Name: ヒト末梢リンパ球におけるγH2AXと53BP1の二重免疫蛍光法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 34 s
Description: 学ぶ二重免疫蛍光法によるγH2AXと53BP1の同時検出で、ブレオマシン処理ヒト末梢リンパ球のDNA二重鎖切断を評価する手法です。DNA損傷修復メカニズムの研究に応用可能です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

全血献血者と血液サンプルを採取したすべての医療従事者に感謝します。

研究はピサ大学の倫理委員会によって承認され、各ドナーから情報を得て署名された同意が得られました。
1. γH2AXおよび53BP1病巣の形成
<ol><li>サンプルの調製と変異原性治療<ol><li>抗凝固剤としてリチウムヘパリンを含む採血(例えば、Vacutainer)チューブ内の健康な成人から静脈穿刺によって全血サンプルを収集する。</li>
		<li>適切な血液サンプルの保存を保証するために、サンプリングから24時間以内に手順を開始してください。</li>
		<li>300 μLのサンプルを、4.7 mLの完全培地(0.5%ペニシリン-ストレプトマイシン、0.75%フィトヘマグルチニン、10%FBS以前に不活性化、88.75%RPMI 1640)を含むチューブに加えます。</li>
		<li>次に、硫酸ブレオマイシンを最終濃度5 μg/mLまで添加します。 注意:硫酸ブレオマイシンは変異原です。皮膚への接触や吸入を避けてください。溶液を調製し、フードの下にサンプルを追加します。</li>
		<li>各サンプルについて、ネガティブコントロール(変異原の非存在)を設定します。</li>
		<li>チューブを37°Cのサーモスタットに2時間入れます。</li>
	</ol></li>
	<li>固定<ol><li>サンプルを540 x g で室温で5分間遠心分離します。</li>
		<li>上清を吸引し、ペレットを渦で再懸濁します。</li>
		<li>5 mLの低張溶液(500 mLの脱イオン水に溶解した2.87 gのKCl)と400 μLの固定前溶液(5:3酢酸:メタノール)を加えて、赤血球の溶血を引き起こします。</li>
		<li>サンプルを540 x g で室温で5分間遠心分離します。</li>
		<li>上清を吸引し、ペレットを室温で5 mLのメタノールに少なくとも30分間再懸濁して細胞を固定します。</li>
		<li>あるいは、使用時まで細胞を-20°Cで保存してください。</li>
	</ol></li>
	<li>スライドの準備<ol><li>サンプルを540 x g で室温で5分間遠心分離します。</li>
		<li>上清を吸引し、ペレットを5 mLの3:1メタノール:酢酸溶液に再懸濁します。これらの手順をもう一度繰り返します。</li>
		<li>最後に、溶液を540 x g で室温で5分間遠心分離します。</li>
		<li>ペレットを再懸濁するのに十分な溶液(0.5 mL)を残して上清を再度吸引し、激しくピペットで移動し、再懸濁した細胞ペレットをスライドに落とし、風乾します。スライドは4°Cで保管してください。</li>
	</ol></li>
	<li>免疫蛍光 注:免疫蛍光法は、標的自体に結合する一次抗体と、標的を局在化させることを可能にする一次抗体に結合する蛍光二次抗体を使用して、特定の細胞標的を同定するための免疫学的方法です11。この場合、一次抗体としてマウスモノクローナル抗53BP1(1:50)およびウサギポリクローナル抗γH2AX(1:50)が使用され、二次抗体としてAlexaFluor568抗マウス(1:400)およびDyLight488抗ウサギ(1:200)がそれぞれ使用されます。<ol><li>スライドを50 mLの1x PBSでクープリンジャーで5分間2回洗浄します(スライド16枚を背中合わせに)。</li>
		<li>次に、ブロッキング溶液(10 mLのFBS、10 mLの10x PBS、80 mLの脱イオン水、300 μLのTriton-X)で30分間保持します。</li>
		<li>ブロッキング溶液に溶解した一次抗体を含む2つの溶液のそれぞれを各スライドに10 μL加えます。スライドをパラフィンテープで覆い、4°Cで一晩インキュベートします。</li>
		<li>インキュベーション後、1x PBSで5分間3回の洗浄を行います。</li>
		<li>ブロッキング溶液に溶解した二次抗体を含む2つの溶液のそれぞれを各スライドに10 μL加えます。スライドをパラフィンテープで覆い、室温で2時間インキュベートする。</li>
		<li>1x PBSで5分間3回洗浄します。</li>
		<li>アセンブリの前にカバーガラスにDAPIを含む退色防止溶液2.5 μLを加え、核を対比染色します。 注:病巣動態を評価するために、手順は1.1から1.4で説明したのと同じであり、細胞採取と二重免疫蛍光は、ブレオマイシン治療後2時間後、および変異原を除去した後、治療後4時間、6時間、および24時間で実行されます。</li>
	</ol></li>
</ol>2. 蛍光顕微鏡による分析
注:「蛍光顕微鏡」とは、蛍光を使用して画像を生成する顕微鏡を指します。試料は、蛍光色素によって吸収される特定の波長の光で照らされ、より長い波長の光を放出させます12。AlexaFluor568とDyLight 488は、それぞれ約568nmと488nmの光を吸収し、603nmと520nmの光を放出します。したがって、それらはそれぞれTRITCまたはFITCフィルターを使用して赤色または緑色の蛍光として可視されます。
<ol><li>100倍の浸漬対物レンズの下で各スライドの焦点の存在をスコアリングします(図1)。</li>
	<li>スライドごとに200個の核をスコアリングし、各核のγH2AX/53BP1病巣の数を数えます。</li>
	<li>スコアリングされた全核あたりの病巣の平均数の観点から結果を表現します。これらには、γH2AX/53BP1陽性(少なくとも1つの蛍光シグナルを示す)および陰性(蛍光シグナルを示さない)の両方の核が含まれる。</li>
</ol>

<ol><li>Chatterjee, N., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+DNA+damage%2C+repair+and+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+and+Molecular+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of DNA damage, repair and mutagenesis.</a> Environmental and Molecular Mutagenesis. 58 (5), 235-263 (2017).</li>
<li>Aleksandrov, R., Hristova, R., Stoynov, S., Gospodinov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chromatin+response+to+double-strand+DNA+breaks+and+their+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">The chromatin response to double-strand DNA breaks and their repair.</a> Cells. 9 (8), 1853(2020).</li>
<li>Jackson, S. P., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA-damage+response+in+human+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The DNA-damage response in human biology and disease.</a> Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).</li>
<li>Dickey, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2AX%3A+functional+roles+and+potential+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">H2AX: functional roles and potential applications.</a> Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).</li>
<li>Her, J., Bunting, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+cells+ensure+correct+repair+of+DNA+double-strand+break%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%2C+Thematic+Minireview%22%5BJournal%5D)">How cells ensure correct repair of DNA double-strand break.</a> Journal of Biological Chemistry, Thematic Minireview. 293 (27), 10502-10511 (2018).</li>
<li>Kuo, L. K., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B3-H2AX+-+A+novel+biomarker+for+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vivo%22%5BJournal%5D)">γ-H2AX - A novel biomarker for DNA double-strand breaks.</a> In Vivo. 22 (3), 305-310 (2008).</li>
<li>Bártová, E., Legartova, S., Dundr, M., Suchánková, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+of+the+53BP1+protein+in+genome+protection%3A+structural+and+functional+characteristics+of+53BP1-dependent+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Aging%22%5BJournal%5D)">A role of the 53BP1 protein in genome protection: structural and functional characteristics of 53BP1-dependent DNA repair.</a> Aging. 11 (8), 2488-2511 (2019).</li>
<li>Popp, H. D., Brendel, S., Hofman, W., Fabarius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+microscopy+of+%CE%B3H2AX+and+53BP1+for+analyzing+the+formation+and+repair+of+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence microscopy of γH2AX and 53BP1 for analyzing the formation and repair of DNA double-strand breaks.</a> Journal of Visualized Experiments. (129), 56617(2017).</li>
<li>Jezkova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particles+with+similar+LET+values+generate+DNA+breaks+of+different+complexity+and+reparability%3A+a+high-resolution+microscopy+analysis+of+%CE%B3H2AX%2F53BP1+foci%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Particles with similar LET values generate DNA breaks of different complexity and reparability: a high-resolution microscopy analysis of γH2AX/53BP1 foci.</a> Nanoscale. 10, 1162-1179 (2018).</li>
<li>Scarpato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+nuclear+phosphorylation+%28%CE%B3-H2AX%29+in+human+lymphocytes+treated+in+vitro+with+UVB%2C+bleomycin+and+mitomycin+C%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Kinetics of nuclear phosphorylation (γ-H2AX) in human lymphocytes treated in vitro with UVB, bleomycin and mitomycin C.</a> Mutagenesis. 28 (4), 465-473 (2013).</li>
<li>Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+performing+immunofluorescence+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An introduction to performing immunofluorescence staining.</a> Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2019).</li>
<li>Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSanderson%2C+MJ+%22Fluorescence+microscopy%22">Fluorescence microscopy</a>. 10, Cold Spring Harbor Protocol. (2014).</li>
<li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+fixatives+for+immunostaining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell fixatives for immunostaining.</a> Methods in Molecular Biology. , 55-61 (2010).</li>
<li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeabilization+of+the+cell+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Permeabilization of the cell membrane.</a> Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).</li>
<li>Hecht, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bleomycin%3A+New+perspectives+on+the+mechanism+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Natural+Products%22%5BJournal%5D)">Bleomycin: New perspectives on the mechanism of action.</a> Journal of Natural Products. 63, 158-168 (2000).</li>
<li>Fei, P., El-Deiry, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P53+and+radiation+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">P53 and radiation responses.</a> Oncogene. 22, 5774-5783 (2003).</li>
<li>Mahaney, B. L., Meek, K., Lees-Miller, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+ionizing+radiation-induced+DNA+double-strand+breaks+by+non-homologous+end-joining%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Repair of ionizing radiation-induced DNA double-strand breaks by non-homologous end-joining.</a> Biochemical Journal. 417 (3), 639-650 (2009).</li>
<li>Palla, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma-H2AX%3A+Can+it+be+established+as+a+classical+cancer+prognostic+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Tumor+Biology%22%5BJournal%5D)">Gamma-H2AX: Can it be established as a classical cancer prognostic factor.</a> Tumor Biology. 39 (3), 1010428317695931(2017).</li>
<li>Markovà, E., Hillert, L., Malmgren, L., Persson, B. R. R., Belyaev, I. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microwaves+from+GSM+mobile+telephones+affect+53BP1+and+gamma-H2AX+foci+in+human+lymphocytes+from+hypersensitive+and+healthy+persons%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Health+Perspectives%22%5BJournal%5D)">Microwaves from GSM mobile telephones affect 53BP1 and gamma-H2AX foci in human lymphocytes from hypersensitive and healthy persons.</a> Environmental Health Perspectives. 113 (9), 1172-1177 (2005).</li>
<li>Scarpato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+damage+in+peripheral+lymphocytes+of+obese+and+overweight+Italian+children+as+evaluated+by+the+%CE%B3-H2AX+focus+assay+and+micronucleus+test%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Nuclear damage in peripheral lymphocytes of obese and overweight Italian children as evaluated by the γ-H2AX focus assay and micronucleus test.</a> The FASEB Journal. 25 (2), 685-693 (2018).</li>
<li>Shanbhag, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+neuronal+accumulation+of+DNA+double-strand+breaks+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communication%22%5BJournal%5D)">Early neuronal accumulation of DNA double-strand breaks in Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathologica Communication. 7 (1), 77(2019).</li>
<li>Lassmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+formation+of+gamma-H2AX+and+53BP1+DNA+repair+foci+in+blood+cells+after+radioiodine+therapy+of+differentiated+thyroid+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">In vivo formation of gamma-H2AX and 53BP1 DNA repair foci in blood cells after radioiodine therapy of differentiated thyroid cancer.</a> Journal of Nuclear Medicine. 51 (8), 1318-1325 (2010).</li>
<li>Derlin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+%CE%B3-H2AX+and+53BP1+foci+in+peripheral+blood+lymphocytes+to+predict+subclinical+hematotoxicity+and+response+in+somatostatin+receptor-targeted+radionuclide+therapy+for+advanced+gastroenteropancreatic+neuroendocrine+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Assessment of γ-H2AX and 53BP1 foci in peripheral blood lymphocytes to predict subclinical hematotoxicity and response in somatostatin receptor-targeted radionuclide therapy for advanced gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors.</a> Cancers (Basel). 13 (7), 1516(2021).</li>
<li>Djuzenova, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiosensitivity+in+breast+cancer+assessed+by+the+histone+%CE%B3-H2AX+and+53BP1+foci%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+Oncology%22%5BJournal%5D)">Radiosensitivity in breast cancer assessed by the histone γ-H2AX and 53BP1 foci.</a> Radiation Oncology. 24, 8-98 (2013).</li>
<li>Atkinson, J., Bezak, E., Kempson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+DNA+double-strand+breaks+-+are+we+there+yet%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Imaging DNA double-strand breaks - are we there yet.</a> Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 23, 579-580 (2022).</li>
</ol>

著者は開示するものは何もありません。

γH2AXおよび53BP1病巣の免疫蛍光分析は、細胞系の間期核におけるゲノム損傷を評価するのに適した方法です。この手順には、実験の結果に影響を与える可能性のあるいくつかの重要なポイント、主に固定および透過処理に使用される薬剤、抗体の種類とその希釈因子、および変異原の濃度があります。
免疫蛍光法は、主にタンパク質である抗原を同定することが期待されているため、タンパク質の完全性の維持は基本です。このプロトコルでは、メタノールを使用してリンパ球を固定します。アルコールは水を置換して可溶性タンパク質の沈殿を引き起こすことによって作用し、一方、固定されていない他の細胞成分はPBS13などの生理食塩水緩衝溶液で洗浄することによって除去できるため、このステップは特に重要です。 
別の重要な通過は、ブロッキング溶液を介して行われる透過処理であり、この場合、透過処理とブロッキングの両方を可能にします。ブロッキングは、FBSを溶液に添加することによって実行されます:FBSと抗体の特異的ターゲットとの...

DNA損傷は、細胞の酸化的代謝によって生成されるROSなどの内因性、または化学物質と物理的の両方の外因性の薬剤によって継続的に誘発されます1。最も有害な病変の中で、二本鎖切断(DSB)は、染色体異常を引き起こし、それが発がんプロセスを開始する可能性があるため、ゲノム不安定性に寄与する上で基本的な役割を果たします。したがって、細胞はDSBを修復する複雑で効率的なメカニズムを備えている2。
DSBが発生すると、細胞はDNA損傷応答(DDR)をトリガーし、MRE11 / RAD50 / NBS1複合体とともに、ATMまたはATRキナーゼが動員され、細胞周期を遅くしたり停止したりする他のタンパク質を活性化します3。これらのキナーゼの必須標的はヒストンH2AXであり、これはDSBから数メガ塩基以内のSer-139上でリン酸化され(すなわちγH2AX)、それによってBRCA1およびp53結合タンパク質1(53BP1)3などのいくつかの修復因子の動員を可能にする。その後、相同組換え(HR)、非相同末端結合(NHEJ)、または一本鎖アニーリング(SSA)の間の1つの経路がトリガーされ、DSBが修復されます4,5。したがって、53BP1はHRまたはNHEJの選択を決定することに関与し、主にHR6ではなくNHEJの活性化を促進します。さらに、H2AXヒストンのリン酸化型と53BP1の両方がDSBの部位に病巣を形成する可能性があります。これらの病巣は二本鎖の完全性が回復するまで持続するため、時間間隔内のγH2AXまたは53BP1病巣の出現/消失を評価することは、細胞系におけるDSBの発生および修復を評価するための有用な方法と考えられる6,7。しかし、上記の分子プロセスによれば、γH2AXと53BP1病巣はDDR 8,9の間にDSBの近くで共局在することが予想されるので、二重免疫蛍光においてこれらのマーカーの存在を同時に検出することは有用であり得る。
したがって、この原稿の目的は、放射性模倣剤ブレオマイシンによってヒト末梢リンパ球に誘発されるゲノム損傷を評価するためのγH2AXと53BP1病巣の同時定量の適合性を評価することでした。同じ方法論を使用して、以前に設定された実験手順10に従って、ブレオマイシン誘発性DSBの修復速度論を描写することも試みました。

<table><tbody><tr><td>AlexaFluor 568ヤギ抗マウスIgG(&γ;1)</td><td>Invitrogen</td><td>A21124</td><td>53BP1二次抗体</td></tr><tr><td>Bleoprim</td><td>Sanofi</td><td></td><td>bleomycin sulfate (mutagen)</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン溶液 100X</td><td>Euroclone</td><td>ECB3001D</td><td>抗生物質</td></tr><tr><td>培地用 PBS 10X</td><td>Termofisher</td><td>14200075</td><td>リン酸緩衝生理食塩水</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Euroclone</td><td>EC20180L</td><td>Fetal Bovine Serum免疫蛍光法</td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギ IgG (H+L) DyLight 488 Coniugated</td><td>Termofisher</td><td>#35552</td><td>&gamma;H2AX 二次抗体</td></tr><tr><td>マウス 抗53BP1 モノクローナル抗体</td><td>メルク</td><td>MAB 3802</td><td>53BP1 一次抗体</td></tr><tr><td>Labophot 2</td><td>ニコン</td><td></td><td>蛍光顕微鏡</td></tr><tr><td>P-ヒストン H2AX (Ser139) ウサギ抗体</td><td>Cell Signaling</td><td>#2577</td><td>&gamma;H2AX 一次抗体</td></tr><tr><td>Phytohemoagglutinin</td><td>Termofisher</td> 培養<td>培地の</td><td>R30852801成分</td></tr><tr><td>Prolong gold antifade reagent with DAPI</td><td>Cell Signaling</td><td>#8961</td><td>Antifade solution with DAPI for counterstaining</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Euroclone</td><td>ECB9006L</td><td>Culture medium</td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td>Nonionic detergent for透過化</td></tr></tbody></table>

ヒト末梢リンパ球におけるγh2axと53bp1の二重免疫蛍光法

Dual Immunofluorescence of &#947;H2AX and 53BP1 in Human Peripheral Lymphocytes

二本鎖切断(DSB)は、細胞核に発生する可能性のある最も重篤な病変の1つであり、修復されない場合、癌を含む重篤な結果につながる可能性があります。したがって、細胞はDSBを修復するための複雑なメカニズムを備えており、これらの経路には、Ser-139(すなわちγH2AX)およびp53結合タンパク質1(53BP1)のリン酸化形態のヒストンH2AXが含まれます。両方のタンパク質はDSBの部位で病巣を形成する可能性があるため、これらのマーカーの同定は、DSBとその修復速度論の両方を研究するのに適した方法と考えられています。γH2AXと53BP1病巣の形成につながる分子プロセスによると、2つのDNA損傷マーカーを同時に検出することによってDSBを定量できる代替アプローチを設定するために、DSB付近でのそれらの共局在を調べることがより有用である可能性があります。したがって、このプロトコルは、二重免疫蛍光におけるγH2AXおよび53BP1病巣の存在を介して、放射線模倣剤ブレオマイシンによってヒトリンパ球に誘導されるゲノム損傷を評価することを目的としています。この方法論を用いて、ブレオマイシン誘発性DSBの修復動態を研究する予備的な試みとして、γH2AXと53BP1病巣の数の経時的な変化も明らかにしました。

末梢リンパ球の蛍光顕微鏡分析によって得られたデータは、3つの主要な側面を評価することを可能にします:その変異原性効果によるγH2AXおよび53BP1病巣(したがってDSB)の数の増加におけるブレオマイシン治療の有効性、DSBの部位で両方の病巣がどの程度共局在しているか、およびブレオマイシン誘発性DSBの修復動態を描写するためのγH2AXおよび53BP1病巣の時間経過。予想通り、未処理細胞と未処理細胞の間でγH2AXと53BP1病巣の両方の非常に高い頻度が観察され、ブレオマイシンが末梢リンパ球でDSBの形成を誘導することが確認されました(図2)。
2つのマーカーの病巣の数に大きな違いが観察されました。特に、γH2AX病巣は53BP1病巣よりも多く、共局在が常に起こるとは限らず、複数の要因に依存する可能性があることを示しています(図3)。
DSBの修復速度論に関しては、まず、病巣の実際の修復が最初に選択された時点...

このプロトコルは、ブレオマイシン処理されたヒト末梢リンパ球の間期核におけるγH2AXおよび53BP1病巣の同時検出を通じて、DNA二本鎖切断の形成および修復を評価する方法を提示する。

ヒト末梢リンパ球におけるγH2AXと53BP1の二重免疫蛍光法

Double strand breaks (DSBs) are one of the most severe lesions that can occur in cell nuclei, and, if not repaired, they can lead to severe outcomes, ...

この原稿の目的は、ブレオマイシンによってヒト末梢リンパ球に誘発されるゲノム損傷を評価するためのガンマH2AXと53BP1病巣の同時定量の適合性を評価することでした。いくつかの要因が二本鎖の断線を引き起こす可能性があります。したがって、細胞には、ガンマH2AXと53結合タンパク質1の両方を含むいくつかの修復メカニズムがあり、二本鎖切断の近くで共局在することができます。全血サンプルを収集した後、4.7ミリリットルの完全培地を含むチューブに300マイクロリットルのサンプルを追加します。次に、硫酸ブレオマイシンの最終濃度のミリリットルあたり5マイクログラムを追加します。サンプルごとに、ネガティブコントロールを設定します。チューブを摂氏37度のサーモスタットに2時間入れます。サンプルを540 Gで5分間遠心分離します。次に、5ミリリットルの低張溶液をペレットに加えます。次に溶血を引き起こすために400マイクロリットルの前固定液を加えます。サンプルを540 Gで5分間遠心分離し、ペレットを5ミリリットルのメタノールに室温で少なくとも30分間再懸濁して細胞を固定します。サンプルを540 Gで5分間遠心分離し、ペレットを5ミリリットルの固定液に再懸濁します。この手順をもう一度繰り返します。再び540Gで5分間遠心分離し、ペレットを再懸濁するのに十分な溶液を残して上清を吸引します。再懸濁した細胞ペレットをスライドに落とします。ブロッキング溶液に溶解した抗ガンマH2AXおよび抗53BP1一次抗体を含む2つの溶液を調製します。次に、スライドをPBS 1Xで2回洗浄します。次に、スライドをブロッキング溶液に30分間保持します。ブロッキング溶液に溶解した一次抗体を含む2つの溶液のそれぞれを各スライドに10マイクロリットル加えます。スライドをパラフィルムで覆います。摂氏4度で一晩インキュベートします。インキュベーション後、PBS 1Xで5分間3回洗浄を行います。ブロッキング溶液に溶解したDyLight 488およびAlexa Fluor 568二次抗体を含む2つの溶液を調製します。次に、ブロッキング溶液に溶解した二次抗体を含む2つの溶液のそれぞれ10マイクロリットルを各スライドに加えます。スライドをパラフィルムで覆い、室温で2時間インキュベートする。この2回目のインキュベーションの後、PBS 1Xで5分間3回の洗浄を行います。組み立て前にカバースリップにDAPIを含む2.5マイクロリットルの退色防止溶液を追加して、核をカウンターステインします。病巣動態を評価するために、手順は現在記載されているものと同じである。最後の段階は病巣の観察と定量化です。ガンマH2AXおよび53BP1病巣を持たないヒトリンパ球は、A、Bに示され、Cでは、異なる量のガンマH2AXおよび53BP1病巣を有するヒトリンパ球が示されている。低レベルの病巣共局在が観察される。予想通り、未処理の未処理細胞間では、ガンマH2AXおよび53BP1病巣の両方の非常に高い頻度が観察される。また、2つのマーカーの病巣の数にも大きな差が見られる。ガンマH2AXと53BP1病巣の経時変化は、同じ機能に寄与しているものの、異なる挙動を示した。ガンマH2AXおよび53BP1病巣分析は、曝露または病理学的状況のいずれかで細胞応答を評価する能力を有する。ただし、ガンマH2AXおよび53BP1二重免疫蛍光は、イベントの真の頻度を過小評価する可能性があります。

dual-immunofluorescence-h2ax-53bp1-human-peripheral

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

分子マーカーとしてγH2AX形成を用いてDNA二本鎖縞の定量化は、放射線生物学における非常に貴重なツールとなっています。ここでは、放射線に対する細胞の曝露後のγH2AX病巣の定量化のための免疫蛍光アッセイの使用方法を示しています。...

電離放射線への応答でγH2AX病巣の定量化

γH2AX巣に基づいてDNA二本鎖切断の定量は、組織の放射線感受性と放射線修正する化合物の作用の評価に、特に放射線の生物学では、非常に貴重なツールとなっています。ここでは、組織サンプルにおけるγH2AX病巣の定量のための免疫蛍光アッセイの使用方法を示しています。...

組織サンプルのγH2AX病巣の定量

DNA二本鎖切断に対する応答のSer -...

電離放射線は、次のγH2AXの空間分布の評価

このビデオでは、ヒト単核細胞のDNA二本鎖切断部位に局在する特定のDNA損傷応答タンパク質を検出する免疫蛍光顕微鏡法について説明します。タンパク質は特定の一次抗体によって認識され、その抗体は蛍光色素でタグ付けされた二次抗体に結合し、顕微鏡での可視化中に蛍光を発するため、タンパク質を細胞核内の明確な蛍光病巣として可視化することができます。...

DNA二本鎖切断の分析のための免疫蛍光顕微鏡

この原稿は、γH2AX、53BP1 の蛍光顕微鏡による DNA...

ΓH2AX、53BP1 形成と DNA 二重鎖切断の修復を分析するための蛍光顕微鏡観察

蛍光顕微鏡を用いた過渡的長期的な二本鎖 DNA 切断の DNA 修復プロセスの特性

ホウ素中性子捕捉療法(BNCT)に用いられる中性子混合ビームによる放射線誘発DNA損傷応答は完全には確立されていない。このプロトコルは、中性子混合ビームを照射した後のヒト大腸癌細胞株における免疫蛍光染色による修復タンパク質の放射線誘発病巣(RIF)を検出するためのステップバイステップの手順を提供する。...

ヒト大腸癌細胞におけるDNA損傷および修復病巣の免疫蛍光イメージング

DNA損傷の後、ヒト細胞はゲノムの完全性を回復するために不可欠な修復経路を活性化する。ここでは、DNA修復タンパク質を検出し、その空間的および時間的なリクルートメントを分析し、DNA損傷部位におけるタンパク質とタンパク質相互作用を問い合わせた手段として、間接的な免疫蛍光の方法を説明する。...

免疫蛍光によるDNA修復タンパク質相互作用の可視化

このプロトコルは、末梢血リンパ球に対するγ-H2AX病巣アッセイのスライド調製および自動スコアリングを提示する。アッセイの方法および感度を例示するために、単離リンパ球を インビトロで照射した。DNA...

ヒト末梢血リンパ球におけるγ-H2AX Fociアッセイの自動微視的スコアリング法

ここでは、DNA損傷部位でのタンパク質相互作用を検出するためのシンプルで迅速なプロトコールを紹介します。...

DNA損傷部位におけるタンパク質の局在化のための近接リガンドアッセイ

学ぶ二重免疫蛍光法によるγH2AXと53BP1の同時検出で、ブレオマシン処理ヒト末梢リンパ球のDNA二重鎖切断を評価する手法です。DNA損傷修復メカニズムの研究に応用可能です。

ヒト末梢リンパ球におけるγH2AXと53BP1の二重免疫蛍光法

さらに動画を探す