ヒト末梢リンパ球におけるγH2AXと53BP1の二重免疫蛍光法
2023年7月14日
このプロトコルは、ブレオマイシン処理されたヒト末梢リンパ球の間期核におけるγH2AXおよび53BP1病巣の同時検出を通じて、DNA二本鎖切断の形成および修復を評価する方法を提示する。
この原稿の目的は、ブレオマイシンによってヒト末梢リンパ球に誘発されるゲノム損傷を評価するためのガンマH2AXと53BP1病巣の同時定量の適合性を評価することでした。いくつかの要因が二本鎖の断線を引き起こす可能性があります。したがって、細胞には、ガンマH2AXと53結合タンパク質1の両方を含むいくつかの修復メカニズムがあり、二本鎖切断の近くで共局在することができます。
全血サンプルを収集した後、4.7ミリリットルの完全培地を含むチューブに300マイクロリットルのサンプルを追加します。次に、硫酸ブレオマイシンの最終濃度のミリリットルあたり5マイクログラムを追加します。サンプルごとに、ネガティブコントロールを設定します。
チューブを摂氏37度のサーモスタットに2時間入れます。サンプルを540 Gで5分間遠心分離します。次に、5ミリリットルの低張溶液をペレットに加えます。
次に溶血を引き起こすために400マイクロリットルの前固定液を加えます。サンプルを540 Gで5分間遠心分離し、ペレットを5ミリリットルのメタノールに室温で少なくとも30分間再懸濁して細胞を固定します。サンプルを540 Gで5分間遠心分離し、ペレットを5ミリリットルの固定液に再懸濁します。
この手順をもう一度繰り返します。再び540Gで5分間遠心分離し、ペレットを再懸濁するのに十分な溶液を残して上清を吸引します。再懸濁した細胞ペレットをスライドに落とします。
ブロッキング溶液に溶解した抗ガンマH2AXおよび抗53BP1一次抗体を含む2つの溶液を調製します。次に、スライドをPBS 1Xで2回洗浄します。次に、スライドをブロッキング溶液に30分間保持します。
ブロッキング溶液に溶解した一次抗体を含む2つの溶液のそれぞれを各スライドに10マイクロリットル加えます。スライドをパラフィルムで覆います。摂氏4度で一晩インキュベートします。
インキュベーション後、PBS 1Xで5分間3回洗浄を行います。ブロッキング溶液に溶解したDyLight 488およびAlexa Fluor 568二次抗体を含む2つの溶液を調製します。次に、ブロッキング溶液に溶解した二次抗体を含む2つの溶液のそれぞれ10マイクロリットルを各スライドに加えます。
スライドをパラフィルムで覆い、室温で2時間インキュベートする。この2回目のインキュベーションの後、PBS 1Xで5分間3回の洗浄を行います。組み立て前にカバースリップにDAPIを含む2.5マイクロリットルの退色防止溶液を追加して、核をカウンターステインします。
病巣動態を評価するために、手順は現在記載されているものと同じである。最後の段階は病巣の観察と定量化です。ガンマH2AXおよび53BP1病巣を持たないヒトリンパ球は、A、Bに示され、Cでは、異なる量のガンマH2AXおよび53BP1病巣を有するヒトリンパ球が示されている。
低レベルの病巣共局在が観察される。予想通り、未処理の未処理細胞間では、ガンマH2AXおよび53BP1病巣の両方の非常に高い頻度が観察される。また、2つのマーカーの病巣の数にも大きな差が見られる。
ガンマH2AXと53BP1病巣の経時変化は、同じ機能に寄与しているものの、異なる挙動を示した。ガンマH2AXおよび53BP1病巣分析は、曝露または病理学的状況のいずれかで細胞応答を評価する能力を有する。ただし、ガンマH2AXおよび53BP1二重免疫蛍光は、イベントの真の頻度を過小評価する可能性があります。
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概要
本プロトコールでは、ブレオマイシン処理したヒト末梢リンパ球の間期核において、γH2AXおよび53BP1フォーカスを同時に検出することにより、DNA二本鎖切断の形成と修復を評価する方法を提示します。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- ゲノミクス
背景
- 二本鎖切断は、さまざまな要因によって誘導されます。
- 細胞は、DNA損傷に対する複数の修復機構を備えています。
- γH2AXおよび53BP1は、DNA修復に関与する重要なタンパク質です。
- これらのタンパク質の共局在は、二本鎖切断の近傍で起こります。
研究目的
- γH2AXおよび53BP1フォーカスの同時定量の妥当性を評価すること。
- ヒト末梢リンパ球におけるゲノム損傷を評価すること。
- DNAの完全性に対するブレオマイシンの影響を理解すること。
使用された手法
- ヒト被験者から全血サンプルを採取する。
- サンプルに硫酸ブレオマイシンを処理する。
- 比較のために陰性対照を設定する。
- 間期核においてγH2AXおよび53BP1フォーカスの検出を行う。
主な結果
- γH2AXおよび53BP1フォーカスの同時検出が可能である。
- ブレオマイシン処理により、測定可能なDNA損傷が誘導される。
- フォーカスの定量値は、ゲノム損傷の程度と相関する。
- 結果は、DNA修復メカニズムを評価するための本手法の有用性を裏付けている。
結論
- このプロトコルは、DNA二本鎖切断の形成と修復を効果的に評価します。
- γH2AXと53BP1を同時に検出することで、貴重な知見が得られます。
- この手法は、DNA損傷および修復に関するさまざまな研究に適用可能です。
よくある質問
業界における重要性
ヒトリンパ球におけるDNA二本鎖切断（DSB）マーカーであるγH2AXおよび53BP1の定量的検出により、ゲノム損傷と修復キネティクスの正確な評価が可能になります。この二重免疫蛍光法を用いるアプローチは、候補化合物の早期遺伝毒性スクリーニングおよびメカニズムに基づくリスク低減における予測の信頼性を高めます。創薬段階でこれらの読み取り値を統合することは、リスク調整後のポートフォリオ決定およびトランスレーショナルな継続性をサポートします。
バイオ医薬品の研究開発における戦略的活用
初期探索およびターゲットバリデーション
- ヒト細胞におけるDNA損傷応答経路の直接的な解析を可能にします。
- DSB（二本鎖切断）の誘導と修復キネティクスを定量化することで、メカニズムに基づくリスク低減を支援します。
- ゲノム安定性に関与する標的の機能的なバリデーションを促進します。
- リード化合物の遺伝毒性リスクに対する予測の信頼性を向上させます。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- ヒト初代細胞におけるDNA損傷マーカーを定量化するための、検証済みシステムを提供します。
- 化合物によって誘導されるDSBについて、再現性のある定量的なリードアウトを可能にします。
- DNA損傷モジュレーターの高コンテンツスクリーニングにおけるアッセイの標準化をサポートします。
- 初期スクリーニングにおける化合物の安全性プロファイルの信頼性の高い評価を促進します。
翻訳・前臨床研究
- DNA損傷マーカーの定量化を、トランスレーショナルバイオマーカー戦略と整合させます。
- in vitroでの探索から前臨床安全性評価までの継続性をサポートします。
- 良好なDNA修復プロファイルを持つ候補物質のリスク調整済み推進を可能にします。
- 疾患および治療に関連する細胞応答について、機序的な洞察を提供します。
パイプラインおよびワークフローの統合
この二重免疫蛍光法は、初期探索から前臨床までの段階に位置づけられ、ヒトリンパ球におけるDNA損傷および修復の仮説に基づいた評価を可能にします。
- 探索生物学： DSBマーカーフォーカスを定量化し、DNA修復経路の関与を明確にするとともに、生物学的リスクを低減します。
- スクリーニング： 化合物の遺伝毒性プロファイリングにおいて、再現性のある定量的なアウトプットを提供します。
- 分析： 比較解析のために、γH2AXおよび53BP1フォーカスのタイムコース測定を提供します。
- トランスレーショナルリサーチ： in vitroでの知見を、DNA損傷応答の前臨床バイオマーカー戦略へと繋げます。
- 企業内での再利用： 探索プログラム全体で利用可能な、DNA損傷評価のための再利用可能なプラットフォームを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： DNA損傷評価における予測の信頼性を高め、メカニズム上の曖昧さを軽減する。
- 運用の価値： 再現性と拡張性を確保するため、DSBマーカーの定量を標準化する。
- 戦略的価値： 意思決定（go/no-go判断）に情報を提供し、遺伝毒性に関する後期の生物学的リスクを低減する。
- ポートフォリオへの影響： DNA修復プロファイルに基づいた、リスク調整後の候補物質の優先順位付けを可能にする。
実施上の検討事項
- 免疫蛍光顕微鏡法および定量的画像解析の専門知識が必要です。
- 検証済み抗体および蛍光イメージング設備の利用環境が必要です。
- サンプル調製および定量プロトコルのチーム間での標準化が求められます。
- 異なる細胞種やモデルシステムに合わせて適応させる必要がある場合があります。
- マーカーの共局在の限界により、実際のDSB頻度が過小評価される可能性があります。
