Name: GMPグレードの溶解性多孔質マイクロキャリアに基づく大規模セル生産 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: 学ぶGMPグレードの溶解性多孔質マイクロキャリアを用いた大規模接着細胞培養法。人間間葉系幹細胞、HEK293T細胞、Vero細胞の培養を自動化された密閉システムで検証し、細胞・遺伝子治療産業の品質基準に適合する効率的な製造プロトコルを確立する。

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この研究は、National Science Foundation for Distinguished Young Scholars(82125018)の財政的支援を受けました。

溶解性マイクロキャリアに基づく接着細胞の閉鎖系作製

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<li>Hewitt, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+human+mesenchymal+stem+cells+on+microcarriers%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Letters%22%5BJournal%5D)">Expansion of human mesenchymal stem cells on microcarriers.</a> Biotechnology Letters. 33 (11), 2325-2335 (2011).</li>
<li>Mawji, I., Roberts, E. L., Dang, T., Abraham, B., Kallos, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+and+opportunities+in+downstream+separation+processes+for+mesenchymal+stromal+cells+cultured+in+microcarrier-based+stirred+suspension+bioreactors%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Challenges and opportunities in downstream separation processes for mesenchymal stromal cells cultured in microcarrier-based stirred suspension bioreactors.</a> Biotechnology and Bioengineering. 119 (11), 3062-3078 (2022).</li>
<li>Schirmaier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale-up+of+adipose+tissue-derived+mesenchymal+stem+cell+production+in+stirred+single-use+bioreactors+under+low-serum+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Engineering+in+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Scale-up of adipose tissue-derived mesenchymal stem cell production in stirred single-use bioreactors under low-serum conditions.</a> Engineering in Life Sciences. 14 (3), 292-303 (2014).</li>
<li>Lawson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Process+development+for+expansion+of+human+mesenchymal+stromal+cells+in+a+50L+single-use+stirred+tank+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Engineering+Journal%22%5BJournal%5D)">Process development for expansion of human mesenchymal stromal cells in a 50L single-use stirred tank bioreactor.</a> Biochemical Engineering Journal. 120, 49-62 (2017).</li>
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<li>Fang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+scalable+vaccinia+virus-based+vector+production+process+using+dissolvable+porous+microcarriers%5BTitle%5D)+AND+%2225th+Annual+Meeting+of+the+American+Society+of+Gene+%26+Cell+Therapy.+Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Development of scalable vaccinia virus-based vector production process using dissolvable porous microcarriers.</a> 25th Annual Meeting of the American Society of Gene & Cell Therapy. Molecular Therapy. 30, 195-196 (2022).</li>
</ol>

Y.D.は科学顧問であり、H.X.、Y.Z.、L.G.、M.L.、Y.Y.、W.L.、およびX.Y.はBeijing CytoNiche Biotechnology Co. Ltd.の従業員です。他の著者は、この記事に記載されている製品または会社に商業的、独占的、または金銭的な利害関係を持っていません。他のすべての著者は、競合する利害関係がないことを宣言します。

免疫療法と幹細胞療法はどちらも、生細胞を薬剤として利用します。ただし、それらの最終生成物は、低分子やウイルスと同じ方法で精製または滅菌されるべきではありません。したがって、Quality by Design(QbD)の原則を常に念頭に置き、セル製造中の化学品製造および制御(CMC)プロセスに実際に適用する必要があります23。完全閉鎖細胞培養システム、ならびに処理システムおよび充填システムは、要件を満たすために優先的に検討される。本研究では、GMPグレードの溶解性多孔質3Dマイクロキャリアに基づくACISCPプラットフォームを利用して、hMSCの2層増殖を行うためのプロトコルを提示しました。一部の研究者は、バイオリアクターとマイクロキャリアを併用して in vitro で hMSC を増殖させることの実現可能性を探っていますが、報告された研究の大部分は、スケールの増加により、hMSC 収量が 100 mL の作業量で 6.1 x 105 cells/mL または 12.5 x 105 cells/mL から 2 L の作業量<su...

CGT業界は、過去20年間で指数関数的な拡大を目の当たりにしてきました。次世代医薬品の進化により、多くの難治性疾患の治療・治癒が期待されています1。2017年に食品医薬品局(FDA)がCGT製品「キムリア」を初めて承認して以来、世界のCGT関連の研究開発は急速に成長を続けており、FDAはCGTの積極的な治験薬申請が2018年に500件に増加したことを確認しています2。2030年までに米国でのCGT製品の承認数は54〜74件になると予測されていました2。
CGTの研究とイノベーションの急速な成長は喜ばしいことですが、これらの有望な医薬品を手頃な価格で必要なだけ多くの患者に届けることができるラボ研究と工業規模の製造の間には、まだ大きな技術的ギャップがあります。これらの臨床試験に採用されている現在のプロセスは、小規模な実験のために実験室で確立されたものであり、CGT製造の改善と革新には多大な努力が必要です3。CGT製品には多くの種類があり、そのほとんどは生細胞に基づいており、同種、自家、人工、または天然のものがあります。これらの生きた医薬品は、低分子の実体や生物学的製剤よりもはるかに複雑であるため、大規模な製造は大きな課題となっています4,5,6。本研究では、CGTに広く適用されている3つの足場依存性細胞の大規模細胞産生プロトコルを実証する。これらには、細胞ベースの治療に使用されているヒト間葉系幹細胞/間質細胞(hMSC)や、最終的な治療用細胞製品の遺伝子操作のためのウイルスの産生に使用されるHEK293T細胞およびVero細胞が含まれます。足場依存性細胞は、通常、手作業による処理を必要とする平面系で培養されます。しかし、手作業による培養法は多大な労力を必要とし、汚染されやすく、最終製品の品質を損なう可能性があります。さらに、インラインプロセス制御がないため、バッチ間の品質に大きなばらつきが生じます7。幹細胞治療を例にとると、200を超える幹細胞治療候補の有望なパイプラインがあり、臨床応用の需要を満たすためには、年間300兆個のhMSCが必要になると推定されています8。したがって、治療用細胞の大規模製造は、このような高い細胞需要でこれらの治療的介入を実施するための前提条件となっています9。
平面システムの挫折を防ぐために、従来の非溶解性マイクロキャリアを備えた攪拌タンクバイオリアクターでの大規模な製造プロセスの開発が努力されてきました10,11,12,13が、これらは複雑な調製手順と低い細胞回収効率に悩まされています14.最近、我々は幹細胞増殖のための溶解性マイクロキャリアを革新し、従来の非溶解性商用マイクロキャリアからの細胞採取の課題を回避することを目指している15。この新規で市販されているGMPグレードの3D溶解性多孔質マイクロキャリアである3D TableTrixは、大規模な細胞生産に大きな可能性を示しています。実際、これらの多孔質マイクロキャリアに基づく3D培養は、細胞の接着、増殖、遊走、および活性化を促進するために、好ましい生体模倣微小環境を再現する可能性があります16。マイクロキャリアの多孔質構造と相互接続された細孔ネットワークは、より大きな細胞接着領域を作り出し、酸素、栄養素、および代謝産物の交換を促進し、したがって、in vitro細胞増殖のための最適な基質を作り出すことができる17。これらのGMPグレードの3D溶解性多孔質マイクロキャリアの高い多孔性は、hMSCの大規模な増殖を可能にし、細胞を完全に溶解する能力により、これらの増殖した細胞の効率的な収穫を可能にする18。また、GMPグレードの製品であり、中国医薬品評価センター(出願番号:F20210000003およびF20200000496)19および米国FDA(FDA、USA;ドラッグマスターファイル番号:35481)20。
本稿では、hMSC、HEK293T細胞、およびVero細胞増殖のために、これらの分散性および溶解性多孔性マイクロキャリアを用いた自動閉鎖型工業スケール細胞生産(ACISCP)システム18を例示する。5 L バイオリアクターから 15 L バイオリアクターへの hMSC の 2 層拡張 (9 日間で 128 倍の累積増殖) に成功し、最終的に 1 つのバッチの生産から最大 1.1 x 1010 hMSC を取得しました。細胞は、マイクロキャリアを完全に溶解して回収し、濃縮、洗浄し、連続フロー遠心分離機ベースの細胞処理システムで調製した後、細胞充填システムで分注しました。さらに、hMSC製品の品質を評価し、適合性を確認しました。また、CGT産業で広く適用されている他の2種類の足場細胞、HEK293T細胞とVero細胞のスケールアップ生産へのこれらの溶解性マイクロキャリアの応用を実証しました。HEK293T細胞のピーク細胞密度は1.68 x 10 7 cells/mLに達し、Vero細胞のピーク密度は1.08 x 107 cells/mLに達しました。ACISCPシステムは、様々な接着細胞の培養に応用でき、CGTの工業化促進に寄与する強力なプラットフォームとなる可能性があります。

<table><tbody><tr><td>0.25%トリプシンEDTA</td><td>BasalMedia</td><td>S310JV</td><td>2D細胞の収穫に使用されます。</td></tr><tr><td>3D FloTrix Digest</td><td>CytoNiche Biotech</td><td>R001-500</td><td>3D TableTrixマイクロキャリアを特異的に溶解する試薬です。</td></tr><tr><td>3D FloTrix MSC 無血清培地</td><td>CytoNiche Biotech</td><td>RMZ112</td><td>これは、2D平面培養における間葉系幹細胞の増殖と維持、および3D TableTrixマイクロキャリアでの3D培養のための無血清、動物不使用の培地です。</td></tr><tr><td>3D FloTrix シングルユースろ過モジュール</td><td>CytoNiche Biotech</td><td>R020-00-10</td><td>このモジュールには 0.22 &mu;培地と消化液のろ過に使用されるMカプセルフィルター。</td></tr><tr><td>3D FloTrix シングルユース保存袋 (10 L)</td><td>CytoNiche Biotech</td><td>R020-00-03</td><td>5 Lバイオリアクターのフィードバッグとして使用されます。</td></tr><tr><td>3D FloTrix 使い捨て保存袋 (3 L)</td><td>CytoNiche Biotech</td><td>R020-00-01</td><td>細胞播種または転写袋として使用されます。</td></tr><tr><td>3D FloTrix シングルユース保存袋 (50 L)</td><td>CytoNiche Biotech</td><td>R020-00-04</td><td>15 Lバイオリアクターのフィードバッグとして使用されます。</td></tr><tr><td>3D FloTrix vivaPACK使い捨てフィル&フィニッシュ消耗品キット</td><td>CytoNiche Biotech</td><td>PACK-01-01</td><td>3D vivaPACKの充填・仕上げシステムに対応したスタンダードキットです。</td></tr><tr><td>細胞用3D FloTrix vivaPACK充填・仕上げシステム</td><td>CytoNiche Biotech</td><td>vivaPACK</td><td>このシステムは、自動混合およびガス排出機能を備えたクローズドリキッドハンドリング装置です。凍結保存バッファーに再懸濁した細胞は、バッチあたり20袋に迅速かつ均一に分注できます。</td></tr><tr><td>3D FloTrix vivaPREP PLUS 細胞プロセッシングシステム</td><td>CytoNiche Biotech</td><td>vivaPREP PLUS</td><td>このシステムは、連続フロー遠心分離機ベースのデバイスです。細胞は、完全に閉鎖された手順で濃縮、洗浄、および再懸濁することができます。</td></tr><tr><td>3D FloTrix vivaPREP PLUS ディスポーザブルセルプロセッシングキット</td><td>CytoNiche Biotech</td><td>PREP-PLUS-00</td><td>3D vivaPREP PLUS細胞プロセッシングに対応したスタンダードキットです。</td></tr><tr><td>3D FloTrix vivaSPIN&nbsp; バイオリアクター 15 L</td><td>CytoNiche Biotech</td><td>FTVS15</td><td>このバイオリアクター製品は、コントローラー、15 Lガラス攪拌タンク容器、および査定を採用しています。専用の灌流チューブをご用意しております。</td></tr><tr><td>3D FloTrix vivaSPIN&nbsp; バイオリアクター 5 L</td><td>CytoNiche Biotech</td><td>FTVS05</td><td>このバイオリアクター製品は、コントローラー、5 Lガラス攪拌タンク容器、および査定を採用しています。専用の灌流チューブをご用意しております。</td></tr><tr><td>3D FloTrix vivaSPIN クローズドシステム消耗品パック (10/15 L)</td><td>CytoNiche Biotech</td><td>R020-10-10</td><td>これは、3D vivaSPIN バイオリアクター 15 L に適合した標準チューブキットで、サンプリングバッグが含まれています。</td></tr><tr><td>3D FloTrix vivaSPIN クローズドシステム消耗品パック (2/5 L)</td><td>CytoNiche Biotech</td><td>R020-05-10</td><td>3D vivaSPIN バイオリアクター 5 L に適合した標準チューブキットで、サンプリングバッグが含まれています。</td></tr><tr><td>3D TableTrixマイクロキャリア G02</td><td>CytoNiche Biotech</td><td>G02-10-10g</td><td>これらの多孔質で分解性のマイクロキャリアは、HEK293T細胞培養に適しています。それらは、バイオリアクターのチューブに溶接するためのC-Flexチューブを使用して10g /ボトルで事前に滅菌されています。</td></tr><tr><td>3D TableTrix マイクロキャリア V01</td><td>CytoNiche Biotech</td><td>V01-100-10g</td><td>これらの多孔質で分解性のマイクロキャリアは、接着細胞培養に適しており、使用前にPBSでオートクレーブ滅菌する必要がある非滅菌マイクロキャリアとして提供されます。特にワクチン製造に適しています。</td></tr><tr><td>3D TableTrix microcarriers W01</td><td>CytoNiche Biotech</td><td>W01-10-10g (使い捨てパッケージ); W01-200 (錠剤)</td><td>これらの多孔質で分解性のマイクロキャリアは、接着性細胞培養、特に最終製品として収穫する必要がある細胞に適しています。それらは、バイオリアクターのチューブに溶接するためのC-Flexチューブを使用して10g /ボトルで事前に滅菌されています。この製品は、CDEから医薬品賦形剤の2つの資格を取得しており、登録番号は[F20200000496;F20210000003]。また、FDAから医薬品賦形剤のDMF認定を受けており、登録番号は[DMF:35481]</td></tr><tr><td>APC抗ヒトCD45</td>抗体<td>BioLegend</td><td>368512</td><td>MSC同一性評価のためのフローサイトメトリーで使用</td></tr><tr><td>Calcein-AM/PIダブル染色キット</td><td>同人堂</td><td>C542</td><td>Calcein-AM/PIダブル染色キットは、生細胞と死細胞の同時蛍光染色に利用されています。このキットには、生細胞と死細胞をそれぞれ染色するCalcein-AM溶液とヨウ化プロピジウム(PI)溶液が含まれています。</td></tr><tr><td>NALGENEコンテナ用EZトップコンテナキャップ(500mL)</td><td>サンゴバン</td><td>CAP-38</td><td>ブランドやカタログ番号は、例えば、類似の商品が様々なサプライヤーから入手可能であり、同じ機能を持つ限り、他のブランドで代用することができます。</td></tr><tr><td>C-Flexチューブ、フォーミュレーション374(0.25 in x 0.44 in)</td><td>サンゴバン</td><td>374-250-3</td>チューブ<td>の溶接と切断に使用されます。</td></tr><tr><td>CryoMACS 冷凍バッグ 50</td><td>Miltenyi Biotec&nbsp;</td><td>200-074-400</td><td>3D FloTrix vivaPACK使い捨て充填物の拡張に使用消耗品キットを完成させます。</td></tr><tr><td>硫酸ジメチル(DMSO)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D2650-100mL</td><td>凍結保存液の調製に使用します。</td></tr><tr><td>ダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)</td><td>BasalMedia</td><td>L120KJ</td><td>HEK293T細胞とベロ細胞の培養に使用されます。</td></tr><tr><td>DURAN Original GL 45 ラボ用ボトル (2 L)</td><td>DWK life sciences</td><td>218016357</td><td>5Lバイオリアクターからの廃棄物収集に使用されます。</td></tr><tr><td>DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (5 L)</td><td>DWK life sciences</td><td>218017353</td><td>15Lバイオリアクターからの廃棄物収集に使用されます。</td></tr><tr><td>DURAN Original GL 45 ラボ用ボトル (500 mL)</td><td>DWK ライフサイエンス</td><td>218014459</td><td>0.1 M NaOHの補助ボトルに使用されます。</td></tr><tr><td>NALGENEコンテナ用EZトップコンテナクロージャー(500mL)</td><td>サンゴバン</td><td>EZ500 ML-38-2</td><td>ブランドとカタログ番号は、例えば、類似の製品がさまざまなサプライヤーから入手可能であり、同じ機能を備えている限り、他のブランドで代替することができます。</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清(FBS)高品質</td><td>Wisent</td><td>086-150</td><td>HEK293T細胞の培養に使用されます。</td></tr><tr><td>FITC 抗ヒト CD14 抗体</td><td>BioLegend</td><td>301804</td><td>フローサイトメトリーの MSC 同定評価に使用されます。</td></tr><tr><td>FITC抗ヒトCD34抗体</td><td>BioLegend</td><td>343504</td><td>フローサイトメトリーのMSC同一性評価に使用されます。</td></tr><tr><td>FITC抗ヒトCD90(Thy1)抗体</td><td>BioLegend</td><td>328108</td><td>MSC同一性評価のためのフローサイトメトリーで使用されます。</td></tr><tr><td>フローサイトメトリー</td><td>ベックマン・コールター</td><td>CytoFLEX</td><td>細胞同一性評価に使用されます。</td></tr><tr><td>蛍光セルアナライザー</td><td>Alit ライフサイエンス</td><td>Countstar Rigel S2</td><td>細胞計数に使用されます。細胞生存率は、AO/PI色素で染色することで計算できます。</td></tr><tr><td>GL 45 マルチポートコネクタ スクリューキャップ (2ポート付き) &nbsp;</td><td>DWKライフサイエンス292632806</td><td></td><td>ブランドとカタログ番号は、たとえば、同様の製品がさまざまなサプライヤーから入手可能であり、同じ機能を備えている限り、アイテムは他のブランドで代用される可能性があります。</td></tr><tr><td>グルコースメーター</td><td>Sinocare</td><td>6243578</td><td>細胞培養培地および上清中のグルコース濃度を検出するために使用されます。</td></tr><tr><td>ハンクスバランスソルトソリューション(HBSS)、カルシウムとマグネシウム</td>入り <td>ギブコ</td><td>14025092</td><td>消化液の調製に使用されます。</td></tr><tr><td>ヒトアルブミン 20% ベーリング (HSA)</td><td>CSL ベーリング</td><td>N/A</td><td>洗浄緩衝液の調製に使用されます。</td></tr><tr><td>倒立型蛍光顕微鏡</td><td>OLYMBUS</td><td>CKX53SF</td><td>brifgtフィールドや蛍光観察、イメージングに使用。</td></tr><tr><td>Nalgene 測定シリンダー (500 mL)</td><td>Thermo Scientific</td><td>3662-0500PK</td><td>ペリスタルティックポンプの液体処理体積速度の校正に使用されます。</td></tr><tr><td>新生仔牛血清(NBS)スーパーファイン</td><td>MINHAI BIO</td><td>SC101.02</td><td>ベロ細胞の培養に使用。</td></tr><tr><td>OriCellヒト間葉系幹細胞脂肪分化および特性評価キット</td><td>サイヤジェン</td><td>HUXUC-90031</td><td>hUCMSCの三系統分化に使用されます。</td></tr><tr><td>OriCellヒト間葉系幹細胞軟骨分化および特性評価キット</td><td>サイヤジェン</td><td>HUXUC-90041</td><td>hUCMSCの三系統分化に使用されます。</td></tr><tr><td>OriCellヒト間葉系幹細胞骨形成分化および特性評価キット</td><td>サイヤジェン</td><td>HUXUC-90021</td><td>hUCMSCの三系統分化に使用されます。</td></tr><tr><td>PE抗ヒトCD105抗体</td><td>BioLegend</td><td>800504</td><td>MSCの同一性評価のためのフローサイトメトリーで使用されます。</td></tr><tr><td>PE抗ヒトCD19抗体</td><td>BioLegend</td><td>302208</td><td>フローサイトメトリーでMSCの同一性評価に使用されます。</td></tr><tr><td>PE抗ヒトCD73(Ecto-5'-ヌクレオチダーゼ)抗体</td><td>BioLegend</td><td>344004</td><td>MSC同一性評価のためのフローサイトメトリーで使用されます。</td></tr><tr><td>PE抗ヒトHLA-DR抗体</td><td>BioLegend</td><td>307605</td><td>MSCの同一性評価のためのフローサイトメトリーで使用されます。</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水(PBS)</td><td>Wisent</td><td>311-010-CL</td><td>ガラス容器とV01マイクロキャリアのオートクレーブ、および培地の交換に使用されます。</td></tr><tr><td>Sani-Tech Platinum Cured Sanitary Silicone Tubing (0.13 in x 0.25 in)</td><td>Saint-Gobain</td><td>ULTRA-C-125-2F</td> チューブチューブ (<td>チューブポンプによる溶液移送用)</td></tr><tr><td>滅菌生理食塩水</td><td>Hopebiol</td><td>HBPP008-500</td><td>洗浄緩衝液の調製に使用されます。</td></tr><tr><td>トリプザイム組換えトリプシン</td><td>BasalMedia</td><td>S342JV</td><td>この試薬は、HEK293T細胞およびベロ細胞のビーズ間転写に使用されます。</td></tr><tr><td>チューブシーラー</td><td>Yingqi Biotech</td><td>Tube Sealer I</td><td>このシーラーは、C-FlexチューブとPVCチューブの両方に対応しています。</td></tr><tr><td>PVCチューブ用チューブ溶接機</td><td>Chu Biotech</td><td>チューブ溶接機マイクロI</td><td>PVCチューブの溶接に使用されます。</td></tr><tr><td>TPEチューブ用チューブ溶接機</td><td>Yingqi Biotech</td><td>チューブ溶接機I-V2</td><td>TPEチューブの溶接に使用されます。</td></tr><tr><td>ViaStain AO / PI Viability Stains</td><td>Nexcelom</td><td>CS2-0106-25mL</td><td>アクリジンオレンジ(AO)とヨウ化プロピジウム(PI)を使用したデュアル蛍光生存率は、PBMCなどの初代細胞やデブリを含むサンプル中の幹細胞の正確な生存率分析に推奨される方法です。</td></tr></tbody></table>

gmpグレードの溶解性多孔質マイクロキャリアに基づく大規模セル生産

Large-Scale Cell Production Based on GMP-Grade Dissolvable Porous Microcarriers

細胞・遺伝子治療(CGT)業界の研究者は、細胞を効率的かつ大規模に増殖させるという手ごわい課題に長い間直面してきました。2次元(2D)平面培養システムの主な欠点に対処するために、ヒト間葉系幹細胞/間質細胞(hMSC)、HEK293T細胞、Vero細胞などの接着細胞の3D培養用に、GMPグレードの溶解性多孔質マイクロキャリアに基づく自動クローズド工業スケール細胞生産(ACISCP)プラットフォームを革新的に開発しました。大規模な拡張を達成するために、5 Lおよび15 Lの攪拌タンクバイオリアクターで2段階の拡張を行い、1.1 x 1010 hMSC を9日以内に全体で128倍に拡大しました。細胞は、マイクロキャリアを完全に溶解して回収し、濃縮、洗浄し、連続フロー遠心分離機ベースの細胞処理システムで調製した後、細胞充填システムで分注しました。2D平面培養と比較して、3D培養から採取したhMSCの品質に有意差はありません。また、これらの溶解性多孔質マイクロキャリアをCGT分野で人気のある他の細胞タイプにも適用しています。具体的には、HEK293T細胞とVero細胞をそれぞれ1.68 x 107 cells/mLおよび1.08 x 107 cells/mLのピーク細胞密度まで培養しました。本研究では、GMPグレードの溶解性マイクロキャリアと高度なクローズド機器の特性を利用して、接着細胞の工業規模の製造を実現するためのバイオプロセスエンジニアリングプラットフォームを使用するためのプロトコルを提供します。

ACISCPプラットフォームは、スケールアップ拡張のための一連の攪拌タンクバイオリアクター、自動細胞回収および製剤のための細胞処理システム、および細胞充填システムを採用した完全閉鎖システムです(図1)。接着細胞は多孔質マイクロキャリアに付着し、バイオリアクター内に分散させることで、接着細胞の懸濁培養を実現します。
記載のプロトコルに従い、2.5 x 108 hMSCと10 gのW01マイクロキャリアを最初に5 L攪拌タンクバイオリアクターで接種し、初期増殖を行いました。約 2.9 x 10 9 細胞を濃縮し、4 日目に細胞処理システムで洗浄し、そのうち 1.0 x 109 細胞を 40 g の W01 マイクロキャリアとともに 15 L 攪拌槽バイオリアクターに継代し、第 2 段階の培養を行いました。最終的に、1.1 x 10 10 MSCを採取し、調合し、9日目に70個以上の製剤バッグに分注しました(<strong class="xf...

ここでは、GMPグレードの溶解性マイクロキャリアに基づく完全クローズドシステムによる接着細胞の大規模製造を実現するためのプロトコルを紹介します。ヒト間葉系幹細胞、HEK293T細胞、およびVero細胞の培養は検証され、細胞および遺伝子治療業界の量的要求と品質基準の両方を満たしました。

GMPグレードの溶解性多孔質マイクロキャリアに基づく大規模セル生産

Researchers in the cell and gene therapy (CGT) industry have long faced a formidable challenge in the efficient and large-scale expansion of cells. To ...

細胞・遺伝子治療業界は、過去20年間で急激な拡大を遂げてきました。しかし、ラボでの研究と産業技術の製造の間には、大きな技術的ギャップが存在します。規制政策に準拠し、CGT業界のグリーン需要を満たすために、細胞治療薬を製造するために自動化されたクローズドシステムが採用されています。接着細胞の場合、スケーラブルな攪拌タンクバイオリアクターでマイクロキャリアを使用して培養することが有望な方法です。従来、製品化されたマイクロキャリアは望ましくない。トリプシン処理による細胞回収や、サイズによるマイクロキャリアの節約は、非効率的で困難であるだけでなく、細胞の品質に影響を与え、安全性の懸念を引き起こします。本研究では、GMPグレードの3D TableTrix溶解性マイクロキャリアを自動閉鎖系で大規模に生産することに成功しました。110億個以上のヒト間葉系幹細胞が、9日以内に2段階拡大して産出されました。また、HEK293T細胞とVero細胞の高密度培養を実証し、両方の密度が1,000万細胞/ミリリットル以上に達しました。この高度なバイオマニュファクチャリングプラットフォームにより、接着細胞を効果的に増殖させ、自動化された閉鎖的な方法で完全に回収することができます。当社のプロトコルは、CGT製品の工業規模の製造において、生産効率を高め、品質管理を改善する機会を提供します。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

細胞と粒子の慣性順序を持つ単分散ドロップ生成を組み合わせることで、我々は、kHzのレートで一滴の細胞または粒子の所望の数をカプセル化する方法を説明します。我々は、二回のシングルとダブルの粒子降下を順不同カプセルのものを超えて効率を示しています。...

ハイスループットマイクロカプセル化シングルセルと複数セル

組織特異的細胞外マトリックス（ECM）は、細胞機能の重要なメディエーターです。この記事では、in vitro細胞培養モデルにおけるまたはプロ再生bioscaffoldsなどの高度な3Dでのアプリケーションのための化学的架橋を必要とせずに培養液中で安定している純粋なECM由来フォーム及びマイクロキャリアを合成するための方法を説明します。...

組織特異的細胞培養および配信プラットフォームとして、細胞外マトリックス由来のフォームおよびマイクロキャリアの作製

多孔体 microcarriers のセル拡張プロトコル 310 マトリックスをシードする灌流型バイオリアクターにおける情報配信システムとしての利用を提案しています。我々 は、細胞の増殖と microcarriers...

組換えコラーゲン ペプチド Microcarriers 細胞伸長と細胞バイオリアクター配信システムとして潜在的な使用のためのモデルします。

ここでは、3Dバイオリアクターを用いて滑液間葉系幹細胞から多数のGMPグレードのエキソソームを作製するためのプロトコールを提示する。...

3次元バイオリアクター培養による滑液間葉系幹細胞由来エクソソームの大規模調製

ここでは、ヒドロゲルマイクロキャリアの構築を可能にするために、粘性慣性力を交互に駆動する穏やかな3D印刷技術を紹介します。自家製ノズルは柔軟性を提供し、異なる材料や直径を簡単に交換できます。直径50〜500μmの細胞結合マイクロ担体を取得し、さらなる培養のために回収することができる。...

交互の粘性慣性力噴射による インビトロ ヒドロゲルマイクロキャリアの3D印刷

本プロトコルは、単一エマルジョン製剤ベースの簡単なマイクロ流体技術を介したポリ(乳酸-co-グリコール酸)ベースの高開口多孔質ミクロスフェア(HOPM)の製造について説明しています。これらのミクロスフェアは、組織工学や薬物スクリーニングに応用できる可能性があります。...

マイクロ流体技術 による 高開放多孔質ミクロスフェア(HOTM)の作製

κ-カラギーナンサブマイクロゲル培地を用いた組織様構造の埋め込みバイオプリンティング

アンカーレッジ依存性細胞のマイクロキャリア・マイクロバイオリアクター生成に関するプロトコルが、細胞ベースの治療法として説明されています。急性呼吸困難症候群のユースケースを対象にした例、フラスコベースのプロセス条件に比べて細胞収量の比較および遺伝子発現が良好であることを示しています。このプロトコルは、他のアンカージュ依存細胞や標的適応症にも拡張可能です。...

急性呼吸困難症候群に備えたアンカー依存性間質細胞のマイクロバイオリアクター生成

本プロトコルは、キメラ抗原受容体(CAR)-T細胞およびサイトカイン誘導キラー(CIK)細胞を含む採用細胞療法(ACT)製品の拡張のためのスケーラブルな手法を、ガス透過性急速増殖(G-Rex)デバイスを用いたもので、臨床的に関連性の高い環境で効率的かつ堅牢な成長を示しています。...

GMPスケーラブルデバイスにおけるCAR-Tおよびサイトカイン誘導キラー細胞の効率的かつ迅速な生成

クモの糸の傑出した機械的および生化学的特性にもかかわらず、この材料は、従来の手段によって大量にで収穫されたすることはできません。ここで我々は次世代の生体材料としてクモの糸生産とその使用方法を勉強し調査官するための重要なプロセスである人工的なクモの糸繊維をスピンするための効率的なの戦略を、について説明します。...

実験室規模の合成クモの糸生産

学ぶGMPグレードの溶解性多孔質マイクロキャリアを用いた大規模接着細胞培養法。人間間葉系幹細胞、HEK293T細胞、Vero細胞の培養を自動化された密閉システムで検証し、細胞・遺伝子治療産業の品質基準に適合する効率的な製造プロトコルを確立する。

GMPグレードの溶解性多孔質マイクロキャリアに基づく大規模セル生産

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