Name: 同等の容量を持つラット骨髄好中球を単離するためのユニークなアプローチ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: 学ぶラット骨髄由来好中球とNETsの単離法。密度勾配遠心と商業キットを用いて高収率・高純度の好中球を単離し、免疫応答研究の精度向上に貢献します。

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資金提供:この研究は、中国国家自然科学基金会(第82004154号、81900311号、82100336号、81970345号)の支援を受けました。

この研究は、四川大学華西病院の動物倫理委員会によって付与されたプロジェクトライセンス(第20211404A号)に基づいて実施され、動物のケアと使用に関する四川大学華西病院の動物倫理委員会のガイドラインに準拠しています。倫理的ガイドラインに従って、この研究で使用されたラットは、12時間の明暗サイクル、22〜24°Cの温度、50%〜60%の湿度で制御された環境で維持されました。ネズミは自由に餌と水を与えられた。この研究で使用された動物は、体重約250 gで、特定の病原体を含まない6〜8週齢のSprague Dawley(SD)雄ラットでした。動物は市販の供給源から入手した( 資料表参照)。
1. ラット好中球の単離
<ol><li>骨髄採取<ol><li>ラットを麻酔用の適切な容器に入れます( 材料表を参照)。動物が意識を失うまでラットに3%イソフルランを投与します。つま先のつまみや尾のつまみに対する反応がないことを確認して、麻酔の深さを確認します。</li>
		<li>ラットに深く麻酔をかけたら、ラットを仰向けに寝かせ、片手で尻尾を持ち、もう片方の手で頭部をつかんで子宮頸部脱臼を行います。頸椎が切断されるまで頭を下に引っ張りながら、尾に突然強い上向きの力を加えることにより、首をすばやくしっかりと脱臼させます。呼吸の停止や心拍の不足などの死亡の確認を待ってから、組織の収集または廃棄に進みます。.</li>
		<li>ラットを75%エタノールに浸し、数分間放置して毛皮と皮膚を殺菌します。ネズミを仰向けに寝かせ、腰で下肢を切断して大腿骨の頭を保護します。解剖ハサミを使用してホックジョイントの靭帯を切断し、膝関節を後方に折りたたんで大腿骨と脛骨を露出させます。</li>
		<li>鉗子とハサミを使用して、骨に接続されている筋肉、腱、その他の組織を慎重に取り除きます。ハンクのバランス塩溶液(HBSS)で骨をすすぎ、残っている組織の破片や血液を取り除きます。さらに2回、合計3回の洗浄を繰り返します。洗浄した骨を滅菌容器に入れます。</li>
		<li>針付きの5mLまたは10mLのシリンジを使用して、骨の両端から骨髄を突き刺し、骨髄マトリックスを緩めます。目に見える骨髄が洗い流されなくなるまで、別の注射器を備えた10〜15 mLのロズウェルパークメモリアルインスティテュート(RPMI)培地で骨髄をすすぎます。.</li>
		<li>骨髄細胞を300 x g で20°Cで10分間遠心分離します。 5〜10 mLの赤血球溶解バッファー( 材料表を参照)を加えて細胞を再懸濁し、室温で3分間インキュベートします。混合物に4倍の容量のHBSSを加えます。細胞を室温で600 x g で5分間遠心分離し、ピペットで上清を廃棄し、得られたペレットをさらに使用するために使用します。</li>
	</ol></li>
	<li>骨髄からの好中球の単離<ol><li>2 ステップ方式の場合は、次の追加手順を実行します。<ol><li>メーカーの指示に従って、市販のラット好中球分離キットを使用して骨髄細胞を単離します( 材料表を参照)。</li>
			<li>新しい 15 mL 遠心チューブに 2 mL の 55% パーコール試薬( 材料表を参照)、2 mL の 65% 試薬、2 mL の 70% 試薬、2 mL の 80% 試薬を重ねて密度勾配を調製します。チューブを800 x g で20°Cで40分間遠心分離し、加速度を5、減速を0または1に設定します。</li>
			<li>滅菌ピペットを使用して、65%と70%のグラジエント試薬の境界にある細胞層を含む70%グラジエント層を回収します。細胞懸濁液を新しい15 mL遠心チューブに移します。15 mL HBSS をチューブに加え、チューブを数回静かに裏返して細胞を洗浄します。チューブを室温で300 x g で10分間遠心分離し、細胞をペレット化します。</li>
		</ol></li>
		<li>ワンステップ方式の場合は、次の追加手順を実行します。<ol><li>ラット好中球分離キットを使用せずに骨髄細胞をグラジエントに曝露します。</li>
			<li>滅菌ピペットを使用して、65%と70%のグラジエントの境界にある細胞層を含む70%グラジエント層を回収します。細胞懸濁液を新しい50 mL遠心チューブに移し、HBSSで細胞を洗浄します。チューブを室温で400 x g で5分間遠心分離し、細胞をペレット化します。</li>
			<li>単離された好中球を血球計算盤でカウントし、トリパンブルー染色で生存率を評価します。 注:プロトコルは、ラットの数と単離された好中球の所望の数に応じて変更できます。この方法を新しい実験環境で初めて使用したときに、3匹のラットから許容可能な量の骨が得られます。すべての手順は、無菌条件下で実行する必要があります。骨髄からの好中球の単離は、細胞の損傷と生存率の損失を最小限に抑えるために、できるだけ早く実行する必要があります。.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. ラットNETの獲得
<ol><li>0.5 x 10 8-1 x 108 単離好中球を 4 mL RPMI 培地(10% ウシ胎児血清 (FBS) および 1% ペニシリン-ストレプトマイシンを添加) に無菌の 10 cm シャーレに再懸濁します。</li>
	<li>好中球懸濁液に500 nM PMA( 材料表を参照)を添加して、NETosisを誘導します。37°C、5%CO2で3時間インキュベートします。</li>
	<li>ネガティブコントロールでは、DNase I(10 U/mL)を好中球懸濁液に添加して、分泌されたNETを分解します。</li>
	<li>NETを収穫するには、培地を取り除き、ペトリ皿に付着したNETをHBSSで静かに洗浄します。次に、各プレートに 4 mL の新鮮な培地で強力にフラッシングして、プレートから NET を剥がします。</li>
	<li>洗浄剤とピペットを頻繁に回収して、NETを完全に再懸濁してください。</li>
	<li>懸濁液を300 × g で20°Cで10分間遠心分離し、浮遊細胞を除去します。</li>
	<li>NETを含む懸濁液を滅菌チューブに移し、-20°Cで保存し、2週間以内にさらに使用してください。 注意: NETは劣化に敏感であるため、最良の結果を得るには、収穫したばかりの材料を使用することをお勧めします。</li>
</ol>3. NETsの存在の検証
<ol><li>4%パラホルムアルデヒドで15分間、NET(ステップ2.7で)で30分から1時間カバーガラスに細胞(ステップ2.4から)を固定します。</li>
	<li>パラフィンフィルムで覆われた試験管スタンドのPBS/PBST液滴にカバーガラスを反転させ、洗浄プロセスを5分間ずつ3回繰り返します。</li>
	<li>細胞を0.5% Triton-X-100で室温で10分間透過処理し、PBS/PBSTでそれぞれ1分間3回洗浄します。細胞を10%正常ロバ血清( 材料表参照)で室温で1時間密封します。</li>
	<li>抗ラット好中球エラスターゼ抗体および抗ラットミエロペルオキシダーゼ抗体( 材料表参照)とともに、細胞を4°Cで一晩インキュベートします。 次に、カバーガラスをPBS/PBSTで5分間ずつ3回洗浄します。</li>
	<li>二次抗体A488結合ロバ抗ウサギIgG(H + L)、A594結合ロバ抗マウスIgG(H + L)、およびA594結合ヤギ抗マウスIgG1( 材料表参照)とともに、室温で暗所で1時間インキュベートします。次に、カバーガラスをPBS/PBSTで5分間ずつ3回洗浄します。</li>
	<li>細胞核およびNET骨格を10 mg/mL DAPIで染色します。次に、カバーガラスをPBS/PBSTで5分間ずつ3回洗浄します。</li>
	<li>スライドガラスに封入剤を一滴垂らし、その上にセルの入ったカバーガラスをひっくり返します。浸漬レンズによる顕微鏡分析のために1時間乾燥させます。それ以外の場合は、検査の準備ができています。 注:NETは非常に壊れやすく、準備中に簡単に紛失する可能性があるため、固定後でもNETを操作するときは細心の注意を払う必要があります。</li>
</ol>4. NETの定量化
<ol><li>Tris-EDTA(TE)バッファーとPicoGreen(dsDNAアッセイ試薬)ワーキング溶液は、メーカーの指示に従って調製します( 材料表を参照)。</li>
	<li>ストック DNA を 1 ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL、1 μg/mL の濃度に希釈して標準試料を調製します。 注:NETの濃度を定量するために、メーカーのガイドラインに準拠したdsDNAアッセイキット( 材料表を参照)を使用しました。Tris-EDTA(TE)バッファーおよび dsDNA アッセイ試薬は、それぞれ 19 倍の容量の 2 蒸留水または 199 倍の容量の TE バッファーを使用して調製しました。続いて、標準溶液(1 ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL、1 μg/mL)を調製し、各50 μLのサンプルを450 μLのTE緩衝液と混合しました。</li>
	<li>各サンプル 50 μL を 450 μL の TE バッファーに加えます。</li>
	<li>100 μL の標準試料またはサンプルと等量のアッセイ試薬ワーキング溶液を、標準試料とサンプルを含む 96 ウェルプレートの各ウェルに加えます。</li>
	<li>直射日光を避けながら、プレートを室温で2〜5分間インキュベートします。</li>
	<li>発光スペクトルが約 530 nm、吸光度スペクトルが約 480 nm の蛍光マイクロプレートリーダーを使用してサンプルを読み取ります。</li>
	<li>標準試料で生成された検量線を使用して、各サンプル中のNETs濃度を計算します。</li>
</ol>5. 細胞サイトメトリーによるNETs分泌の解析
<ol><li>96ウェルプレートでインキュベートした細胞に核染色剤( 材料表を参照)を添加し、最終濃度が10 ng/mLになるようにし、30分間インキュベートします。</li>
	<li>無細胞DNA(cfDNA、 材料表を参照)染色剤を細胞に添加して最終濃度300 nMにし、10分間インキュベートします。</li>
	<li>穏やかなピペッティングで蛍光色素を混合します。上澄みを捨てたり、ペレットを洗ったりしないでください。</li>
	<li>サンプルプレートをサイトメーター装置にロードします。</li>
	<li>青(例:377/50 nm、em:470/22 nm)、通常30,000 msの露光、緑(例:483/32 nm、eM:536/40 nm)、通常5,000 msの露光。</li>
	<li>異なるチャンネルでプレート全体の非常に均一な画像を取得します。</li>
	<li>さまざまなグループの核染色数を分析します。それらが類似している場合、NETsの分泌はcfDNA染色数によって決定できます。</li>
</ol>

効率的なラット骨髄好中球細胞外トラップの単離

<ol><li>Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+in+immunity+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps in immunity and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).</li>
<li>Takei, H., Araki, A., Watanabe, H., Ichinose, A., Sendo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+killing+of+human+neutrophils+by+the+potent+activator+phorbol+12-myristate+13-acetate+%28PMA%29+accompanied+by+changes+different+from+typical+apoptosis+or+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Rapid killing of human neutrophils by the potent activator phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) accompanied by changes different from typical apoptosis or necrosis.</a> Journal of Leukocyte Biology. 59 (2), 229-240 (1996).</li>
<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li>
<li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+induce+intestinal+damage+and+thrombotic+tendency+in+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Crohn%27s+and+Colitis%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps induce intestinal damage and thrombotic tendency in inflammatory bowel disease.</a> Journal of Crohn's and Colitis. 14 (2), 240-253 (2020).</li>
<li>Laridan, E., Martinod, K., De Meyer, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+in+arterial+and+venous+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Thrombosis+and+Hemostasis%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps in arterial and venous thrombosis.</a> Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 45 (1), 86-93 (2019).</li>
<li>Dinallo, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+Extracellular+traps+sustain+inflammatory+signals+in+ulcerative+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Crohn%27s+and+Colitis%22%5BJournal%5D)">Neutrophil Extracellular traps sustain inflammatory signals in ulcerative colitis.</a> Journal of Crohn's and Colitis. 13 (6), 772-784 (2019).</li>
<li>Dicker, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+are+associated+with+disease+severity+and+microbiota+diversity+in+patients+with+chronic+obstructive+pulmonary+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps are associated with disease severity and microbiota diversity in patients with chronic obstructive pulmonary disease.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (1), 117-127 (2018).</li>
<li>Franck, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+PAD4+and+netosis+in+experimental+atherosclerosis+and+arterial+injury%3A+Implications+for+superficial+erosion%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Roles of PAD4 and netosis in experimental atherosclerosis and arterial injury: Implications for superficial erosion.</a> Atherosclerosis. 275, e11(2018).</li>
<li>Jorch, S. K., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+emerging+role+for+neutrophil+extracellular+traps+in+noninfectious+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease.</a> Nature Medicine. 23 (3), 279-287 (2017).</li>
<li>Marin-Esteban, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Afa%2FDr+diffusely+adhering+Escherichia+coli+strain+C1845+induces+neutrophil+extracellular+traps+that+kill+bacteria+and+damage+human+enterocyte-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Afa/Dr diffusely adhering Escherichia coli strain C1845 induces neutrophil extracellular traps that kill bacteria and damage human enterocyte-like cells.</a> Infection and Immunity. 80 (5), 1891-1899 (2012).</li>
<li>Kang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+released+by+neutrophils+impair+revascularization+and+vascular+remodeling+after+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps released by neutrophils impair revascularization and vascular remodeling after stroke.</a> Nature Communications. 11 (1), 2488(2020).</li>
<li>Schüttler, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Animal models of atrial fibrillation.</a> Circulation Research. 127 (1), 91-110 (2020).</li>
<li>Najmeh, S., Cools-Lartigue, J., Giannias, B., Spicer, J., Ferri, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+human+neutrophil+extracellular+traps+%28NETs%29+isolation+and+handling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Simplified human neutrophil extracellular traps (NETs) isolation and handling.</a> Journal of Visualized Experiments. 98, e52687(2015).</li>
<li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+is+the+preferred+source+for+isolation+of+rat+neutrophils+and+the+subsequent+acquisition+of+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Bone marrow is the preferred source for isolation of rat neutrophils and the subsequent acquisition of neutrophil extracellular traps.</a> Annals of Translational Medicine. 10 (15), 823-823 (2022).</li>
<li>Freeman, G. E., Dalton, C. A., Brooks, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Nycodenz+gradient+method+for+the+purification+of+neutrophils+from+the+peripheral+blood+of+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A Nycodenz gradient method for the purification of neutrophils from the peripheral blood of rats.</a> Journal of Immunological Methods. 139 (2), 241-249 (1991).</li>
<li>Zindl, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-22-producing+neutrophils+contribute+to+antimicrobial+defense+and+restitution+of+colonic+epithelial+integrity+during+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">IL-22-producing neutrophils contribute to antimicrobial defense and restitution of colonic epithelial integrity during colitis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12768-12773 (2013).</li>
<li>Wong, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+reveals+the+defining+features+of+the+classical%2C+intermediate%2C+and+nonclassical+human+monocyte+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling reveals the defining features of the classical, intermediate, and nonclassical human monocyte subsets.</a> Blood. 118 (5), e16-e31 (2011).</li>
<li>Nauseef, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+neutrophils+from+venous+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation of human neutrophils from venous blood.</a> Methods in Molecular Biology. 412, 15-20 (2007).</li>
<li>Lindena, J., Burkhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+and+chemiluminescence+properties+of+human%2C+canine+and+rat+polymorphonuclear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Separation and chemiluminescence properties of human, canine and rat polymorphonuclear cells.</a> Journal of Immunological Methods. 115 (1), 141-147 (1988).</li>
<li>Lauwers, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+Transwell+assay+for+the+analysis+of+neutrophil+chemotaxis+using+flow+cytometry+to+refine+the+clinical+investigation+of+immunodeficient+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Optimization of the Transwell assay for the analysis of neutrophil chemotaxis using flow cytometry to refine the clinical investigation of immunodeficient patients.</a> Clinical Immunology. 238, 108994(2022).</li>
<li>Evrard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+analysis+of+bone+marrow+neutrophils+reveals+populations+specialized+in+expansion%2C+trafficking%2C+and+effector+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Developmental analysis of bone marrow neutrophils reveals populations specialized in expansion, trafficking, and effector functions.</a> Immunity. 48 (2), 364-379 (2018).</li>
</ol>

著者は、宣言すべき利益相反を持っていません。

好中球の単離は、NETosisの研究において極めて重要なステップであり、信頼できる結果を得るためには、適切な単離方法の選択が最も重要です。重み付けする重要な要素は、単離中のリンパ球汚染の発生です。この課題に対処することは、ラットの好中球を骨髄から単離する場合に特に重要です。リンパ球(1.0337-1.0765、ピーク1.0526)と比較して好中球の密度範囲(1.0814-1.0919、ピークは1.0919)が異なるにもかかわらず、リンパ球による汚染は依然として避けられません。これは、骨髄中のリンパ球の豊富さと、未熟なリンパ球の密度の増強に部分的に起因している可能性がある15。パーコールやフィコールなどの密度勾配分離などの技術は、リンパ球汚染の抑制に役立ちますが、リンパ球を完全に排除することは困難な場合があります。特定の密度勾配に較正された特殊なパーコール溶液は、ラット好中球と他の骨髄細胞との間の密度分散を利用することで、汚染を最小限に抑えるために使用できます。したがって、研究者は、リンパ球汚染が実験結果に及ぼす潜在的な影響を慎重に評価し、その影響を軽減するための対策を講じる必要があります。
この研究は、特定の実験要件に合わせて単離法を調整することの重要性を強調しています。先に述べた14の方法では、ワンステップ法の方が時間と労力の面で要求が少ないことが実証されました。そのため、リンパ球の汚染がNET分泌に及ぼす影響は重要ではないため、NET取得が承認されました。これらのリンパ球は、その後、最終遠心分離段階で排除される可能性があります。逆に、好中球の単離とその後のNETosisおよびNET分泌の評価を伴う試みについては、2段階の方法が推奨された14。このアプローチにより、好中球によって産生されるNETの正確な定量が可能になり、他の細胞汚染に起因する潜在的な交絡因子の影響を最小限に抑えることができました。
単離プロトコルに変更を加えて、収率と純度の両方を向上させることができます。例えば、最適化された密度勾配試薬セットを利用することで、より多くの好中球を得ることができます。穏やかなピペッティングと洗浄方法により、細胞の損失を軽減し、純度を高めることができます。バッファーのpHや温度のモニタリングなどのトラブルシューティングを行い、遠心分離パラメータを調整することで、単離プロセス中に発生する課題に効果的に対処できます。骨髄単離の関連する制約は、未熟な好中球やその他の骨髄細胞の汚染の可能性にあり、それによって純度と収量の両方に影響を与えます。リンパ球を排出するための合理化されたアプローチを考案することで、全体的な分離効率を高めることができます。別の制約は、骨髄単離のための動物の犠牲の必要性に関するものであり、これはin vivoでのラット好中球の縦断的研究には適さない可能性があります。
ヒトの好中球単離は、主に末梢血に依存しています。従来の方法には、Ficoll-Paque、Percoll、および免疫磁気ビーズ分離が含まれます16,17,18。Ficollアプローチは、浮力に基づいて白血球集団を分離し、好中球を区別するために造影剤に依存しています。シンプルさと費用対効果はありますが、純度と収率に妥協し、赤血球の除去に課題があります。一方、Percollは密度勾配を利用し、特殊な機器と費用と時間の増加を犠牲にして、好中球の純度と収量を向上させます19。免疫磁気ビーズ分離は、他の白血球からの汚染を最小限に抑えて好中球に特異的に結合する抗体標識磁気ビーズを利用する、より新しく、より特異的な技術です。自動化には適しているが、特殊な設備が必要で、ビード費用がかかるためコストが高くなります。好中球単離法を選択する場合、研究者は収量、純度、コスト、および複雑さを比較検討する必要があります。現在、ヒト好中球単離のための最も便利な方法は、PolymorphPrep20を使用することです。このアプローチにより、高度に精製された好中球が短期間で大量に得られます。PolymorphPrepの原理は、密度に応じた細胞分離にかかっています。
マウスでは、末梢血から好中球を単離することは、血液量が少なく、下流の実験に十分な量と純度を確保することが困難なため、お勧めできません。ラットは十分な血液量(ラット1匹あたり10 mL)を提供するにもかかわらず、末梢血の特性はヒトやマウスとは異なります。ラットは本質的に好中球抽出の欠損を示し、単球が最も豊富な有核細胞である13,14。したがって、末梢血の分離では、1匹のラットから2 x 105-5 x 105の好中球しか供給されません。骨髄は、より実行可能な好中球源として機能し、動物の感染状態に関係なく、容易に入手でき、豊富な供給を提供します。あるいは、腹腔または胸腔に炎症環境を誘導して好中球浸潤を促進して分離することは、信頼性が低く、複雑です。このように、骨髄抽出は、ラット好中球単離のための実用的で信頼できる経路として浮上している21。
NETosisには、DNAの脱凝縮、オートファジー、細胞内マトリックスの排出など、さまざまな細胞プロセスが関与しています1。ヒトでは、NET押出は包括的であり、細胞膜の残骸を残します。興味深いことに、ラット好中球研究は異なるパターンを示し、刺激後の細胞内含有量が多くなっています。PMA刺激にもかかわらず、ラット好中球は不完全なNET押し出しを示し、自発的なNETosisと一致します。不思議なことに、ラットNETは、広範なネットワーク構造ではなく、集合体(aggNET)の傾向を示しており、架橋能力の低下が原因である可能性があります。この現象は好中球凝集に大きな影響を与え、ラットのより広範な免疫応答に影響を与える可能性があります。骨髄単離の将来の応用には、NETosisにおける異なるシグナル伝達経路と免疫細胞の調査が含まれる可能性があります。さらに、この方法は、さまざまな疾患モデルにおけるNETosisの探索を容易にし、さまざまな病態における好中球の役割を解明することができます。最終的に、NETを単離し、特性評価するための新しい技術は、NETosisを駆動するメカニズムとその機能的意味を多様な動物モデルにわたって解明することが期待されています。

好中球は、自然免疫応答において極めて重要な役割を果たす白血球の重要なサブセットを構成します。それらは、さまざまなプロテアーゼと抗菌ペプチドを含む多葉核および顆粒によって特徴付けられます1。好中球は、主に脱顆粒、食作用、およびNETの形成によって機能します。NETの観察は、1996年に武井らによって、好中球を酢酸ホルボール(PMA)で刺激する実験で初めて行われました2。その後、NETの形成過程は、2004年にBrinkmannらによって「NETosis」と命名されました3。彼らの研究は、好中球を介した抗菌反応におけるNETの重要な役割をさらに明らかにしました。NETは、クロマチン、ヒストン、抗菌タンパク質で構成されるウェブ状の構造で、感染性および炎症性の刺激に応答して活性化好中球から放出されます。NETは、侵入した病原体を捕捉し、高濃度の抗菌ペプチドやプロテアーゼに曝露させることで、病原体を固定化して死滅させることができます1,3。さらに、NETはアポトーシス細胞のクリアランスに寄与し、炎症の解消に関与します。最近の研究では、NETの過剰な形成またはNET分解の障害は、組織損傷、自己免疫疾患、血栓形成、および血行再建術の障害につながる可能性があることも示されています4,5,6,7,8,9,10。
心筋梗塞後の制御不能な線維症および心室動脈瘤の形成におけるNETの病原性の役割は、血管周囲線維症の拡大を通じて実証されている4,11。心筋梗塞モデルとマウスの骨髄からの好中球の分離は、どちらも十分に確立されています。ヒトの血液に豊富に存在する白血球の一種である多形核(PMN)白血球は、ヒト好中球を分離するための優れた供給源として機能します。この方法により、骨髄を採取する必要がなくなるため、安全性と効率が向上します。
NETは、心臓リモデリングに関連する心房細動にも関与しています。しかし、マウスは、特定のイオンチャネルまたはシグナル伝達経路がノックダウンまたはノックアウトされない限り、リエントラントサイクルまたはAFモデルを確立するのに十分な大きさの心房を欠いているため、犬や豚などの大型動物が心房細動のモデル化に利用されました12。前述のように、ラットに心房細動を誘発し、ラットの末梢血から好中球を分離することは可能ですが、研究者は、末梢血から2 x 105-5 x 105 の好中球しか分離できないという制限に直面しました(ラットあたり10 mL)。各時点で十分なNETを抽出するには、約10〜25匹のラット(合計で5 x 106 の好中球)が必要であり、時間と費用がかかり、しばしば収率の低いプロセスになりました13。この点に関して、Li Heらは、ラットから適切なNETを得るための骨髄指向戦略を提示している14。この論文では、ラットの骨髄から好中球を単離する方法を包括的に説明し、ラットの末梢好中球と骨髄好中球の正味分泌能力を比較しています。概説した2つの方法は、異なる実験目標に対応しており、どちらも十分な量のラット骨髄好中球を得られると同時に、必要なラットの数を減らすことができます。2段階の単離法は優れた好中球精製を示し、1段階の分離法は許容可能な精製レベルで時間効率が良いことが証明されました。さらに、研究者らは、ラットの骨髄好中球とその末梢の対応物との間のNETosisとNET形成を比較し、PMNと同等の効力を発見しました。これらの知見は、心房細動の好中球関連研究に大きく貢献し、好中球分布の異なる様々な実験動物において、好中球分離のための異なる供給源を柔軟に選択することの重要性を強調しています。

<table><tbody><tr><td>A488-conjugated donkey anti-rabbit IgG(H + L)</td><td>Invitrogen, USA</td><td>A32790</td><td></td></tr><tr><td>A594-conjugated donkey anti-mouse IgG(H + L)</td><td>Invitrogen, USA</td><td>A32744</td><td></td></tr><tr><td>A594-conjugated goat anti-Mouse IgG1&nbsp;</td><td>Invitrogen, USA</td><td>A21125</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rat myeloperoxidase</td><td>Abcam, England</td><td>ab134132</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rat neutrophil elastase</td><td>Abcam, England</td><td>ab21595</td><td></td></tr><tr><td>Celigo Image Cytometer</td><td>Nexelom, USA</td><td>200-BFFL-5C</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma, USA</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>Gibco, USA</td><td>10099141C</td><td></td></tr><tr><td>ハンクs Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Gibco, USA</td><td>C14175500BT</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Thermofisher, USA</td><td>33342</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>RWD, China</td><td>R510-22-10</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol</td><td>Sigma, USA</td><td>81381</td><td></td></tr><tr><td>Normal Donkey Serum</td><td>Solarbio, China</td><td>SL050</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>biosharp, China</td><td>BL539A</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>ハイクロン、米国</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE、米国</td><td>P8370-1L</td><td></td></tr><tr><td>ホルボール 12-ミリスチン酸 13-アセテート (PMA)</td><td>シグマ、米国</td><td>&nbsp;P1585</td><td></td></tr><tr><td>Picogreen dsDNA Assay Kit</td><td>Invitrogen, USA</td><td>P11496</td><td></td></tr><tr><td>Rat neutrophil isolation kit</td><td>Solarbio, China</td><td>P9200</td><td></td></tr><tr><td>赤血球溶解バッファー</td><td>Solarbio, China</td><td>R1010</td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) media</td><td>Hyclone, USA</td><td>SH30809.01B</td><td></td></tr><tr><td>RWD Universal Animal Anesthesia Machine</td><td>RWD,中国</td><td>R500</td><td></td></tr><tr><td>Sprague Dawley(SD)ラット</td><td>Dashuo、中国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SytoxGreen</td><td>サーモフィッシャー、米国</td><td>S7020</td><td></td></tr><tr><td>Tris-EDTA(TE)バッファ</td><td>Solarbio、中国</td><td>T1120</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Biofroxx、ドイツ語</td><td>1139ML100</td><td></td></tr></tbody></table>

同等の容量を持つラット骨髄好中球を単離するためのユニークなアプローチ

Unique Approach for Isolating Rat Bone Marrow Neutrophils with Comparable Capacity

この研究の主な目的は、ラットの骨髄から好中球細胞外トラップ(NET)を単離するための信頼性が高く効率的なアプローチを開発することでした。この取り組みは、末梢血からNETを抽出する従来の方法に関連する制限、主に単離に利用できる好中球の不足のために生じました。この研究では、骨髄からラット好中球を得るための2つの異なる方法論が明らかになりました:満足のいく精製レベルをもたらす合理化された1ステップ手順と、精製効率の向上を示すより時間のかかる2ステッププロセス。重要なことは、どちらの技術も、ラットあたり5000万から1億の範囲のかなりの量の生存可能な好中球を産出したことです。この効率は、ヒトとマウスの両方の供給源から好中球を単離して得られた結果を反映しています。重要なことに、ラットの骨髄に由来する好中球は、末梢血から得られた好中球と比較して、NETを分泌する同等の能力を示しました。しかし、骨髄ベースの方法では、好中球とNETの両方が一貫して著しく大量に産生されました。このアプローチは、さらなる下流のアプリケーションのために、これらの細胞成分を大幅に大量に入手できる可能性を示しました。特に、これらの単離されたNETと好中球は、炎症、感染症、自己免疫疾患の領域にまたがるさまざまな用途に有望です。

本明細書で概説するプロトコールは、2つの異なる方法を示しており、それぞれが精製の改善または合理化されたステップを特徴としています。どちらの方法でも、ラットあたり約0.5 x 108-1 x 108 の好中球が得られました。アネキシンV-FITC/PIアポトーシス検出キットを用いたフローサイトメトリー解析では、マウスやヒトと同等の90%以上の細胞生存率を示しました(図1)。骨髄からの好中球単離ではリンパ球の汚染は避けられないと思われましたが、1ステップ法では50%であった純度レベルに対して、2ステップ法では90%という高い純度レベルを示しました(図2)。
末梢好中球と骨髄好中球の間で、PMA刺激に関係なく、NET分泌における同等の反応が認められました(図3)。さらに、ラットNET同士の架橋能力は限られていました(図4)。ラットNETosisのプロセスをより深く掘り下げるために、PMAが誘導剤として採用されました。NETはcfDNA染色 で 検出し、Cell Imaging Analyzerで包括的な画像を取得しました。特に、ラット好中球は、外部刺激がなくても、マウスおよびヒト好中球とは対照的に、自発的なNETosisの傾向が高かった。PMAとのインキュベーションにより、4時間後にcfDNA含量が10%増加しました(図5)。500 nM PMAにばく露すると、各ラットの骨髄は8-12 μg/mL NET-DNAの最終濃度を示した。注目すべきは、NETosis中にラット好中球で細胞内内容物が不完全に押し出されたため、多数の細胞内成分が観察されたことです。また、ラットNETは接着性が増強されたため、ガーゼ状の膜を形成する傾向を示し、独特の雲のような外観を示しました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65506/65506fig01.jpg"> 図1:骨髄単離による好中球生存率の評価。 ラット好中球単離の最適な供給源は骨髄であり、これによりその後の好中球細胞外トラップの獲得が容易になります。この図はHe et al.14から引用したものです。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65506/65506fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65506/65506fig02.jpg"> 図2:Wright-Giemsa染色 による 末梢血および骨髄からの好中球精製。 (A)末梢血の起源。(B)ワンステップ法 による 骨髄起源。(C)2段階法 による 骨髄起源。骨髄抽出は、ラットの好中球の単離とその後の好中球細胞外トラップの獲得のための好ましいアプローチとして機能します。スケールバー = 20 μm、倍率 = 400 倍。この図はHe et al.14から引用したものです。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65506/65506fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65506/65506fig03.jpg"> 図3:PMAまたはPMA + DNase Iとのインキュベーション時のNET分泌。 骨髄抽出は、ラットの好中球単離とその後の好中球細胞外トラップの収集に好ましい経路です。この図はHe et al.14から引用したものです。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65506/65506fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65506/65506fig04.jpg"> 図4:免疫蛍光分析。 核(青、 A)、MPO(緑、 B)、およびマージ画像(C)の免疫蛍光染色。NET:好中球細胞外トラップ;MPO:ミエロペルオキシダーゼ。骨髄抽出は、ラットの好中球の単離とその後の好中球細胞外トラップの収集に好まれる方法です。スケールバー=50μm、倍率=200倍この図はHe et al.14から引用したものです。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65506/65506fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65506/65506fig05.jpg"> 図5:様々な条件下での細胞イメージング分析装置 による cfDNAの包括的な分析。 cfDNA(緑)と核(青)の蛍光染色。骨髄抽出は、ラットの好中球の単離とそれに続く好中球細胞外トラップの収集のための主要なアプローチです。スケールバー = 500 μm。この図はHe et al.14から引用したものです。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65506/65506fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>

この研究では、ラットの骨髄から豊富な好中球細胞外トラップ(NET)を単離するための2つの技術について概説しています。1 つの方法は、市販の好中球分離キットと密度勾配遠心分離を組み合わせたもので、もう 1 つは密度勾配遠心分離のみを採用した方法です。どちらのアプローチも、末梢血好中球由来のNETを凌駕する機能的なNETを生成します。

The primary aim of this research was to develop a reliable and efficient approach for isolating neutrophil extracellular traps (NETs) from rat bone ...

ラット好中球を単離し、NETを抽出する方法を開発しました。この方法は、ラットとラット由来の細胞株の両方でNETs関連の実験を実施するためのアクセシビリティを最適化することを提供します。本研究では、末梢血から単離した好中球と骨髄糸を比較しました。我々の知見は、骨髄由来の好中球の優位性を強調し、単離された好中球数において、その熟練した同期能力とともに、数的優位性を示している。ラット好中球およびNETを単離するための骨髄ベースの方法は、これらの細胞タイプの単離技術を最適化することにより、研究のギャップを埋めます。主に末梢血を使用した以前の方法とは異なり、私たちのプロトコルは骨髄を標的とし、好中球を大量に増加させ、好中球とラットの生物学を研究するためのより正確なラットモデルを提供します。

unique-approach-for-isolating-rat-bone-marrow-neutrophils-with

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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機能研究のためのマウス骨髄好中球と養子移入実験の分離、精製とラベリング

ここでは、翻訳適用のために不均一な骨髄から大量のマウス単球を生成するプロトコルを紹介します。他の方法と比較して、この新しい方法は、高勾配磁気細胞分離(MACS)などの高価な方法を回避することにより、犠牲になる動物の数を減らし、コストを削減するのに役立ちます。...

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同等の容量を持つラット骨髄好中球を単離するためのユニークなアプローチ

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