Name: オートファジー関連4Bシステインペプチダーゼ阻害剤の細胞ベースの薬物スクリーニング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-30T12:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: 学ぶATG4システインプロテアーゼ阻害剤の細胞ベース薬物スクリーニング法。ルシフェラーゼアッセイとハイスループット技術を用いて、がんや神経変性疾患の新規治療薬候補を探索する基礎研究手法です。

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この研究は、MRC-UCL University Unit Grant Ref MC_U12266B、MRC Dementia Platform Grant UK MR/M02492X/1、Pancreatic Cancer UK(助成金参照2018RIF_15)、およびUCL Therapeutic Acceleration Supportスキームへの英国医学研究評議会のコア資金によって支援され、MRC Confidence in Concept 2020 UCL MC/PC/19054からの資金提供によって支援されました。ActinLC3dNGLUC(pMOWS-ActinLC3dNGLUC)をコードするプラスミドは、Dr. Robin Ketteler(Department of Human Medicine, Medical School Berlin)から入手しました。

4B Cysteine Peptidase オートファジー阻害剤のハイスループットスクリーニング解析

<ol><li>Kocaturk, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+as+a+molecular+target+for+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Autophagy as a molecular target for cancer treatment.</a> European Journal of Pharmaceutical Sciences. 134, 116-137 (2019).</li>
<li>Fu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+ATG4+in+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Targeting ATG4 in cancer therapy.</a> Cancers. 11 (5), 649(2019).</li>
<li>Towers, C. G., Thorburn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+targeting+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">Therapeutic targeting of autophagy.</a> EBioMedicine. 14, 15-23 (2016).</li>
<li>Agrotis, A., Ketteler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+ATG4B+as+drug+target+for+treatment+of+solid+tumours-the+knowns+and+the+unknowns%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">On ATG4B as drug target for treatment of solid tumours-the knowns and the unknowns.</a> Cells. 9 (1), 53(2019).</li>
<li>Levy, J. M. M., Towers, C. G., Thorburn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+autophagy+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Targeting autophagy in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (9), 528-542 (2017).</li>
<li>Kimmelman, A. C., White, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+and+tumor+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Autophagy and tumor metabolism.</a> Cell Metabolism. 25 (5), 1037-1043 (2017).</li>
<li>Tran, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Context-dependent+role+of+ATG4B+as+target+for+autophagy+inhibition+in+prostate+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Context-dependent role of ATG4B as target for autophagy inhibition in prostate cancer therapy.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 441 (4), 726-731 (2013).</li>
<li>Pengo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+kinases+and+phosphatases+that+regulate+ATG4B+activity+by+siRNA+and+small+molecule+screening+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of kinases and phosphatases that regulate ATG4B activity by siRNA and small molecule screening in cells.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 148(2018).</li>
<li>Kauffman, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delipidation+of+mammalian+Atg8-family+proteins+by+each+of+the+four+ATG4+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Delipidation of mammalian Atg8-family proteins by each of the four ATG4 proteases.</a> Autophagy. 14 (6), 992-1010 (2018).</li>
<li>Tanida, I., Sou, Y. -S., Minematsu-Ikeguchi, N., Ueno, T., Kominami, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atg8L%2FApg8L+is+the+fourth+mammalian+modifier+of+mammalian+Atg8+conjugation+mediated+by+human+Atg4B%2C+Atg7+and+Atg3%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Atg8L/Apg8L is the fourth mammalian modifier of mammalian Atg8 conjugation mediated by human Atg4B, Atg7 and Atg3.</a> The FEBS Journal. 273 (11), 2553-2562 (2006).</li>
<li>Agrotis, A., Pengo, N., Burden, J. J., Ketteler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redundancy+of+human+ATG4+protease+isoforms+in+autophagy+and+LC3%2FGABARAP+processing+revealed+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Redundancy of human ATG4 protease isoforms in autophagy and LC3/GABARAP processing revealed in cells.</a> Autophagy. 15 (6), 976-997 (2019).</li>
<li>Nguyen, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atg8+family+LC3%2FGABARAP+proteins+are+crucial+for+autophagosome-lysosome+fusion+but+not+autophagosome+formation+during+PINK1%2FParkin+mitophagy+and+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Atg8 family LC3/GABARAP proteins are crucial for autophagosome-lysosome fusion but not autophagosome formation during PINK1/Parkin mitophagy and starvation.</a> The Journal of Cell Biology. 215 (6), 857-874 (2016).</li>
<li>Ketteler, R., Tooze, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATG4%3A+More+than+a+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">ATG4: More than a protease.</a> Trends in Cell Biology. 31 (7), 515-516 (2021).</li>
<li>Zhang, L., Li, J., Ouyang, L., Liu, B., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+roles+of+Atg4+proteases+from+autophagy+modulation+to+targeted+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Unraveling the roles of Atg4 proteases from autophagy modulation to targeted cancer therapy.</a> Cancer Letters. 373 (1), 19-26 (2016).</li>
<li>Fernández, ÁF., López-Otín, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+and+pathologic+relevance+of+autophagy+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The functional and pathologic relevance of autophagy proteases.</a> The Journal of Clinical Investigation. 125 (1), 33-41 (2015).</li>
<li>Maruyama, T., Noda, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy-regulating+protease+Atg4%3A+structure%2C+function%2C+regulation+and+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Antibiotics%22%5BJournal%5D)">Autophagy-regulating protease Atg4: structure, function, regulation and inhibition.</a> The Journal of Antibiotics. 71 (1), 72-78 (2017).</li>
<li>Ketteler, R., Seed, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+autophagy+by+luciferase+release+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Quantitation of autophagy by luciferase release assay.</a> Autophagy. 4 (6), 801-806 (2008).</li>
<li>Ketteler, R., Sun, Z., Kovacs, K. F., He, W. -W., Seed, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pathway+sensor+for+genome-wide+screens+of+intracellular+proteolytic+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">A pathway sensor for genome-wide screens of intracellular proteolytic cleavage.</a> Genome Biology. 9 (4), 64(2008).</li>
<li>Luft, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Gaussia+luciferase+in+bicistronic+and+non-conventional+secretion+reporter+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Application of Gaussia luciferase in bicistronic and non-conventional secretion reporter constructs.</a> BMC Biochemistry. 15, 14(2014).</li>
<li>Ketteler, R., Glaser, S., Sandra, O., Martens, U. M., Klingmüller, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+transgene+expression+in+primitive+hematopoietic+progenitor+cells+and+embryonic+stem+cells+efficiently+transduced+by+optimized+retroviral+hybrid+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Enhanced transgene expression in primitive hematopoietic progenitor cells and embryonic stem cells efficiently transduced by optimized retroviral hybrid vectors.</a> Gene Therapy. 9 (8), 477-487 (2002).</li>
</ol>

著者には開示すべき利益相反はありません。

このプロトコルはATG4Bの抑制剤の同一証明のためのセルベースのレポーター遺伝子の試金を記述する。一次ヒットの同定は、β-アクチンとdNGLUCの間のLC3Bの全長オープンリーディングフレームを発現する細胞の処理時のルシフェラーゼ活性に基づいています。このアッセイの利点は、細胞を溶解せずにdNGLUCを検出できるため、感度が高く、定量性が高く、非侵襲的であることです。この論文では、安定した細胞株と一次スクリーニングを生成するための詳細なプロトコルを提示します。プロトコルにはいくつかの重要なステップがあります。 
まず、ここで説明するプロトコルは、高いトランスフェクション効率と高い増殖能を示すPANC1細胞株を使用しました。このスクリーニング法は、他の細胞株を用いて実施することができるが、形質導入の有効性は細胞株ごとに異なる場合がある。第二に、レポーターの発現レベルが時間の経過とともに低下する可能性があるため、継代数が5を超える凍結ストックからの安定した細胞集団での作業は避けるべきです。第 3 に、各アッセイの前に新鮮な細胞バッチを使用して、さまざまな実験でルシフェラーゼの最大か...

オートファジーは、細胞が細胞内の恒常性を維持し、リソソームを介して老化した、欠陥のある、または不要な細胞内容物を分解することによってストレスに応答できるようにする保存された代謝プロセスです1,2,3。いくつかの病態生理学的条件下では、このプロセスは栄養素と酸素の欠乏に対する重要な細胞応答として機能し、栄養素と脂質がリサイクルされ、細胞が代謝ニーズに適応することを可能にします2,3,4。オートファジーは、神経変性疾患、病原体感染、各種がんなど、いくつかの疾患に関連する細胞ストレス応答としても確認されています。がんにおけるオートファジーの機能は複雑で、腫瘍の種類、病期、状態によって異なります。損傷した細胞のオートファジー分解によって腫瘍形成を抑制することができますが、低酸素、栄養欠乏、細胞傷害性損傷などのストレスの多い条件下での細胞生存を改善することにより、進行性腫瘍の生存を促進することもできます2,4,5,6。
いくつかの研究は、オートファジー阻害が抗がん戦略として有益であることを示しました。したがって、オートファゴソームの形成やリソソームとの融合などの重要なステップの阻害は、がん制御の効果的な方法である可能性があります2,4,5,6。ATG4Bが特定の病態に関与していることが次々と明らかになってきており、抗がん剤の標的として注目されています2,3,4。例えば、大腸がん細胞とヒト上皮成長因子受容体2(HER2)陽性乳がん細胞は、隣接する正常細胞よりもATG4B発現レベルが有意に高いことが観察されました2,4。前立腺癌細胞では、ATG4Bの阻害により、細胞株特異的に化学療法および放射線療法に対する感受性が生じた7。最近、膵管腺癌(PDAC)がATG4B阻害に対して特に脆弱であるという強力な証拠が浮上しています。例えば、遺伝子改変マウスモデルでは、ATG4B機能が断続的に失われると、PDAC腫瘍の増殖が抑制され、生存率が向上することが示されました3,4。全体として、ATG4Bは一部のがん種で高度に過剰発現しており、腫瘍の進行に関連し、がん治療抵抗性に関連しています2,4,8。
哺乳類のATG4システインプロテアーゼには、ATG4A-ATG4Dの4つのファミリーメンバーがあります。これらのタンパク質は、タンパク質のLC3 / GABARAP(ATG8)ファミリーに対していくつかの標的選択性を示し9,10,11、プロテアーゼ活性に関連しない追加の機能を有する可能性があります12,13。さらに、ATG4は、新しいタイプの翻訳後修飾であるタンパク質のATG8-イル化を調節する機能も備えています11,12。ATG4Bとその主要な基質であるLC3Bは最も広く研究されていますが、オートファジープロセスと非オートファジープロセスの制御における各サブファミリーメンバーの複雑な役割を示唆する図式が浮上しています。このことは、リン酸化、アセチル化、グリコシル化、およびニトロシル化を介してATG4B活性を調節する翻訳後修飾の複雑なネットワークによってさらに裏付けられています9,10,11,12,13。
いくつかの既知のATG4B阻害剤が発表されています2,4,14,15。これらは研究ツールとして適していますが、その薬力学的プロファイル、選択性、または効力は、前臨床候補としての開発をまだ排除しています4,16。全体として、より強力で選択的な化合物を同定することが急務となっています。多くの場合、これらの化合物はタンパク質機能の優れた生化学的阻害剤ですが、細胞ベースのアッセイにおける有効性は低いです。ATG4B活性をモニターするためのアッセイには、生化学的方法や細胞ベースのアッセイなど、複数のアッセイがあります4。我々は以前、細胞内のATG4B活性をモニタリングするためのシンプルな発光ベースのハイスループットアッセイを開発した8,17。このアッセイは、細胞外環境で安定して活性であり、ATG4Bタンパク質分解活性に応答して細胞から誘導的に放出できるGaussia princeps(GLUC)由来のルシフェラーゼタンパク質を利用します18,19。
このレポーターコンストラクトでは、dNGLUCは細胞のアクチン細胞骨格に結合しています。プロテアーゼ特異的リンカーは、β-アクチンアンカーとdNGLUCの間に導入され、分泌物がリンカーの切断に依存するようになります。LC3Bの切断をモニターするために、β-アクチンとdNGLUCの間のLC3Bの全長オープンリーディングフレームを使用しました17,18,19。dNGLUCの分泌機構はよくわかっていませんが、ATG4B活性のモニタリングに特異的であり、ATG5ノックアウト細胞で発生するオートファジー全体に依存せず、古典的なシグナルペプチドを必要としない非従来型のメカニズムによって媒介されます4,18,19。このレポーターを使用して低分子やsiRNAライブラリーをスクリーニングすることに成功し、Aktプロテインキナーゼ8などのATG4B活性の新規制御因子を同定しました。この論文では、このルシフェラーゼレポーターを半自動のハイスループットスクリーニングフォーマットで使用するための詳細なプロトコルについて説明します。

<table><tbody><tr><td>50 マイクロ;L 使い捨てチップ - フィルターなし、純粋、ネスト 8 スタック (パッシブ スタック)</td><td>Tecan</td><td>30038609</td><td>使い捨て 96 チップ ラック</td></tr><tr><td>BioTek MultiFlo</td><td>BioTek</td><td></td><td>バルク ディスペンサー</td></tr><tr><td>セレンテラジン</td><td>サンタ クルス バイオテクノロジー</td><td>sc-205904</td><td>基板</td></tr><tr><td>コロンバス 画像解析ソフトウェア</td><td>Perkin Elmer</td><td>バージョン 2.9.1</td><td>画像解析ソフトウェア</td></tr><tr><td>DPBS (1x)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>エコー認定 384 ウェル ポリプロピレン マイクロプレート、透明、非滅菌</td><td>ベックマン・コールター</td><td>001-14555</td><td>384PP プレート</td></tr><tr><td>EnVision II</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>発光プレート リーダー</td></tr><tr><td>エクスプレス ピック ライブラリ (96 ウェル)-L3600-Z369949-100&micro;L</td><td>Selleckchem</td><td>L3600</td><td>Selleckchem</td></tr><tr><td>FMK9A</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-100522</td><td></td></tr><tr><td>Greiner FLUOTRAC 200 384 ウェルプレート</td><td>Greiner Bio-One</td><td>781076</td><td>ソリッドブラック 384 ウェルプレート</td></tr><tr><td>ハーモニーイメージングソフトウェア</td><td>Perkin Elmer</td><td>バージョン 5.1</td><td>イメージングソフトウェア</td></tr><tr><td>Hoechst 33342、三塩酸塩、三水和物 - 10</td> <td>mg/mL 水溶液サーモフィッシャー</td><td>H3570</td><td>Hoechst 33342</td></tr><tr><td>Labcyte Echo 550 シリーズ、エコーチェリーピックソフトウェア</td><td>Labcyte/Beckman Coulter</td><td></td><td>ナノスケール音響液体ディスペンサー</td></tr><tr><td>Milli-Q 水</td><td></td><td></td><td>脱イオン水</td></tr><tr><td>Opera Phenix ハイコンテントスクリーニングシステム</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>自動顕微鏡</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド溶液 PBS サンタクルーズで 4%</td><td>バイオテクノロジー</td><td>sc-281692</td><td></td></tr><tr><td>PhenoPlate 384-well, black, optically clear flat-bottom, tissue-culture treated, lids</td><td>Perkin Elmer</td><td>6057300</td><td>CellCarrier-384 Ultra PN</td></tr><tr><td>pMOWS-ActinLC3dNGLUC</td><td></td><td></td><td>Obtain from Dr. Robin Ketteler (Department of Human Medicine, Medical School Berlin)ポリ</td></tr><tr><td>ブレン感染/トランスフェクション試薬</td><td>Merck</td><td>TR-1003-G</td><td>polybrene</td></tr><tr><td>ピュロマイシン二塩酸塩、98%、 Thermo Scientific Chemicals</td><td>ThermoFisher</td><td>J61278.ME</td><td>Puromycin</td></tr><tr><td>Tecan Freedom EVO 200 ロボット</td><td>Tecan</td><td></td><td>リキッドハンドリングロボットプラットフォーム</td></tr><tr><td>X-tremeGENE HP DNA トランスフェクション試薬 Roche</td><td>Merck</td><td>6366244001</td><td>DNA トランスフェクション試薬</td></tr></tbody></table>

オートファジー関連4bシステインペプチダーゼ阻害剤の細胞ベースの薬物スクリーニング

Cell-Based Drug Screening for Inhibitors of Autophagy Related 4B Cysteine Peptidase

高いオートファジーフラックスが腫瘍の進行やがん治療抵抗性に関連していることを示す証拠が増えています。個々のオートファジータンパク質のアッセイは、この経路を標的とする治療戦略の前提条件です。オートファジープロテアーゼATG4Bの阻害は全生存期間を延長することが示されており、ATG4Bががん治療の創薬標的となる可能性が示唆されています。当研究室では、細胞内のATG4B活性をモニタリングするための選択的ルシフェラーゼベースのアッセイを開発しました。このアッセイでは、ATG4Bの基質であるLC3Bを、海産カイアシ類Gaussia princeps(GLUC)由来の分泌可能なルシフェラーゼでC末端にタグ付けします。このレポーターはアクチン細胞骨格と結合しているため、アクチンを切断しても細胞の細胞質に留まります。ATG4Bを介した切断により、従来とは異なる分泌によってGLUCが放出され、細胞のATG4B活性の相関関係として細胞培養から上清を採取することで監視できます。このホワイトペーパーでは、このルシフェラーゼベースのアッセイを自動ハイスループットスクリーニングに応用する方法を紹介します。細胞ATG4B活性の例示的なハイスループット解析のためのワークフローと最適化について説明します。

以前の論文8では、このアッセイを使用して低分子およびsiRNAライブラリーをスクリーニングし、ATG4Bの新規制御因子を同定することに成功しました。ここでは、このルシフェラーゼレポーターのプロトコールと代表的な結果を、半自動のハイスループットスクリーニングフォーマットで説明します。 図8 は、細胞核と発光の両方の生データ解析の例を示しています。ルミネッセンス測定の典型的な結果を 図8Aに示します。DMSO からの基底発光シグナルはカラム 1 に、カラム 24 には 10 μM の ATG4B 阻害剤 FMK9A の存在下で見られます。同じプレートからの核カウントの結果を 図8Bに示します。各化合物の生値を中性対照の平均値に正規化して、ATG4B活性と細胞生存率のパーセンテージを取得しました(図9A、B)。予想通り、ほとん...

ここでは、ルシフェラーゼベースのレポーターアッセイを半自動のハイスループットスクリーニングフォーマットで使用するための詳細なプロトコルについて説明します。

オートファジー関連4Bシステインペプチダーゼ阻害剤の細胞ベースの薬物スクリーニング

Growing evidence has shown that high autophagic flux is related to tumor progression and cancer therapy resistance. Assaying individual autophagy proteins ...

私の研究室での研究の主な目的は、オートファジー、特にATG4システインプロティアンの制御を理解し、この知識を利用して、特に膵臓がんなどの疾患に対してこの経路を標的とする低分子阻害剤を開発することです。当社は、ハイコンテント、ハイスループットスクリーニング技術を用いて創薬標的および創薬候補を同定しており、ATG4システインプロテアーゼファミリーは、さまざまな形態のがんに対する非常に優れた創薬標的であると考えているため、これに着目しています。私たちは、ATG4ファミリーのメンバーをかなり長い間研究してきました。私たちは、このタンパク質ファミリーと細胞の機能不全について重要な発見をしました。また、ATG4ファミリーの新たな翻訳後制御機構を同定し、現在、がんや神経変性などの疾患に対する低分子阻害剤やATG4ファミリーの活性化剤の開発を行っています。細胞内のATG4プロテアーゼ活性をモニターするアッセイは多くありません。そのため、私たちは、この活性をモニターするためのルシフェラーゼベースのアッセイを最初に開発した企業の1つです。また、私たちのアッセイは、分泌型を使用するため、非常に珍しいため、細胞のライセンスを取得する必要がなく、このプロトコルをハイスループットスクリーニング法やラボオートメーションに簡単に適合させることができます。私たちは、ATG4 Bタンパク質プロテアーゼにかなり長い間注目してきました。ATG4ファミリーメンバーのノックアウト細胞株を作製しました。私たちは、ATG4の新しい翻訳後制御機構を同定し、最終的には、ATG4 Bプロテアーゼを阻害し、さらには活性化する可能性のあるいくつかの新しい低分子化合物も同定しました。今後もATG4ファミリーの開発を続けていきたいと考えています。これは、現在不明であり、まだ解明されていないことがかなり多いと思います。例えば、これらのタンパク質がニューロンのオートファジーをどのように制御しているかは、現在のところ完全には解明されていません。また、同定したこれらの低分子化合物の検証にも注力し、神経変性疾患に活性化剤を使用する可能性も視野に入れています。

cell-based-drug-screening-for-inhibitors-autophagy-related-4b

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

オートファジーは、細胞がタンパク質や細胞小器官が低下し、リサイクルを可能にするユビキタスプロセスです。我々はautolysosomesに小さいが、オートファゴソームとリソソームの形成と流通を含むオートファジーの誘導に関連付けられている本質的な、物理的な変化、およびそれらの融合を可視化し、定量化するための高度な蛍光顕微鏡を適用します。...

高度な3D蛍光顕微鏡を用いたオートファジーの定量分析

病原体の普及に対抗するために、宿主細胞には、細菌を区分し、オートファジーを誘導するそれらの細胞骨格を再編成する。組織培養細胞のシゲラ感染を使用して、このプロセスの基礎となるホストおよび病原決定因子が同定され、特徴付けられる。 シゲラ感染のゼブラフィッシュモデルを使用して、発見された分子およびメカニズムの役割は、in vivoで調べた。...

使用<em&gt;フレクスナー赤痢菌</em&gt;オートファジー細胞骨格の相互作用を研究するために

ここでは、LC3スポット計数とともに、3つのオートファジーマーカーの明るい詳細画像を比較し、それらの共局在化を定量化する分析的特徴を有するマルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーを用いて、客観的、定量的および統計的に堅牢な方法でオートファジーを測定した。...

マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーを用いたLC3、p62、およびLAMP1共局在の測定によるオートファジーフラックスの評価

ここでは、2 つの抗体を用いたタンパク質間相互作用研究手法を提示: 蛍光抗体法と免役沈降法。これらのテクニックは、蛋白質、細胞のシグナル伝達経路の新規成分の探索と理解蛋白質の原動力の間の物理的な相互作用を研究するために適しています。<br...

オートファジー研究でタンパク質間相互作用の研究

Mitophagy、クリア破損しているミトコンドリアのプロセスはミトコンドリアの恒常性と健康維持のため必要です。この記事は最新の mitophagy...

In VitroとIn Vivo検出、ひと細胞、線虫、マウス Mitophagy の

ここで哺乳類細胞における一括 autophagic 貯留活性を測定する簡単なよく検証されたプロトコルが記述されています。メソッドは、sedimentable セル画総細胞 LDH レベルと比較して乳酸脱水素酵素 (LDH)...

隔離の乳酸脱水素酵素試金-哺乳類細胞における一括 Autophagic 隔離活動を決定するシンプルで信頼性の高い方法

本稿は、化学剤のスクリーン ライブラリに阻害剤と T 細胞受容体のシグナル伝達に影響を与えるそれらのターゲットを識別するためフロー ベース フローサイトメトリー分析を使用します。ここで説明する方法は、ハイスループットス...

T 細胞受容体を介してライブラリ化学阻害剤のスクリーニングのメディエーターの同定

キナーゼ阻害剤のスクリーニングのための自己組み立てヒトタンパク質マイクロアレイの生成のための詳細なプロトコルが提示される。...

自己組み立てヒトタンパク質マイクロアレイにおけるキナーゼ阻害剤スクリーニング

本研究では、単純ヘルペスウイルス1型(HSV-1)に感染した単球由来樹状細胞におけるオートファジーフラックスを妨害する阻害剤およびsiRNAベースの戦略を提示する。...

単純ヘルペスウイルス1型にオートファジーを調節するsiRNAエレクトロポレーション 1-感染単球由来樹状細胞

このプロトコルの目的は、LC3免疫蛍光およびLC3ドット定量を通じて、膵臓癌および膵臓腺房細胞のオートファジーレベルを決定することです。...

LC3免疫蛍光を用いた2つの異なる膵臓細胞モデルにおけるオートファジーレベルの評価(英語)

学ぶATG4システインプロテアーゼ阻害剤の細胞ベース薬物スクリーニング法。ルシフェラーゼアッセイとハイスループット技術を用いて、がんや神経変性疾患の新規治療薬候補を探索する基礎研究手法です。

オートファジー関連4Bシステインペプチダーゼ阻害剤の細胞ベースの薬物スクリーニング

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