Name: アシネトバクターバイオフィルムの定量化、生存率評価、可視化戦略 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-04T14:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: 学ぶAcinetobacterバイオフィルムの定量化と可視化手法。結晶紫染色、生存細胞計数、共焦点レーザー顕微鏡を用いて、異なる菌株間のバイオフィルム形成能の変動性を評価する方法を解説します。

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本研究は、韓国食品技術研究院(KFRI)の科学技術情報通信部(E0210702-03)主研究プログラムの支援を受けて行われました。

1.細菌接種物の調製
<ol><li>-80°Cで保存したグリセロールストックバイアルを取り出します。</li>
	<li>滅菌ピペットチップを使用してバイアルから細菌株(2〜10 μL)を除去します。. 注:アシネトバクター株、A. bouvetii(13-1-1)、A. junii(13-1-2)、A. pittii(13-2-5)、A. baumannii(13-2-9)、A. radioresistens (20-1)、およびA. ursingii(24-1)は、このプロトコルで使用されます。 </li>
	<li>市販の血液寒天プレート(5%羊の血液を添加したトリプシン大豆寒天、 材料表参照)に細菌を接種します。 注:栄養寒天やマッコンキー寒天などの他の培地も使用できます。</li>
	<li>断続的に燃え上がる滅菌ループを使用して寒天の表面を縞模様にして薄くします。</li>
	<li>寒天プレートを逆さまにしてインキュベーターに入れ、30°Cで一晩20〜24時間インキュベートします。</li>
	<li>滅菌針で細菌培養の単一コロニーを選別し、5 mLの滅菌脳心臓輸液ブロス(BHI、 材料表を参照)を培養液に接種します。</li>
	<li>接種した培養液を30°Cの振とうインキュベーターで一晩、約150rpmで20〜24時間インキュベートします。</li>
	<li>1 mLの一晩培養液を滅菌微量遠心チューブに移し、6,000 × g で室温(RT)で10分間、一晩培養液を遠心分離します。</li>
	<li>ピペットで上澄みを取り除きます。</li>
	<li>ボルテックスを使用して、ペレットを1 mLの滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に再懸濁します。</li>
	<li>室温で6,000 × g で10分間遠心分離し、上清を除去します。</li>
	<li>ペレットを滅菌した10倍希釈BHIに、600 nmで約0.1の光学濃度にボルテックスを使用して再懸濁します。 注:約0.1の光学濃度は、約107 CFU / mLに相当します。</li>
</ol>2. クリスタルバイオレットを用いたバイオフィルムの定量
<ol><li>滅菌ポリスチレン96ウェルプレート( 材料表参照)の各ウェルに200μLの接種物を追加し、最も外側のウェルのそれぞれに200μLの脱イオン水を加えて、内側のウェルが乾燥するのを防ぎます15。</li>
	<li>10倍希釈したBHIを200 μLをネガティブコントロールとして同じプレートの各ウェルに加えます。</li>
	<li>プレートを25°Cで24時間インキュベートします。</li>
	<li>ピペットで上澄みを取り除きます。 注:マルチチャンネルピペットは、多くの場合、複数のサンプルに便利です。</li>
	<li>各ウェルに300 μLのPBSを慎重に添加し、ピペットで上清を除去します。 注:マルチチャンネルピペットは、多くの場合、複数のサンプルに便利です。</li>
	<li>手順 2.5 をさらに 2 回繰り返します。</li>
	<li>200 μLのクリスタルバイオレット溶液(1%)( 材料表を参照)を各ウェルに加え、室温で30分間インキュベートします。</li>
	<li>手順2.4〜2.6を繰り返します。</li>
	<li>各ウェルに200 μLの無水エタノールを加え、室温で15分間インキュベートします。</li>
	<li>各ウェルから新しい 96 ウェルプレートに 100 μL の溶出液を移します。</li>
	<li>マイクロプレートリーダーを使用して595 nmでの吸光度を測定します( 材料表を参照)。</li>
	<li>吸光度が2.0を超える場合は、無水エタノールで2.0未満の吸光度にサンプルを適切に希釈し、ステップ2.11と同様に測定します。そして、観察値に希釈係数を掛けて試料の吸光度(最終値)を算出します。</li>
	<li>同じウェルプレート上の試験サンプルの各ウェルの値からネガティブコントロールの平均値を差し引いて、サンプルの真の吸光度を計算します。</li>
</ol>3. バイオフィルム生存率カウント
<ol><li>滅菌ポリスチレン製12ウェルプレート15の各ウェルに1mLの接種物(ステップ1)を添加する。プレートを25°Cで24時間インキュベートします。ピペットで上澄みを取り除きます。</li>
	<li>1.5 mLの滅菌PBSを各ウェルに慎重に添加し、ピペットで上清を除去します。各ウェルに滅菌PBSを1 mL添加します。</li>
	<li>取り付けられたセルスクレーパーを使用して、ウェルの底面と壁面をこすり落とします。</li>
	<li>回収した細胞懸濁液を、9 mLの生理食塩水(0.85% NaCl)と10〜20個のガラスビーズを含む滅菌プラスチックチューブ(10-1)に移します( 材料表を参照)。 注:ウェルの底面に残ったバイオフィルムの破片を回収するには、10-1 チューブから生理食塩水を使用してピペットで再懸濁し、移送することができます。</li>
	<li>10-1チューブを最大速度で60秒間ボルテックスします。</li>
	<li>10-7までの生理食塩水(0.85%NaCl)9 mLを含む次の滅菌チューブ(10-2)に1 mLを移して、10倍段階希釈します。</li>
	<li>各希釈液から100 μLをアシネトバクター寒天培地に広げ( 材料表を参照)、寒天プレートを30°Cで24〜42時間インキュベートします。</li>
	<li>各プレート上の典型的な赤いコロニーの数を10〜250の範囲で手動で数えます。</li>
	<li>以下の式を使用して、各ウェルのバイオフィルム内の生細胞の数を計算します。 生細胞 = コロニー数 × 希釈係数 × 10</li>
</ol>4. 共焦点レーザー走査型顕微鏡(CLSM)を用いたバイオフィルムの可視化
<ol><li>顕微鏡分析用の滅菌済み96ウェルプレートの各ウェルに200μLの接種物を加えます。</li>
	<li>プレートを25°Cで24時間インキュベートします。</li>
	<li>ピペットで上澄みを取り除きます。</li>
	<li>300 μLのろ過滅菌脱イオン水を各ウェルに慎重に加え、ピペットで上清を取り除きます。</li>
	<li>手順4.4を繰り返します。</li>
	<li>SYTO 9 とヨウ化プロピジウムの混合物( 材料表を参照)を、フィルター滅菌した脱イオン水でそれぞれ最終濃度 10 μM および 60 μM に希釈して調製します。</li>
	<li>混合物を200 μLの各ウェルに加え、暗所の室温でプレートを20〜30分間インキュベートします。</li>
	<li>手順4.3〜4.4を繰り返します</li>
	<li>励起波長488 nmと561 nm、発光波長範囲がそれぞれ499-535 nmと568-712 nmのCLSMを使用して、底面に付着したバイオフィルムを可視化します。</li>
</ol>

アシネトバクターのバイオフィルム形成の評価とバイオフィルムの特性評価

<ol><li>Wong, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+pathophysiological+overview+of+Acinetobacter+infections%3A+a+century+of+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Clinical and pathophysiological overview of Acinetobacter infections: a century of challenges.</a> Clinical Microbiology Reviews. 30 (1), 409-447 (2017).</li>
<li>Carvalheira, A., Silva, J., Teixeira, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acinetobacter+spp.+in+food+and+drinking+water+-+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Acinetobacter spp. in food and drinking water - A review.</a> Food Microbiology. 95, 103675(2021).</li>
<li>Towner, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acinetobacter%3A+an+old+friend%2C+but+a+new+enemy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hospital+Infection%22%5BJournal%5D)">Acinetobacter: an old friend, but a new enemy.</a> Journal of Hospital Infection. 73 (4), 355-363 (2009).</li>
<li>Weber, D. J., Rutala, W. A., Miller, M. B., Huslage, K., Sickbert-Bennett, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+hospital+surfaces+in+the+transmission+of+emerging+health+care-associated+pathogens%3A+Norovirus%2C+Clostridium+difficile%2C+and+Acinetobacter+species%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Infection+Control%22%5BJournal%5D)">Role of hospital surfaces in the transmission of emerging health care-associated pathogens: Norovirus, Clostridium difficile, and Acinetobacter species.</a> American Journal of Infection Control. 38 (5), S25-S33 (2010).</li>
<li>Flemming, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biofilm+matrix%3A+multitasking+in+a+shared+space%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The biofilm matrix: multitasking in a shared space.</a> Nature Reviews Microbiology. 21 (2), 70-86 (2023).</li>
<li>Flemming, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+an+emergent+form+of+bacterial+life%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Biofilms: an emergent form of bacterial life.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (9), 563-575 (2016).</li>
<li>Yin, W., Wang, Y., Liu, L., He, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+the+microbial+%26%2334%3Bprotective+clothing%26%2334%3B+in+extreme+environments%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Biofilms: the microbial &#34;protective clothing&#34; in extreme environments.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (14), 3423(2019).</li>
<li>Gedefie, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acinetobacter+baumannii+biofilm+formation+and+its+role+in+disease+pathogenesis%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+drug+resistance%22%5BJournal%5D)">Acinetobacter baumannii biofilm formation and its role in disease pathogenesis: a review.</a> Infection and drug resistance. 14, 3711-3719 (2021).</li>
<li>Whiteway, C., Breine, A., Philippe, C., Van der Henst, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acinetobacter+baumannii%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Acinetobacter baumannii.</a> Trends in Microbiology. 30 (2), 199-200 (2022).</li>
<li>Longo, F., Vuotto, C., Donelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+in+Acinetobacter+baumannii%5BTitle%5D)+AND+%22New+Microbiologica%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation in Acinetobacter baumannii.</a> New Microbiologica. 37 (2), 119-127 (2014).</li>
<li>Azeredo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+review+on+biofilm+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Critical review on biofilm methods.</a> Critical Reviews in Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).</li>
<li>Jia, J., Xue, X., Guan, Y., Fan, X., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+characteristics+and+transcriptomic+profiling+of+Acinetobacter+johnsonii+defines+signatures+for+planktonic+and+biofilm+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Research%22%5BJournal%5D)">Biofilm characteristics and transcriptomic profiling of Acinetobacter johnsonii defines signatures for planktonic and biofilm cells.</a> Environmental Research. 213, 113714(2022).</li>
<li>Yang, C., Su, P., Moi, S., Chuang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+in+Acinetobacter+baumannii%3A+genotype-phenotype+correlation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation in Acinetobacter baumannii: genotype-phenotype correlation.</a> Molecules. 24 (10), 1849(2019).</li>
<li>Alamri, A. M., Alsultan, A. A., Ansari, M. A., Alnimr, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm-formation+in+clonally+unrelated+multidrug-resistant+Acinetobacter+baumannii+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">Biofilm-formation in clonally unrelated multidrug-resistant Acinetobacter baumannii isolates.</a> Pathogens. 9 (8), 630(2020).</li>
<li>Lim, E. S., Nam, S. J., Koo, O. K., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+role+of+Acinetobacter+and+Bacillus+for+Escherichia+coli+O157%3AH7+in+biofilms+against+sodium+hypochlorite+and+extracellular+matrix-degrading+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Protective role of Acinetobacter and Bacillus for Escherichia coli O157:H7 in biofilms against sodium hypochlorite and extracellular matrix-degrading enzymes.</a> Food Microbiology. 109, 104125(2023).</li>
<li>Stepanović, S., Ćirković, I., Ranin, L., Svabić-Vlahović, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+by+Salmonella+spp.+and+Listeria+monocytogenes+on+plastic+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Letters+in+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation by Salmonella spp. and Listeria monocytogenes on plastic surface.</a> Letters in Applied Microbiology. 38 (5), 428-432 (2004).</li>
<li>Boone, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+virulence+phenotypes+and+antibiotic+resistance+in+clinical+strains+of+Acinetobacter+baumannii+isolated+in+Nashville%2C+Tennessee%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Analysis of virulence phenotypes and antibiotic resistance in clinical strains of Acinetobacter baumannii isolated in Nashville, Tennessee.</a> BMC Microbiology. 21 (1), 21(2021).</li>
<li>Otter, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface-attached+cells%2C+biofilms+and+biocide+susceptibility%3A+implications+for+hospital+cleaning+and+disinfection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hospital+Infection%22%5BJournal%5D)">Surface-attached cells, biofilms and biocide susceptibility: implications for hospital cleaning and disinfection.</a> Journal of Hospital Infection. 89 (1), 16-27 (2015).</li>
<li>Ravishankar, S., Juneja, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+or+resistance+responses+of+microorganisms+to+stresses+in+the+food+processing+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Stress+Adaptation+and+Food+Safety%22%5BJournal%5D)">Adaptation or resistance responses of microorganisms to stresses in the food processing environment.</a> Microbial Stress Adaptation and Food Safety. Yousef, A. E., Juneja, V. K. , (2003).</li>
<li>Dewanti, R., Wong, A. C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+culture+conditions+on+biofilm+formation+by+Escherichia+coli+O157%3AH7%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Food+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Influence of culture conditions on biofilm formation by Escherichia coli O157:H7.</a> International Journal of Food Microbiology. 26 (2), 147-164 (1995).</li>
<li>McConnell, M. J., Actis, L., Pachón, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acinetobacter+baumannii%3A+human+infections%2C+factors+contributing+to+pathogenesis+and+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Acinetobacter baumannii: human infections, factors contributing to pathogenesis and animal models.</a> FEMS Microbiology Reviews. 37 (2), 130-155 (2013).</li>
<li>McQueary, C. N., Actis, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acinetobacter+baumannii+biofilms%3A+variations+among+strains+and+correlations+with+other+cell+properties%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Acinetobacter baumannii biofilms: variations among strains and correlations with other cell properties.</a> The Journal of Microbiology. 49 (2), 243-250 (2011).</li>
</ol>

著者は何も開示していません。

記載されたプロトコルを使用して、さまざまな程度の アシネトバクター 分離株のバイオフィルム形成を測定、視覚化し、バイオフィルム内の生細胞を推定しました(図1、図 2、 および図3)。
このプロトコルでは、アシネトバクターの増殖に30°C、バイオフィルム形成に25°Cの2つの異なる温度を使用しました。30°Cが用いられたのは、多くの研究がアシネトバクターの最適な増殖のために30°C以上を使用したためであり、これは十分な接種菌を得るのに適切であろう12,13,14,17。ただし、この温度は一般に、病院の...

アシネトバクターは院内感染を引き起こすことが知られており、特に医療施設でのヒト感染の報告が増えています1。病院、医療施設、食品関連環境で広く普及しています2,3,4。ベッドの手すり、ベッドサイドテーブル、人工呼吸器の表面、シンク4などの病院の表面を含む環境で長期間生存できます。このような環境表面への残留性は、アシネトバクター4の院内感染に寄与する重要な要因の1つである可能性があります。
バイオフィルムは微生物の生命形態であり、生きた微生物細胞と細胞由来の細胞外高分子物質(EPS)で構成される微生物マトリックスである5。微生物細胞はマトリックスに埋め込まれており、多くの場合、熱、塩分、乾燥、抗生物質、消毒剤、せん断力などの環境ストレスに対して高い耐性があります6,7。
アシネトバクターは表面にバイオフィルムを形成する可能性があり、病院の表面を含む環境表面での生存期間の延長や、抗生物質治療に対する耐性の強化に寄与する可能性があることを示唆しています8,9。さらに、アシネトバクターのバイオフィルム形成は、ヒトの臨床転帰と大きく関連している可能性があります8。したがって、アシネトバクター株のバイオフィルム形成性は、環境生存とヒト感染を予測する際の指標の1つである可能性があります8,10。
表面に付着したバイオフィルムを定量化して可視化し、バイオフィルムの形成性を評価することができます。表面付着したバイオフィルムを定量するために、バイオフィルムは通常、クリスタルバイオレットなどのバイオフィルム染色色素で染色され、色素は溶液中で溶出し、光学濃度について測定されます11。バイオフィルムの可視化は、バイオフィルムの形成性を評価するためのもう一つの良いアプローチである11。蛍光色素を用いた特異性を用いた共焦点レーザー走査型顕微鏡(CLSM)可視化法は、SEM12,13などの他の技術と比較して、バイオフィルムの形態を特徴付けるのに有用である可能性があります。
バイオフィルム中の生細胞をカウントして、バイオフィルム中の生細胞の数を推定することができる11。バイオフィルムに埋め込まれた生細胞を剥離し、希釈し、寒天プレート上に広げ、インキュベートし、列挙します。細胞数が多いほど感染線量を満たす可能性が高いため、細胞数に関連する感染電位など、バイオフィルムに関するより詳細な情報を提供することができる13,14。
本稿では、(1)表面付着バイオフィルムの定量化、(2)バイオフィルム中の生細胞のカウント、(3) アシネトバクターのCLSMを用いたバイオフィルムの可視化のプロトコールを段階的に紹介します。提示されたプロトコルは、 アシネトバクター 分離株のバイオフィルム形成性を評価し、それらのバイオフィルムを特徴付ける方法を説明しています。

<table><tbody><tr><td>96ウェル細胞培養プレート</td><td>SPL</td><td>30096</td><td>ポリスチレン 96ウェルプレート</td></tr><tr><td>BHI (Brain Heart Infusion) ブロス</td><td>Merck KGaA</td><td>1.10493.0500</td><td></td></tr><tr><td>血液寒天培地 ベースプレート</td><td>KisanBio</td><td>MB-B1005-P50</td><td>アシネトバクター用増殖培地</td></tr><tr><td>CHROMagar アシネトバクター</td><td>CHROMagar</td><td>AC092</td><td>アシネトバクター用選択プレート</td></tr><tr><td>クリスタルバイオレットsolution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V5265</td><td></td></tr><tr><td>Filmtracer LIVE/DEAD biofilm viability kit</td><td>Invitrogen</td><td>L10316</td><td>SYTO9 and propidium iodide</td></tr><tr><td>Microplate reader</td><td>Tecan</td><td>Infinite M200 PRO NanoQuant Biofilm</td><td>measurement</td></tr><tr><td>RBC Glass Plating Beads</td><td>RBC</td><td>RG001</td><td>Glass beads</td></tr><tr><td>&mu;-Plate 96 Well Black</td><td>ibidi</td><td>89621</td><td>CLSM用のマイクロプレート</td></tr></tbody></table>

アシネトバクターバイオフィルムの定量化、生存率評価、可視化戦略

Quantification, Viability Assessment, and Visualization Strategies for Acinetobacter Biofilms

アシネトバクター は院内感染を引き起こし、そのバイオフィルム形成は病院環境などの乾燥した表面での生存に寄与する可能性があります。したがって、バイオフィルムの定量化と可視化は、 アシネトバクター 株が院内感染を引き起こす可能性を評価するための重要な方法です。マイクロプレートの表面に形成されるバイオフィルムは、体積と細胞数で定量化できます。バイオフィルムの量は、クリスタルバイオレットを使用した染色、洗浄、エタノールによる脱色、およびマイクロプレートリーダーを使用した可溶化色素の測定によって定量化できます。バイオフィルムに埋め込まれた細胞の数を定量化するために、バイオフィルムを細胞スクレーパーを使用してスクラップし、生理食塩水で回収し、ガラスビーズの存在下で激しく攪拌し、アシネトバクター寒天培地に広げます。次に、プレートを30°Cで24〜42時間インキュベートします。インキュベーション後、赤いコロニーを列挙して、バイオフィルム内の細胞数を推定します。この実行可能な計数法は、混合種バイオフィルム中の アシネトバクター 細胞を計数するのにも有用です。 アシネトバクター のバイオフィルムは、蛍光色素を用いて可視化することができます。顕微鏡分析用に設計された市販のマイクロプレートを使用して、バイオフィルムを形成します。次に、底面に付着したバイオフィルムをSYTO9およびヨウ化プロピジウム色素で染色し、洗浄した後、共焦点レーザー走査型顕微鏡で可視化します。

プロトコールに従って、厨房の表面から単離された アシネトバクター 分離株のバイオフィルムをポリスチレン製の96ウェルプレート上に形成し、クリスタルバイオレットで染色し、色素をエタノールに可溶化し、バイオフィルムの質量を測定しました(図1)。バイオフィルムの数は、OD0.04から1.69の範囲で株によって大きく異なります(図1)。Stepanovićらによって確立された基準に基づいて16、 A. bouvetii を除くすべての分離株がバイオフィルムを形成しました。 A.放射性レジステンは 弱いバイオフィルムを形成した。A. junii と A. baumannii は中程度のバイオフィルムを形成し、A. pittii と A. ursingii は強いバイオフィルムを形成した。
バイオフィルム...

このプロトコルは Acinetobacterのbiofilmsのinoculum、水紫色の染料、biofilmsの生存可能な計算および視覚化を使用してmicrotitterの版のbiofilmの定量化の準備を記述する。

Acinetobacter causes nosocomial infections and its biofilm formation can contribute to the survival on dry surfaces such as hospital environments. Thus, ...

バイオフィルムは生きた微生物細胞で構成されており、表面から除去することは困難です。私たちの環境で一般的に見られるアシネトバクター株は、院内感染を引き起こし、表面にバイオフィルムを形成することも知られています。そこで、アシネトバクターバイオフィルムの定量化と可視化を両立させる手法の開発を目指しています。私たちのプロトコルは、アシネトバクターのバイオフィルムを定量化および視覚化するためのシンプルで簡単な方法を提供します。バイオフィルム内の生細胞数は、生菌数法を用いて定量化します。私たちの研究結果は、天然に存在するアシネトバクターベクター株がバイオフィルム形成に非常に多様な可能性を持っていることを明らかにしています。また、さまざまなバイオフィルム内に明確な形態学的違いが存在します。これにより、アシネトバクター株間でこのような大きなばらつきの原因に焦点を当てた研究への道が開かれました。

quantification-viability-assessment-visualization-strategies-for

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

出典:Tay, S. B.ら。工学的クォーラムクエンチングラクトナーゼを用いた病原性バイオフィルムの抗病原性破壊。 J. Vis.

病原性細菌における酵素誘発バイオフィルム抑制の定量化

バイオフィルム内の3つの細胞および細胞外成分の同時定量と比較のためのプロトコルが提示されます。この方法論には、共焦点レーザー走査型顕微鏡、バイオフィルム構造解析および視覚化ソフトウェア、および統計解析ソフトウェアの使用が含まれます。...

バイオフィルムの細胞内および細胞外成分の同時定量(英語)

この方法の論文の目的は、典型的にはヒト歯肉縁上の歯垢内で識別種を含む多種バイオフィルムの開発のための微小流体システムの使用を説明することである。バイオフィルムのアーキテクチャ、バイオフィルムの生存率、および文化に依存またはカルチャに依存しない解析が強調表示されるための収穫バイオフィルムへのアプローチを記述するための方法。...

ハイスループットの使用<em&gt;インビトロ</emオーラル多種バイオフィルムを開発するために&gt;マイクロ流体システム

この研究は、バイオフィルム阻害剤とそのBacillus...

研究のための方法論<em&gt; B。枯草菌</em小分子バイオフィルム阻害剤を特徴付けるためのモデルとしての&gt;バイオフィルム

このプロトコルは、成長し、質的に、共焦点顕微鏡および電子顕微鏡により真菌の菌糸上の細菌のバイオフィルムを分析するための新しい方法を説明しています。...

共焦点顕微鏡および電子顕微鏡を用いて糸状菌コロニー上の細菌のバイオフィルムの定性的マルチスケール解析のための新しい方法

このプロトコルは、スライドチャンバーモデルを使用して、宿主因子への曝露後のバイオフィルムの発達の可視化を説明しています。このモデルにより、バイオフィルムの現像を直接可視化するだけでなく、コンピュータソフトウェアプログラムを使用してバイオフィルムのパラメータを解析することができます。...

チェンカバーガラスモデルを用いたバイオフィルム開発に関する痰の効果を可視化

緑膿菌のバイオフィルム構造に対する抗菌薬による変化は、嚢胞性線維症および慢性肺感染症の患者から培養された臨床分離株によって異なります。共焦点顕微鏡法に続いて、COMSTATソフトウェアを使用して、個々の分離株のバイオフィルム構造(表面積、厚さ、バイオマスなど)の変動を定量化し、抗感染剤の有効性を評価できます。...

COMSTATソフトウェアを使用した In vitro バイオフィルムアーキテクチャに対する抗菌剤の影響の定量化

合成嚢胞性線維化痰培地(SCFM2)は、共焦点レーザー走査顕微鏡と蛍光活性化細胞選別の両方と組み合わせて利用して、細菌凝集体を高分解能で観察することができる。本論文では、将来の研究のためのプラットフォームとして抗菌治療中の集団を評価する方法を詳述する。...

緑膿菌感染モデルのリアルタイム評価ツール

このプロトコルは、酪農産業におけるバイオフィルムを根絶するための有機ペルオキシ酸の有効性を評価するための静的方法と動的方法を組み合わせたアプローチについて説明しています。このアプローチは、バイオフィルムを制御するための新しい生物学的または化学的製剤の有効性を試験するためにも使用され得る。...

静的法と動的法を組み合わせたアプローチによる有機ペルオキシ酸の乳バイオフィルム根絶効果評価

このプロトコルは、結晶バイオレットバイオマスアッセイ、タイムラプス位相コントラスト動態、共焦点3D/マトリックスマッピング、SEM超微細構造、 生体内 ハムスター感染モジュールを組み合わせたモジュール型BSL-2ワークフローを提供し、 レプトスピラ...

レプトスピラバイオフィルムの定量的、構造的、機能的分析のためのモジュール式ワークフロー

学ぶAcinetobacterバイオフィルムの定量化と可視化手法。結晶紫染色、生存細胞計数、共焦点レーザー顕微鏡を用いて、異なる菌株間のバイオフィルム形成能の変動性を評価する方法を解説します。

アシネトバクターバイオフィルムの定量化、生存率評価、可視化戦略

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