Name: イン・ビトロ 発生メカノバイオロジー研究のための胎児血管オンチップモデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: 学ぶ ヒトiPS細胞由来血管内皮細胞の分化と流体力学的刺激を用いた発生メカノバイオロジー研究法。従来培養では見落とされがちな機械的シグナルを解析し、血管生物学の理解を深める実験プロトコルを解説します。

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この研究は、欧州血液学会のResearch Advanced Grant 2021、American Society of HematologyのGlobal Research Award 2021、Welcome Trustとエジンバラ大学が資金提供するInternal Strategy Support Fund ISSF3の支援を受けました。フローサイトメトリー解析のサポートをしてくれたフローサイトメトリー施設のフィオナ・ロッシに感謝します。オープンアクセスの目的で、著者はクリエイティブ・コモンズ表示(CC BY)ライセンスを、この投稿から生じる著者が承認した原稿のバージョンに適用しています。

hiPSC由来内皮細胞の分化と機械的刺激

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<li>Adamo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomechanical+forces+promote+embryonic+haematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Biomechanical forces promote embryonic haematopoiesis.</a> Nature. 459 (7250), 1131-1135 (2009).</li>
<li>Diaz, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomechanical+forces+promote+blood+development+through+prostaglandin+E2+and+the+cAMP-PKA+signaling+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Biomechanical forces promote blood development through prostaglandin E2 and the cAMP-PKA signaling axis.</a> Journal of Experimental Medicine. 212 (5), 665-680 (2015).</li>
<li>North, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+development+is+dependent+on+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell development is dependent on blood flow.</a> Cell. 137 (4), 736-748 (2009).</li>
<li>Lundin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YAP+regulates+hematopoietic+stem+cell+formation+in+response+to+the+biomechanical+forces+of+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">YAP regulates hematopoietic stem cell formation in response to the biomechanical forces of blood flow.</a> Developmental Cell. 52 (4), 446.e5-460.e5 (2020).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mimicry+of+embryonic+circulation+enhances+the+hoxa+hemogenic+niche+and+human+blood+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Mimicry of embryonic circulation enhances the hoxa hemogenic niche and human blood development.</a> Cell Reports. 40 (11), 111339(2022).</li>
<li>Azzoni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+onset+of+circulation+triggers+a+metabolic+switch+required+for+endothelial+to+hematopoietic+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The onset of circulation triggers a metabolic switch required for endothelial to hematopoietic transition.</a> Cell Reports. 37 (11), 110103(2021).</li>
<li>Li, Y. S. J., Haga, J. H., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+the+effects+of+shear+stress+on+vascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of the effects of shear stress on vascular endothelial cells.</a> Journal of Biomechanics. 38 (10), 1949-1971 (2005).</li>
<li>Batsivari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+hematopoietic+stem+cell+development+through+functional+correlation+of+their+proliferative+status+with+the+intra-aortic+cluster+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Understanding hematopoietic stem cell development through functional correlation of their proliferative status with the intra-aortic cluster architecture.</a> Stem Cell Reports. 8 (6), 1549-1562 (2017).</li>
<li>Canu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+endothelial-to-haematopoietic+transition+at+the+single+cell+level+identifies+cell+cycle+regulation+as+a+driver+of+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of endothelial-to-haematopoietic transition at the single cell level identifies cell cycle regulation as a driver of differentiation.</a> Genome Biology. 21 (1), 157(2020).</li>
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<li>Yang, C. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+KLF1+enhances+the+differentiation+and+maturation+of+red+blood+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Activation of KLF1 enhances the differentiation and maturation of red blood cells from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cells. 35 (4), 886-897 (2017).</li>
<li>Lopez-Yrigoyen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+iPSC+line+capable+of+differentiating+into+functional+macrophages+expressing+ZsGreen%3A+A+tool+for+the+study+and+in+vivo+tracking+of+therapeutic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">A human iPSC line capable of differentiating into functional macrophages expressing ZsGreen: A tool for the study and in vivo tracking of therapeutic cells.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1750), 20170219(2018).</li>
<li>Lopez-Yrigoyen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+characterization+of+human+macrophages+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Production and characterization of human macrophages from pluripotent stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. 2020 (158), (2020).</li>
<li>Fidanza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+analyses+and+machine+learning+define+hematopoietic+progenitor+and+HSC-like+cells+derived+from+human+PSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Single cell analyses and machine learning define hematopoietic progenitor and HSC-like cells derived from human PSCs.</a> Blood. 136 (25), 2893-2904 (2020).</li>
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<li>Petazzi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arterial+cells+support+the+development+of+human+hematopoietic+progenitors+in+vitro+via+secretion+of+IGFBP2%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Arterial cells support the development of human hematopoietic progenitors in vitro via secretion of IGFBP2.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Crosse, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-layered+spatial+transcriptomics+identify+secretory+factors+promoting+human+hematopoietic+stem+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Multi-layered spatial transcriptomics identify secretory factors promoting human hematopoietic stem cell development.</a> Cell Stem Cell. 27 (5), 822(2020).</li>
<li>Calvanese, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+human+haematopoietic+stem+cells+from+haemogenic+endothelium+to+birth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mapping human haematopoietic stem cells from haemogenic endothelium to birth.</a> Nature. 604 (7906), 534-540 (2022).</li>
<li>Zeng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+the+first+hematopoietic+stem+cell+generation+in+human+embryo+by+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Tracing the first hematopoietic stem cell generation in human embryo by single-cell RNA sequencing.</a> Cell Research. 29 (11), 881-894 (2019).</li>
<li>Hwa, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+arterial-venous+fusions+and+fate+specification+in+mouse+embryos+lacking+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Abnormal arterial-venous fusions and fate specification in mouse embryos lacking blood flow.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11965(2017).</li>
</ol>

著者には開示すべき利益相反はありません。

私達がここに記述するプロトコルは制御されたせん断の圧力によって仲介される機械刺激への応答の調査および人間の多能性幹細胞からのmechanosensiveなendothelialセルの作成を可能にする。このプロトコルは完全にサイトカインベースであり、細胞治療用の細胞産生への翻訳の可能性についてGMP試薬と完全に互換性があります。
ヒトiPS細胞の誘導は、胚発生の初期段階の機器モデルを提供し、他の方法ではin vivoで研究することが困難なプロセスの研究を可能にします24。実際、研究に利用できるヒト胚組織は、循環を欠いた胚から採取されており、これは機械的な手がかりによって制御される分子シグネチャーに大きな影響を与える可能性があります。ここで説明するアプローチにより、せん断応力に対する細胞応答のライブイメージングとリアルタイム研究が可能になります。ヒトiPS細胞と流路系の組み合わせは、循環の開始が心血管系および血液系の確立をリモデリングおよび制御する際に、発生中の胎児組織の限られた可用性とアクセス不能を克服する研究モデルを提供します3,9,10,25。
プロトコルの限定はこのプロトコルから得られるendothelialセルが成長のティッシュにある異なったendothelialセルのさまざまな同一性を反映しないかもしれないことである。この制限を克服するために、所望の同一性または組織特異的表現型を得るために、流体刺激に先行する分化過程において、サイトカインの特異的な組み合わせが必要になる場合がある26。内皮サブセットの単離は、単離ステップ中に、より精緻な免疫表現型を用いて得ることができる。このプロトコルはCD34の表現にだけ基づいて内皮細胞を隔離し、それにより蛍光活動化させたセルソーティング(FACS)の代りにコラムの隔離を可能にする;これにより、細胞死と汚染のリスクが軽減されます。さらに、このプロトコルは、層流によって媒介されるせん断応力の役割を研究するために特別に設計されています。別の流体アプローチを使用して、伸張や圧縮などの他の機械的手がかりや、摂動や乱れた流れなどの他のタイプの流れの影響を研究する必要があります。
iPS細胞由来の内皮細胞は、胎児の背側大動脈で観察されるものと類似した不均一な動静脈細胞の同一性27を模倣していることを以前に示しました28,29,30。これは、血管の発達と細胞の仕様の文脈で特に重要であり、血液循環によって制御されることが知られています。さまざまなモデルでの研究では、循環の欠如が動静脈の仕様の変化をもたらすことが示されました11,14,31。機械的な手がかりと細胞の仕様を結びつけるメカニズムはまだ不明であり、ここで説明するパイプラインは、in vivoでテストできなかった洗練された機能研究を可能にします。
このパイプラインは、市販の流路を用いてヒトiPS細胞由来の内皮細胞の産生と刺激を記述しており、広く使用されているポリジメチルシロキサン(PDMS)デバイス12のようにデバイスを鋳造する必要性を回避している。さらに、PDMSチップを使用すると、刺激された細胞の収集が特に困難になりますが、このプロトコルでは、細胞をチャネルから簡単に取り出すことができます。これにより、分析能力が大幅に向上し、プロテオミクス解析やトランスクリプトーム解析、フローサイトメトリー、機能アッセイなど、さらなる培養や in vivo アッセイが必要な場合のあるその後の解析が可能になります。

胚発生中、心臓は機能を確立する最初の器官であり1、心内膜チューブ形成の初期段階から検出可能な収縮2。循環は、血管内の血液の流れによって媒介される機械的手がかりとともに、初期発達の多くの重要な側面を制御します。胎児循環の確立に先立って、血管系は一次毛細血管叢に組織化される。心が機能すると、この神経叢は静脈血管系と動脈血管系に再編成されます3。動静脈の仕様における機械的手がかりの役割は、血流開始前の動脈マーカーおよび静脈マーカーの汎内皮発現に反映されます4。
血行動態の力は、血管系自体の発達を制御するだけでなく、血球形成の制御においても基本的な役割を果たします。造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)は、血原性内皮5,6,7,8と呼ばれる特殊な内皮細胞から出現し、発生の初期段階でのみ胚のさまざまな解剖学的領域に存在します。心臓欠損モデルは、in vitroモデルとともに、機械的手がかりが血原性内皮からのHSPC産生を指示し、増加させることを実証しました9,10,11,12,13,14。
異なるタイプのフローダイナミクスは、血原性内皮16,17と動脈細胞仕様18の両方において重要であることが知られている細胞周期15を差動的に制御することが示されている。全体として、機械的な手がかりは、発生中の細胞の同一性と機能の重要な決定要因です。新しいin vitro流体デバイスにより、in vivoでのヒト血液発生における発生メカノバイオロジーの研究に伴う限界を克服することができます。
この原稿のプロトコルの全体的な目標は、ヒト人工多能性幹細胞(iPS細胞)から in vitro で得られたヒト内皮細胞に対するせん断応力の影響を研究するための実験パイプラインを段階的に記述することです。このプロトコルには、iPS細胞の内皮細胞への微分と、その後の刺激プロトコルのための流動チップへの播種に関する詳細な指示が含まれています。これを使用して、さまざまな in vitro由来の内皮細胞を、流れに応じた配向を分析することにより、せん断応力を感知する能力についてテストできます。これにより、他の研究室は、せん断応力に対する応答と、さまざまな内皮細胞の同一性に対するその機能的影響に関する疑問に取り組むことができます。

<table><tbody><tr><td>0.6ルアーコーティングされていないスライド</td><td></td><td>IB-80186</td><td></td></tr><tr><td>25% BSA</td><td>Life Technologies</td><td>A10008-01</td><td></td></tr><tr><td>6ウェルプレート</td><td>Greiner Bio-one</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Life Technologies</td><td>A1110501</td><td>解離試薬として引用</td></tr><tr><td>アスコルビン酸</td><td>メルク</td><td>A4544-100G</td><td></td></tr><tr><td>吸引ピペット</td><td>Sardtedt</td><td>86.1252.011</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td>Neuronal cell culture supplement (50x)</td></tr><tr><td>BD FACS DIVA</td><td>BD Biosciences</td><td>Version 8.0.1</td><td>フローサイトメトリーソフトウェアとして引用</td></tr><tr><td>BD LSR Fortessa 5 Laser</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Life Technologies</td><td>PHG0021</td><td></td></tr><tr><td>CD34マイクロビーズキット</td><td>Miltenyil Biotec</td><td>30-046-702</td><td></td></tr><tr><td>CD34 PE clone 4H11</td><td>Invitrogen</td><td>12-0349-42</td><td></td></tr><tr><td>CD34 PerCP-eFluor 710 clone 4H11</td><td>Invitrogen</td><td>44-0349-42</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar cell-pelellent surface 6-well plates</td><td>Greiner Bio-one</td><td>657970</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Cayman Chemicals</td>&<td>13122-1mg-CAY</td><td></td></tr><tr><td>クライオスター CS10&nbsp; 細胞凍結保存</td><td>メルク</td><td>C2874-100ML</td><td>凍結保存液として引用</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド</td><td>VWR</td><td>200-664-3</td><td>DMSO</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>ライフ テクノロジー</td><td>ズ 10565-018</td><td></td></tr><tr><td>DPB Ca2+ Mg2+</td><td>Life Technologies</td><td>14080055</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14200075</td><td></td></tr><tr><td>イージーストレーナー 40 &mu;m</td><td>Greiner Bio-one</td><td>542040</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Life technologies</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>FcR ブロッキング試薬</td><td>Miltenyil Biotec</td><td>130-059-901</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td></td><td>Version 1.53c</td><td></td></tr><tr><td>Flow Jo</td><td></td><td>Version 10.7.1</td><td>Cited as Flow Cytometry sanalysis oftware</td></tr><tr><td>FLT3L</td><td>Peprotech</td><td>300-19-10uG</td><td></td></tr><tr><td>流体ユニット</td><td>同上</td><td>10903</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Life Technologies</td><td>35050038</td><td>L-グルタミンサプリメント</td></tr>ハム<tr><td>F-12として引用されています&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11765054</td><td></td></tr><tr><td>Holo-transferrin</td><td>Merk</td><td>T0665-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Human Serum Albumin</td><td>Fujifilm UK Ltd</td><td>9988</td><td></td></tr><tr><td>Ibidi ポンプシステム</td><td>ibidi</td><td>10902</td><td>ポンプシステムとして引用</td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Life Technologies</td><td>12440053</td><td></td></tr><tr><td>倒立顕微鏡</td><td>ioLight/Thisle Scientific</td><td>IOL-IO-INVERT</td><td>倒立インキュベーター内顕微鏡として引用</td></tr><tr><td>凍結乾燥BSA&nbsp;</td><td>メルク</td><td>A2153-100G</td><td></td></tr><tr><td>MiniMACSセパレーター</td><td>Miltenyil Biotec</td><td>130-042-102</td><td>磁気セパレーターとして引用</td></tr><tr><td>MSカラム</td><td>Miltenyil Biotec</td><td>130-042-201</td><td>磁気カラムとして引用</td></tr><tr><td>MTG</td><td>メルク</td><td>M6145-25ML</td><td></td></tr><tr><td>N2サプリメント</td><td>Life Technologies</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Notebook for pump system</td><td>同上</td><td>10908</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド 37-41%</td><td>フィッシャー ケミカル</td>ズ <td>F/1501/PB15</td><td></td></tr><tr><td>パステット</td><td>グライナー バイオワン</td><td>612398</td><td></td></tr><tr><td>ペン/連鎖球菌</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>灌流セット イエロー/グリーン: 50 cm、ID 1.6 mm、10 mL リザーバー</td><td>イビディ</td><td>IB-10964</td><td>灌流セット</td></tr><tr><td>ポリスチレン丸底チューブ</td><td>ファルコン</td><td></td><td>352008 フローサイトメトリーチューブとして引用</td></tr><tr><td>Prism 9</td><td></td><td>Verison 9.4.0</td><td></td></tr><tr><td>ポンプ制御ソフトウェア</td><td>同上</td><td>version 1.6.1</td><td>ポンプソフトウェアとして引用</td></tr><tr><td>ReLeSR</td><td>幹細胞技術</td><td>5872</td><td>剥離ソリューションとして引用</td></tr><tr><td>rhBMP4</td><td>R&D</td><td>314-BP-010</td><td></td></tr><tr><td>rhEPO</td><td>R&D</td><td>287-TC-500</td><td></td></tr><tr><td>rhIGF1</td><td>Peprotech</td><td>100-11-100uG</td><td></td></tr><tr><td>rhIL11</td><td>Peprotech</td><td>200-11-10uG</td><td></td></tr><tr><td>rhIL3</td><td>Peprotech</td><td>200-03-10uG</td><td></td></tr><tr><td>rhIL6</td><td>R&D</td><td>206-IL-010</td><td></td></tr><tr><td>rhLaminin-521</td><td>Life technologies</td><td>A29248</td><td>Laminin</td></tr><tr><td>rhSCF</td><td>Life Technologies</td><td>PHC2111</td><td></td></tr><tr><td>rhTPO</td><td>R&D</td><td>288-TPN-025</td><td></td></tr><tr><td>rhVEGF</td><td>R&D</td><td>293-VE-010</td><td></td></tr><tr><td>RLT Lysis Buffer</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td></td></tr><tr><td>Serial Connector for &micro;-Slides: Sterile, Sterile</td><td>ibidi</td><td>IB-10830</td><td></td></tr><tr><td>StemPro-CD34 SFM media</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>10639011 CD34+ cells (SFM-34)</td></tr><tr><td>StemPro-CD34 Nutrient Supplement&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>10641-025</td><td>34栄養素サプリメントとして引用</td></tr><tr><td>StemPro hESC SFM</td><td>Life Technologies</td><td>A1000701</td><td>培養培地として引用&nbsp;</td></tr><tr><td>StemProサプリメント</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズA10006-01</td><td></td></tr><tr><td>ビトロネクチン(VTN-N)組換えヒトタンパク質、切頭</td><td>Invitrogen</td><td>A31804</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632二塩酸塩</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>iRock</td></tr><tr><td>&betaとして引用;-メルカプトエタノール</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td></td></tr></tbody></table>

イン・ビトロ 発生メカノバイオロジー研究のための胎児血管オンチップモデル

In Vitro Model of Fetal Human Vessel On-chip to Study Developmental Mechanobiology

心臓は、発生中に機能的に確立される最初の臓器であるため、妊娠の非常に早い段階で血液循環が始まります。胎児の循環は、胎児の成長を確実にするために酸素と栄養素を輸送するだけでなく、機械的な手がかりによって内皮層内で起こる多くの重要な発達イベントを制御します。生体力学的信号は、血管構造の変化を誘発し、動静脈の仕様を確立し、造血幹細胞の発生を制御します。発達中の組織にアクセスできないため、初期のヒトの発達における循環の役割の理解が制限されます。したがって、 in vitro モデルは、血管メカノバイオロジーの研究にとって極めて重要なツールです。この論文では、内皮細胞をヒト誘導多能性幹細胞から区別し、その後の流体デバイスへの播種を行い、機械的合図に対する応答を研究するプロトコルについて説明します。このアプローチにより、機械的刺激下で内皮細胞を長期間培養し、その後、表現型および機能特性評価のために内皮細胞を回収することができます。今回確立した in vitro モデルは、ヒト胎児期の血管発達を最終的に調整する機械的な手がかりによってシグナル伝達を行う細胞内分子機構の解明に有用です。

ここでは、iPS細胞由来の内皮細胞の分化とメカノ刺激のためのプロトコルについて述べ、機械的手がかりに対する反応を研究することを可能にします(図1)。このプロトコルは機能的にmechanosensitive endothelialセルの生産で起因する。ここでは、代表的な結果を提供し、分化中のサイトカイン刺激に細胞がどのように反応するかを評価するために、予想される表現型について説明します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65492/65492fig01v2.jpg"> 図1:分化および機械的刺激プロトコルの概略図。 サイトカインのさまざまなミックスのタイミング、CD34+細胞の単離、流体チップの播種、および機械的に刺激された細胞の最終分析を示す分化プロトコルの概略図。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492fig01largev2.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
iPS細胞の培養 プロトコルは、自己複製状態で正しく増殖しているiPS細胞から開始することが重要です。文化の質を示す良い指標は、その成長の速さです。融解後、細胞が良好な分化を確実にする正しい増殖段階に達するまでに2〜3週間かかる場合があります。細胞が週に2回、1:6の比率で継代され、ほぼ完全なコンフルエントに達すると、継代が必要なその日に分化する準備が整います。
iPS細胞の内皮細胞への分化 分化の最初のステップは、胚様体(EB)の形成で構成され、細胞株に依存し、使用する特定の細胞株に対して何らかの最適化が必要な場合があります。プロトコルステップ1.3.2.2-1.3.2.4に記載されている解離は、解離試薬とのインキュベーションとその後のパスツールピペットとの解離を減少または延長することによって変更できます。さらに、このステップには、切削工具またはP100ピペットチップによるコロニーの物理的解離に加えて、他の解離試薬を使用することができる。良質のEBは、分化の2日目までに明確なエッジを示し、顕微鏡で観察すると透明で明るく見えます。暗い領域は、EB内の細胞死を示している可能性があります(図2)。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65492/65492fig2v3.jpg"> 図2:胚様体の形態。 (A)2日目の胚様体は、明確に定義された外縁と一貫したサイズを示しています。(B)質の悪い2日目の胚様体は、構造の解離につながる広範な細胞死を示しています。スケールバー = 500 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
2日目に、EBにCHIR99021を添加するとGSK-3タンパク質が阻害され、Wnt経路が活性化されます。細胞株が異なれば、CHIR処理に対する反応も異なるため、8日目に得られたCD34+ 細胞の数を異なる濃度で定量することにより、これを検証する必要があります(図3)。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65492/65492fig3v3.jpg"> 図3:異なるCHIR処理による内皮細胞の分化。 内皮細胞の関与は、2日目に(A)3 μM、(B)5 μM、および(C)7 μMでCHIR処理した後、CD34膜発現による分化の8日目にフローサイトメトリーによって定量化されました。 フローサイトメトリーのデータは、5つのレーザーサイトメーターと専用ソフトウェアを使用して取得しました( 材料表を参照)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
CD34+ 細胞単離 磁気ビーズを使用したCD34+濃縮により、カラムの溶出後に少なくとも80%のCD34+が得られることを検証することが重要です。十分な純度を確保するために、磁気単離から得られた細胞のアリコートをフローサイトメトリーで分析し、磁気濃縮に使用した抗体クローンとは異なる抗体クローンを使用するようにしてください。ここでは、4H11 クローンを使用し、濃縮後に ~85% の純度を達成しました(図 4)。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65492/65492fig4v3.jpg"> 図4:磁気選別による濃縮前後のCD34の膜発現。 8日目の解離した胚様体(灰色)と磁気濃縮後の細胞(緑色)をCD34発現について染色し、フローサイトメトリーで分析したところ、ソーティング後の濃縮が成功したことが示されました。フローサイトメトリーのデータは、5 台のレーザーサイトメーターと専用ソフトウェアを使用して取得しました( 材料表を参照)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
細胞を流路に播種する 流路に細胞を播種する場合、内皮細胞の接着と増殖を追跡することが重要です。播種後、細胞がチャネルに完全に接着するまでに~5時間かかります(図5A)。この段階では、接着性を改善するために代替コーティング溶液をテストすることもできます。試験した細胞が機械感受性であり、したがって機械的刺激に応答できることを確認するために、細胞の配向を経時的に試験することができる。刺激を受ける前の細胞はランダムな向きを示し(図5Aおよび図5C)、流れの方向に平行に向きを変えます(図5B、C)。ここで説明するプロトコルでは、チャネルから細胞を採取して下流の解析、例えばフローサイトメトリーを行い、膜免疫表現型を研究し、刺激された細胞の内皮の同一性を得ることができます(図5D、E)。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65492/65492fig5v3.jpg"> 図5:ヒトiPS細胞由来内皮細胞の機械応答性 (A)播種後48時間で単離されたCD34+ 細胞のコンフルエント層。(B)動的培養下で3日間、内皮細胞の配向層を変更した。(C)5日間の動的培養後の内皮細胞の配向解析。(D)フロー下で5日間培養した細胞のCD34発現プロファイル。(E)流路から回収した細胞集団のCD34+ 細胞の割合。画像は倒立インキュベーター内顕微鏡を使用して撮影しました。フローサイトメトリーのデータは、5 台のレーザーサイトメーターと専用ソフトウェアを使用して取得しました( 材料表を参照)。スケールバー = 100 μm (A,B)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>試薬</td>
			<td>在庫濃度</td>
			<td>追加されたボリューム</td>
			<td>最終濃度</td>
		</tr><tr><td>イスコーブ修正ダルベッコ培地(IMDM)</td>
			<td>-</td>
			<td>333 mLの</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>ハムのF-12栄養混合物(F-12)</td>
			<td>-</td>
			<td>167 mLの</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>N-2サプリメント(×100)</td>
			<td>100倍</td>
			<td>5 mLの</td>
			<td>1倍速</td>
		</tr><tr><td>B-27サプリメント(×50)</td>
			<td>50倍</td>
			<td>10 mLの</td>
			<td>1倍速</td>
		</tr><tr><td>アスコルビン酸</td>
			<td>10 mg/mL</td>
			<td>1.25メートル</td>
			<td>25 μg/mL</td>
		</tr><tr><td>α-モノチオグリセロール(MTG)</td>
			<td>11.5メートル</td>
			<td>19.5μL</td>
			<td>448.5μM</td>
		</tr><tr><td>ヒト血清アルブミン</td>
			<td>100 mg/mL</td>
			<td>2.5 mLの</td>
			<td>0.5 mg/mL</td>
		</tr><tr><td>ホロトランスフェリン</td>
			<td>100 mg/mL</td>
			<td>0.75 mLの</td>
			<td>150 μg/mL</td>
		</tr></tbody></table>表1:500 mLの無血清分化(SFD)培地の組成とレシピ。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>差別化の日々</td>
			<td>サイトカインミックス</td>
			<td>サイトカイン</td>
			<td>最終濃度</td>
		</tr><tr><td>0日目 - 2日目</td>
			<td>ミックス1</td>
			<td>BMP4の</td>
			<td>20 ng/mLの</td>
		</tr><tr><td>2日目</td>
			<td>ミックス2</td>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>7 μM</td>
		</tr><tr><td>3日目以降</td>
			<td rowspan="2">3と4を混ぜる</td>
			<td>VEGFの</td>
			<td>15 ng/mL</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>bFGFの</td>
			<td>5 ng/mL</td>
		</tr><tr><td>6日目以降</td>
			<td rowspan="8">ミックス4</td>
			<td>IL6の</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>FLT3L型</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>IGF1の</td>
			<td>25 ng/mL</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>IL11の</td>
			<td>5 ng/mL</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>SCFの</td>
			<td>50 ng/mLの</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>欧州特許庁(EPO)</td>
			<td>3 U/mL</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>TPOの</td>
			<td>30 ng/mL</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>IL3の</td>
			<td>30 ng/mL</td>
		</tr></tbody></table>表2:内皮細胞の分化に用いたサイトカインの混合物、SFD培地に添加した日数、および最終濃度。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>せん断応力(dyn/cm2)</td>
			<td>時間(h)</td>
		</tr><tr><td>0.5</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>1.5</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>2</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>2.5</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>3</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>3.5</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>4</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>4.5</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>5</td>
			<td>実験終了まで</td>
		</tr></tbody></table>表3:動的培養のせん断応力値とその適用期間。
補足図S1:このプロトコルに使用されるチップとチューブの形状と寸法。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/SF1.pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図S2:各ステップの説明を含むエアポンプを制御するソフトウェアのステップバイステップガイド。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492_Supp%20Figure%20S2%20FINAL.pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図S3:FIJIを用いた方位解析の手引きで、セル形状の図面、楕円フィッティング、最終測定値を示す。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/65492_SF3.pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足表S1:分化プロトコルで使用されるサイトカインのユニットサイズ、再懸濁量、およびストック濃度。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65492/Ventura%20et%20al,%202023%20-%20Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

ここでは、内皮細胞をヒト多能性幹細胞から分化させる簡単なワークフローと、それに続く機械的刺激の詳細なプロトコルについて説明します。これにより、内皮細胞の発生メカノバイオロジーの研究が可能になります。このアプローチは、機械的刺激後に培養チップから回収された生細胞のダウンストリームアッセイに適合します。

The heart is the first organ to be functionally established during development, thus initiating blood circulation very early in gestation. Besides ...

私たちの研究では、発生中の内皮細胞の運命を機械的手がかりがどのように指示するかを探求し、ヒト誘導多能性幹細胞の分化と流体を介した機械的刺激を組み合わせています。内皮細胞は常に血液の動きにさらされているため、静的培養では重要なシグナルが見落とされるため、従来の培養システムを使用して内皮細胞生物学を研究する上でこれが主な課題となっています。実際、機械的な手がかりは、静的な条件で培養された細胞では見落とされがちな多くの重要なシグナル伝達経路を活性化します。当社のプロトコールは、人工多能性幹細胞由来の内皮細胞を分化し、機械的に刺激する方法に関する簡単なステップバイステップガイドを提供します。これにより、多くのラボが熱培養を採用して、フロー中の内皮細胞の挙動に関する質問に簡単に対処できるようになります。

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