td>SERVA</td><td>34140.03</td><td>セクション3 保管:室温で保存</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム(NaCl)</td><td>メルク</td><td>K53710504142</td><td>セクション7.1 保存:室温で保存</td></tr> ク<tr><td>エン酸ナトリウム(Na3C6H5O7)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71402</td><td>セクション7.1 保存:室温で保存</td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム(NaOH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5881</td><td>Section 7.1 保管: 室温で保存</td></tr><tr><td>N-ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) (5% Stock (w/v))</td> <td>Alfa Aesar</td><td>A11183</td><td>Section 7.1 保存: 室温で保存</td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム 一塩基性</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71496</td><td>セクション 2 および 7.1 保存: 室温で保存</td></tr><tr><td>ナトリウム&nbsp;アジド</td><td>サンタクルス&nbsp;</td><td>バイオテクノロジーsc-208393</td><td>セクション2 ストレージ:-20°Cで保管します。C</td></tr><tr><td>&nbsp;トリエチルアミン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>90340</td><td>セクション 2 保存: 室温で保存</td></tr><tr><td>トリスベース</td><td>Chem Cruz</td><td>SC-3715B</td><td>セクション 2 および 4 保存: 室温で保存</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td>セクション 2 および 4 保存: 室温で保存</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Bernd Kraft</td><td>18014332</td><td>セクション4 保管:室温で保存</td></tr><tr><td>酵母抽出物</td><td>BD(VWR)</td><td>212720</td><td>セクション3 保存:室温で保存</td></tr><tr><td>酵母嵌合係数アルファ(1 & micro;g/mL ストック)</td><td>&nbsp;Biomol</td><td>Y2016.5</td><td>セクション3 ストレージ:-20°Cで保管します。</td></tr><tr><td>C 酵母合成ドロップアウト培地 サプリメント ロイシン</td><td>なし Sigma Aldrich</td><td>Y1376</td><td>セクション 1、参照 14</td></tr><tr><td>Enzymes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HpaI restriction enzymes (5,000 U/mL)</td><td>NEB</td><td>R0105S</td><td>Section 7.1 保存: -20 °C;C</td></tr><tr><td>プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル (100x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78446</td><td>Section 4 Storage: at 4 >C</td></tr><tr><td>プロテイナーゼ K (10 mg/mL)</td><td>SERVA</td><td>33756</td><td>セクション 7.1 保存: -20 °C で保存してください。C</td></tr><tr><td>RNase A(10 mg / mL)</td><td>&nbsp;ThermoFisher</td><td>EN0531</td><td>セクション7.1 保管:-20°Cで保管してください。C</td></tr><tr><td>TEVプロテアーゼ(10000 U/&micro;L)</td><td>NEB</td><td>P8112S</td><td>セクション5 ストレージ:-20°Cで保管します。C</td></tr><tr><td>Materials</>BcMag</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>エポキシ活性化磁気ビーズ</td><td>バイオクローン株式会社</td><td>FC-102</td><td>セクション2 ストレージ:4°で保管します。C</td></tr><tr><td>ドライアイス</td><td></td><td></td><td>セクション 4</td></tr><tr><td>低結合遠心チューブ 2.0 mL</td><td>エッペンドルフ</td><td>22431102</td><td>セクション 4</td></tr><tr><td>マイクロスピン&nbsp;G-25 カラム</td><td>Cytiva</td><td>27-5325-01</td><td>セクション 7.1 保管: 室温で保存</td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td>Merck</td><td>P7793</td><td>セクション 4</td></tr><tr><td>ポジティブ ナイロン膜</td><td>Biozol</td><td>11MEMP0001</td><td>セクション 7.1 保管: 室温で保存</td></tr><tr><td>PVDF 転写膜</td><td>Immobilon-Merck Millipore</td><td>IPVH00010</td><td>セクション 7.2 保管: 部屋で保管温度</td></tr><tr><td>SDS-PAGE gel 4-12% bis-tris (15 well, 1.5 mm)</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp;NP0336BOX</td><td>セクション7.2 ストレージ:4°で保存します。</td></tr><tr><td>C シリンジ (25 mL) ルアーフィッティング付き</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4200-000V0</td><td>セクション 3</td></tr><tr><td>Whatman 紙 (グレード 3MM CHR セルロースウェスタンブロッティング紙シート)</td> <td>Cytiva</td><td>3030-917</td><td>セクション 7.1 保存方法: 室温で保存</td></tr><tr><td>抗体</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-LexA、ウサギポリクローナル IgG、DNA 結合領域抗体</td><td>メルクMillipore</td><td>06-719</td><td>セクション7.2 ストレージ:-20°Cで保管します。C</td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギ IgG (H+L)、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体</td><td>Invitrogen</td><td>G21234</td><td>セクション 7.2 保管: -20 °C で保存してください。TAP</td></tr><tr><td>タグ付きタンパク質の検出のためにウサギで産生されたCペルオキシダーゼ抗ペルオキシダーゼ(PAP)抗体</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1291-500UL</td><td>Section 7.2 保存:-20°Cで保存してください。C</td></tr><tr><td>ウサギIgG抗体</td><td>シグマ</td><td>I5006-100MG</td><td>セクション2 保管:4°Cで保存してください。C</td></tr><tr><td>プライマー(10 &micro;M)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ARS316: fwd 5'- CGGCATTATCGTACACAACCT, rev 5'- GTTCTTCGTTGCCTACATTTTCT</td><td></td><td></td><td>セクション 7.1</td></tr><tr><td>K071 スパイクインプラスミド DNA: fwd: 5'-TTTTCGCTGCTTGTCCTTTT, rev 5'- CATTTTCGTCCTCCCAACAT</td><td></td><td></td><td>セクション 7.1</td></tr><tr><td>PCRフラグメントをテンプレートとして酵母ゲノムDNAから&nbsp;ARS316増幅用(サザンブロット用): fwd 5'- AAATTCTGCCCTTGATTCGT&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;rev 5'- TTTGTTTATCTCATCACTAAT</td><td></td><td></td><td>セクション 7.1</td></tr><tr><td>PDC1: fwd 5'- CATGATCAGATGGGGCTTCA, rev 5'-ACCGGTGGTAGCGACTCTGT</td><td></td><td></td><td>セクション 7.1</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>コーヒーグラインダー</td><td>Gastroback</td><td>42601</td><td>セクション 4</td></tr><tr><td>デュワーフラスコ</td><td>NAL GENE</td><td>4150-2000</td><td>セクション</td></tr><tr><td>3 DynaMag TM-2 磁気ラック</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td>セクション 4、5、6</td></tr><tr><td>ハイブリダイゼーション オーブン</td><td>Hybaid Mini10</td><td>Ri418</td><td>セクション 2</td></tr><tr><td>マイクロ遠心分離機</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td>セクション 4 および 7.1</td></tr><tr><td>UV 架橋剤</td><td>Analytikjena</td><td>95-0174-02</td><td>セクション 7.1</td></tr></tbody></table>

出芽酵母(saccharomyces cerevisiae)におけるシングルコピー遺伝子座クロマチン精製

Single-Copy Gene Locus Chromatin Purification in Saccharomyces cerevisiae

真核生物のクロマチンの基本的な組織単位はヌクレオソームコア粒子(NCP)であり、ヒストン八量体に~1.7倍巻き付けられたDNAで構成されています。クロマチンは、NCPや、転写因子、クロマチンリモデリング、修飾酵素など、他の多くのタンパク質複合体の実体として定義されています。これらのタンパク質-DNA相互作用が、細胞周期のさまざまな段階で特定のゲノム遺伝子座のレベルでどのように調整されるかはまだ不明です。これは主に、このような動的相互作用の正確な測定値を得ることが困難になっている現在の技術的制限によるものです。ここでは、サイト特異的組換えと効率的なシングルステップアフィニティー精製プロトコルを組み合わせて、ネイティブクロマチン状態で目的の単一コピー遺伝子座を単離する改良された方法について説明します。この分析法は、ゲノムクロマチン上の標的遺伝子座の強固な濃縮を可能にするため、この手法は、質量分析などによって、偏りのない体系的な方法でタンパク質相互作用を同定および定量するための効果的な戦略となります。このような組成分析に加えて、この方法で精製された天然クロマチンは、ヌクレオソームの位置とヒストン修飾に関する in vivo の状況を反映している可能性が高いため、酵母のほぼすべてのゲノム遺伝子座に由来するクロマチンのさらなる構造および生化学的分析に適しています。

~1.4 kb の ARS316 クロマチンドメインの精製は、恒常的に発現した LexA-TAP アダプタータンパク質によって媒介されました。ネガティブコントロールとして、LexA-TAPを発現するが、RSおよびLexA結合部位が統合されていない同種株を用いて精製を実施しました。 図3 は、ARS316遺伝子座を標的とする対照株と組換え能力株の両方に対して実施された標準精製実験のDNA分析結果を示しています。環状DNA分子を直鎖化するためにDNA単離および制限酵素消化を行った後、qPCR分析を実施して、無関係なゲノムコントロール遺伝子座PDC1に対するARS316標的遺伝子座の精製効率を評価しました。
さらに、全クロマチンに対するARS316遺伝子座の濃縮を定量化しました(図3A、B)。ネガティブコントロール株では、粗細胞抽出物、インプット、およびフロースルーを除く画分のいずれからもARS316またはPDC1遺伝子座の回収は見られ...

このプロトコルは出芽のイースト、Saccharomycesのcerevisiaeからの原産のchromatinの文脈の興味の単一コピー遺伝子座を浄化するために場所特定の組換えに基づいて位置特定のchromatinの隔離方法を示す。

出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)におけるシングルコピー遺伝子座クロマチン精製

The basic organizational unit of eukaryotic chromatin is the nucleosome core particle (NCP), which comprises DNA wrapped ~1.7 times around a histone ...

真核生物の核は、多くの生物学的プロセスが同時に発生し、非常に混雑しています。私たちの研究の範囲は、ゲノムの不安定性やヒトの病気につながるような大きな事故を起こさずに、これらすべてのプロセスがゲノム上でどのように調整されているかを理解することです。このプロトコルは私達が蛋白質DNAの相互作用の測定のような隔離された材料の構成および機能特徴付けを、可能にする原産状態のゲノムの特定の位置を浄化することを可能にする。このプロトコルは、遺伝子座特異的クロマチン単離の多くの現在の制限を克服する、標的とする遺伝子座の濃縮の膨大なレベルを可能にします。材料は架橋されていません。これにより、in vitro転写やin vitro複製など、多くのダウンストリーム機能解析も可能になります。従ってこのプロトコルは私達がプロテオミクスの分析を行い、chromatinの要因を相互に作用させる新しい起源を識別することを可能にし、従ってDNAの複製の研究分野を進めるイースト染色体からの明瞭な複製の起源を切除し、浄化することを可能にした。このプロトコルはchromatinの状態、ヒストンの修正を検査し、chromatinの研究を進める内生染色体からの自然なヌクレオソームテンプレートの構造分析を行うために浄化された起源材料を使用して生体外の複製の調査を可能にする。

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

この論文は、染色体外環状DNA（eccDNA）を精製するためのCircle-Seqと呼ばれる高感度な方法を紹介しています。この方法には、カラム精製、残存する直鎖状染色体DNAの除去、ローリングサークル増幅、ハイスループットシーケンシングが含まれます。Circle-Seqは、真核生物のeccDNAのゲノムスケールのスクリーニングや、ゲノムの不安定性やコピー数多型の研究に応用できます。...

真核細胞から体外の環状DNAのゲノムワイドな精製

ミクロコッカスヌクレアーゼ（MNase）融合タンパク質でゲノムワイドのタンパク質結合部位をマッピングするためのクロマチン免疫沈降（ChIP） - 直交方法であるハイスループット配列決定（ChEC-seq）と結合したクロマチン内在性切断について記載する。...

ChEC-seqとのタンパク質 - DNA相互作用のゲノムワイドマッピング<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

ここでは、出芽酵母酵母から変更されたヒストンのクロマチン免疫沈降のためのプロトコルについて述べる。沈澱 DNA はその後量的な PCR...

酵母からヒストン修飾のクロマチン免疫沈降 (チップ)

CRISPR/Cas12aシステムは単一のcrRNA配列と結合して複数の遺伝子座のS.セレビシエのゲノムの有効な多重編集を同時に可能にする。これは、その後、酵母ピクセル技術を作成するために使用される酵母株を生産するカロテノイドを構築することによって実証されます。...

CRISPR/Cas12a サッカロマイセスセレビシエの多重ゲノム編集と酵母ピクセルアートの創造

ここでは、 サッカロミセスセレビシエの増加したコピー数サプレッサー画面を介して遺伝的相互作用を識別するためのプロトコルです。この方法により、研究者は短命酵母変異体のサプレッサーを同定、クローン化、および試験することができます。オートファジーヌル変異体における SIR2...

サッカロミセス・セレビシエにおける年代の寿命を調節する遺伝的リンクの特性評価のためのサプレッサースクリーン

この研究は、 シゾサッカロミセス・ポンベにおけるマルチコピーサプレッサー遺伝子スクリーニングのプロトコルについて説明しています。このスクリーニングでは、ゲノムワイドなプラスミドライブラリを使用して、クエリ変異株に関連する機能喪失表現型のサプレッサークローンを特定します。 ell1...

シゾサッカロミセス・ポンベにおけるマルチコピーサプレッサー同定のための遺伝子スクリーニング

本稿では、変異を熱安定をスクリーニングヒトセロトニントランスポーターの精製、高親和性抗体を生成し、抗うつ薬のSの -シタロプラムにバインドされたセロトニントランスポーター-抗体複合体を結晶化する方法について説明します。このプロトコルは、他の挑戦的な膜輸送体、受容体、およびチャネルの研究に適合させることができます。...

にバインドされた熱安定、発現、精製、およびヒトセロトニントランスポーターの結晶化<em&gt; S</em&gt; - シタロプラム

ここでは、S100A12（calgranulin C）を発現、精製する方法を紹介します。我々は、ヒト病原体H.ピロリに対するその抗菌活性を測定するためのプロトコルを記載する。...

S100A12の発現、精製および抗菌活性

クロマチン免疫沈降による筋線維の遺伝子の規則の研究に適応した成体マウス骨格筋からクロマチンの準備のための新しいプロトコルが表示されます。...

クロマチン免疫沈降マウス骨格筋からの改善されたプロトコル

大規模な感度を考慮した結合親和性平衡、ソリューションを決定するための手法をご紹介します。これは、転写因子の DNA...

蛍光顕微鏡を使用して競争力のある滴定による転写因子の DNA 結合親和性の高感度測定

学ぶ 出芽酵母Saccharomyces cerevisiaeにおけるシングルコピー遺伝子座のクロマチン精製法。架橋処理を行わず自然状態のままタンパク質-DNA相互作用を解析し、ゲノム安定性の研究に貢献します。

出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)におけるシングルコピー遺伝子座クロマチン精製

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