Name: エクソソーム含有コラーゲンパッチとオフポンプ冠動脈バイパス移植による慢性心筋虚血の外科的ブタモデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-15T13:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 25 s
Description: 学ぶエクソソーム含有コラーゲンパッチとオフポンプ冠動脈バイパス移植による慢性心筋虚血の外科的ブタモデル。心機能の生理学的改善とミトコンドリア機能回復を評価する方法です。

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この研究は、米国(U.S.)のVA Merit Review #I01 BX000760(RFK)の支援を受けました。退役軍人省BLR&Dおよび米国退役軍人省助成金 #I01 BX004146(TAB)。また、ミネソタ大学リレヘイ心臓研究所の支援にも感謝します。この作業の内容は、米国政府の米国退役軍人省の見解を表すものではありません。

ミネアポリスVAメディカルセンターとミネソタ大学の動物実験委員会(IACUC)は、すべての動物実験を承認しました。実験動物の使用とケアに関する現在の国立衛生研究所(NIH)のガイドラインに従いました。
1. 間葉系幹細胞の単離とエクソソームの作製と特性評価
<ol><li>骨髄由来間葉系幹細胞(MSC)の単離<ol><li>生後20週齢の雌のヨークシャーランドレース豚の胸骨または脛骨から30〜50mLの無菌骨髄を採取します。これを行うには、25 mm 15G 骨間針を胸骨または脛骨に挿入し、10 mL のヘパリンを含む 60 mL シリンジにサンプルを引き出します。 注:骨髄の採取の詳細については、Pittenger et al.およびHocum-Stone et al.12,16を参照してください。</li>
		<li>簡単に言うと、骨髄標本をヘパリンを含むVacutainer CPTチューブに通し、1800 x gで30分間通過させます。</li>
		<li>単核球を含むバフィーコートを取り除き、ハンクの平衡塩溶液で洗浄します。遠心分離により単核細胞をペレット化し、増殖培地(10%ウシ胎児血清[FBS])に再懸濁します。</li>
		<li>単核細胞を細胞培養フラスコに移し、接着増殖させます。付着性により、MSCを単核画分から単離します。</li>
		<li>24時間以内にすべての非MSCを洗浄し、組織培養フラスコにMSCの単層を残します。フローサイトメトリーによりMSC表現型を確認し、造血マーカーであるCD45の陰性、およびMSCのマーカーであるCD90およびCD105の陽性性を確認します。</li>
	</ol></li>
	<li>ブタ間葉系幹細胞からのエクソソームの調製と特性評価<ol><li>1 x 104 H9C2ラット心筋細胞を播種し、1x DMEM + 10% FBSおよび1x Pen/strepで培養します。2 x 104 ブタMSCを高度なDMEM + 5%FBSおよび1xペン/連鎖球菌で播種します。</li>
		<li>両方の細胞株が80%以上コンフルエントになったら、培地をエクソソーム枯渇H9C2およびMSC培地に交換します。</li>
		<li>H9C2心筋細胞を軽度の低酸素状態(1%O2 2で24時間)に曝露する。24時間後に低酸素状態からフラスコを取り出し、H9C2培地をピペットで取り出します。</li>
		<li>MSCフラスコからMSCメディアを取り出し、廃棄します。精製したH9C2培地をMSCフラスコに加えます。フラスコを正常酸素条件(5%CO2、20%O2、および37°C)で6時間インキュベートします。</li>
		<li>メーカーの指示に従い、全エキソソーム単離試薬を用いて、共培養したコンディショニング培地からエキソソームを抽出します。</li>
		<li>CD-63(1:1000)に対する抗体を持つ一般的なエキソソームタンパク質のウェスタンブロット検出により、エクソソームの同定を確認します17。</li>
		<li>ナノ粒子追跡分析(NTA)を実行して、エクソソームを定量化し、ナノ粒子のサイズとその分布を評価します。これを行うには、エクソソームの総タンパク質(50μg)を500μLのPBSに溶解し、ナノ粒子追跡分析装置を使用してエクソソームの濃度とサイズ分布を決定します。</li>
		<li>ナノ粒子追跡ソフトウェアを使用してデータを解析します。</li>
	</ol></li>
</ol>2.オフポンプ冠動脈バイパス移植手術
<ol><li>動物の準備<ol><li>手術予定日の3日前に動物(生後16週齢の雌のヨークシャーランドレース豚)の体重を量ります。手術前に動物を12時間絶食させ、絶食中に水にアクセスできるようにします。</li>
		<li>手術の2〜4時間前に筋肉内経路でブプレノルフィン0.18 mg / kgを投与します。.</li>
	</ol></li>
	<li>動物の誘導<ol><li>6.6 mg / kgのチレタミン-ゾラゼパム/キシラジンの筋肉内注射をして動物を鎮静させます。.</li>
		<li>顎の緊張を評価して適切な鎮静を確保するために15分間待ち、続いて22Gのカテーテルを中耳静脈に配置します。 注:耳の静脈が不十分な場合は、別の末梢静脈(すなわち、橈側静脈)が考慮される場合があります。</li>
		<li>眼科用軟膏を各眼に局所的に投与します。.全身麻酔を誘発するために、静脈内経路で1〜2 mg / kgのプロポフォールを投与します。.顎の緊張は麻酔の深さを最も確実に反映し、処置全体を通して評価する必要があります。</li>
		<li>適切なサイズの気管内チューブで動物を挿管します。</li>
	</ol></li>
	<li>手術<ol><li>外科的処置の準備のために動物の胸骨と鼠径部を剃ります。</li>
		<li>手術のために深い麻酔を維持するために、必要に応じて機械的換気を10〜15回/分、酸素1〜4 L / min、およびイソフルラン1.0〜3.0%に設定します。深い麻酔を確認するために、眼や顎の反射がないかどうかを確認します。</li>
		<li>動物の位置監視装置(心電図、潮汐終末CO2、心拍数、酸素飽和度、血圧、体温)。</li>
		<li>IVカテーテルを生理食塩水または乳酸リンガー溶液の袋に接続して、メンテナンス液を継続的に投与します。</li>
		<li>ポビドン、ヨウ素スクラブ、溶液3xを使用した無菌技術を使用して皮膚を準備し、適切な無菌性を確保し、手術部位感染のリスクを最小限に抑えます。</li>
		<li>不整脈を予防するために、血管内経路(負荷量2 mg / kgまたは50 mcg / kg / minの用量での連続注入)でリドカインを投与します。.</li>
		<li>動物を背側に配置し、滅菌タオルで覆います。</li>
		<li>セルディンガー法による動脈ライン留置のために左または右の大腿動脈を切断し、その後、手術時に継続的な血圧モニタリングのためにカテーテルをトランスデューサーに接続します。</li>
		<li>単極電気焼灼を使用して、胸骨切欠きから近位から遠位のキシフィス突起まで伸びる20cmの切開を行い、筋肉、皮下脂肪、結合組織の層を胸骨まで切開します。</li>
		<li>振動鋸を使用して胸骨正中切開術を行います。 注:標準的な鋸は、LADコンストリクターを配置するために行われた左開胸手術による以前の心膜癒着による心筋損傷のリスクが高いため、胸骨切開術の繰り返しには避けられます。</li>
		<li>ハサミを使って胸骨後板を分割します。縦隔を適切に視覚化するために、専用の胸部リトラクターを使用してください。</li>
		<li>単極電気焼灼またはメッツェンバウムのハサミを使用して癒着を解剖します。胸骨周囲の筋肉と脂肪を慎重に解剖して、左内乳腺動脈(LIMA)を露出させます。</li>
		<li>LIMAが胸骨縁の外側に露出したら、電気焼灼の先端で鈍い解剖を使用して胸壁から静かに分離します。LIMAをスケルトングラフトとして使用します。</li>
		<li>3番目の 肋間腔のレベルで解剖を開始します。最適な視覚化のために、左胸骨の境界を静かに上げます。</li>
		<li>外膜に穏やかな牽引力を使用して、LIMAの動脈枝と静脈枝を露出させます。ヘモクリップを使用して枝のLIMA側を切り取り、枝の胸壁側を焼灼します。 注意: LIMAのクリップを焼灼すると、導管が狭くなる可能性があるため、注意が必要です。</li>
		<li>LIMAの最初のセグメントが動員されたら、鎖骨下静脈のレベルに向かって近位に、LIMA分岐部まで遠位に解剖を続けます。</li>
		<li>解剖が終了したら、100〜300 U / kgの用量で静脈内経路でヘパリンを投与します。.ヘパリンを投与してから3分間待ちます。</li>
		<li>3分後、LIMA分岐のレベルの直前に、LIMAの遠位端をクリップし、導管を分割します。遠位端を無料の2-0シルク縫合糸タイで縫います。</li>
		<li>移植のために近位端を準備します。グラフトを数秒間出血させて、流れの質を目視で検査します。</li>
		<li>出血を避けるために、非外傷性ブルドッグクランプでLIMA導管の遠位端を静かにクランプします。逆T字型で心膜を開き、約5〜6cm切開します。心膜に3-0サイズの縫合糸を配置して、スリットの両側で牽引します。</li>
		<li>胸骨リトラクターに固定されているシリコンリトラクションテープと組織スタビライザーでLADを安定させます。狭窄の遠位にあるLAD動脈(収縮帯が原因)を11枚刃で切り取り、虹彩ハサミで伸ばします。</li>
		<li>適切なサイズの冠状動脈シャントをLADに配置します。オフポンプバイパス技術を使用して、7-0 の非吸収性縫合糸を実行して、LIMA から LAD への吻合を行います。LIMAのブルドッグオクルーダーを解放し、止血を確認します。</li>
	</ol></li>
	<li>間葉系幹細胞(MSC)由来エクソソームパッチの作製<ol><li>MSCからのエクソソームの単離に成功したら、約3 x 108 エクソソームを3 mLの生理食塩水に懸濁し、コラーゲンスポンジに加えます。</li>
		<li>3 mLのエクソソーム懸濁液を室温、約22°C、10分間加熱します。吸収性コラージュスポンジ2個(各1.27 cm x 2.54 cm)を中型のペトリ皿に入れます。</li>
		<li>18Gの針を刺した5 mLのシリンジを使用して、エキソソーム懸濁液を穏やかに混合します。1.5 mLの懸濁液を各コラーゲンスポンジにゆっくりとピペットで移し、完全に吸収されるまで5分間待ちます。</li>
	</ol></li>
	<li>エクソソームパッチの配置<ol><li>エクソソームを含んだスポンジを、LADの分布における前中隔領域の心外膜である心臓の冬眠領域に逆さまに置きます。</li>
		<li>心臓の冬眠領域を覆うように2つのスポンジをそっと置きます。3.5cm×1.0cmのポリグラクチンメッシュを1枚使用して、各コラーゲンスポンジを覆います。</li>
		<li>メッシュを心外膜に細かい7-0の断続縫合糸で縫い付けます。</li>
	</ol></li>
	<li>胸部チューブ留置術<ol><li>胸骨切開の下側付近の別の刺し傷切開部に胸部チューブを留置します。胸腔チューブを心臓の前方に慎重に置きます。</li>
		<li>チューブが所定の位置に収まったら、水平マットレスステッチを使用して3-0縫合糸で巾着糸を置き、チューブを取り外すときに傷口を閉鎖できるようにします。</li>
		<li>胸部チューブは、胸部が完全に閉じるまで維持されます。</li>
	</ol></li>
	<li>胸部閉鎖<ol><li>胸骨を非吸収性縫合糸で8の字型パターンで近似します。切開の全長に沿って筋肉内経路で1 mg / kgのブピバカインを投与します。 注:MRI画像との干渉を避けるために、ワイヤーではなく縫合糸が使用されます。</li>
		<li>筋肉と皮膚の層を、それぞれ2-0と3-0の吸収性縫合糸を使用して標準的な方法で閉じます。</li>
		<li>息を止めて吸引し、胸腔からすべての空気を排出します。人工呼吸器の気道内圧を注意深く監視し、圧力を15〜22 mmHgに維持し、完了したら解放します。.</li>
		<li>すべての空気が排出されたら、巾着縫合糸を使用して傷口を閉じながら胸腔チューブを取り外します。胸骨切開部を覆うために局所的に接着剤を塗布します。</li>
	</ol></li>
	<li>術後のケア<ol><li>皮膚の切開が閉じられている間、動物を人工呼吸器から徐々に引き離します。動物を麻酔装置から外す前に、動物が自発的に呼吸し、反射を保護することができることを確認してください。</li>
		<li>気管内チューブは、動物が気道を保護できることを確認してから取り外します。手術部位の感染を最小限に抑えるために、抗生物質軟膏を埋め込んだ無菌および非接着性包帯で皮膚切開部を覆います。</li>
		<li>動物が補助なしでその位置を維持できるようになるまで、心拍数、呼吸数、体温などのバイタルサインを15分ごとに監視し続けます。</li>
		<li>頭を持ち上げて持ち上げることができ、介助なしで立つことができるようになるまで、動物が放置されないようにしてください。動物を回収ユニットに輸送する前に、皮下経路で0.2 mg / kgの用量でメロキシカムを投与します。.</li>
		<li>動物が安定しているときに、動物を回収ユニットに輸送します。術後3日目まで切開部位のドレッシングを保管してください。ドレッシングが汚れた場合は交換してください。</li>
		<li>手術後の最初の5日間は、動物の痛み、皮膚切開、および全体的な健康状態のレベルを引き続き監視します。突発性疼痛のために、必要に応じてメロキシカムの半分の用量(0.1 mg / kg)を1日1回投与します。.</li>
		<li>手術後最初の5日間は、切開部位が治癒するまでの間、他の動物による手術部位感染のリスクを減らすために、動物を1人で飼育します。5日後に動物をグループハウスに戻します。</li>
		<li>合併症や動物の状態の変化(発熱、腹水、体重減少、食欲不振など)があれば、獣医師または適切なスタッフに報告してください。</li>
	</ol></li>
</ol>3. 大腿骨アクセスを用いた冠動脈造影
<ol><li>背側横臥の手術台に動物を固定します。毎分10〜15回の呼吸で機械的換気を開始します。必要に応じて、酸素を2〜4 L / min、イソフルランを1%と4%に設定して、麻酔の深い平面を維持します。.</li>
	<li>心電図リードを動物の手足に置き、心拍リズムを監視します。麻酔の深さについて動物を評価します。目や顎の反射がないときに深く麻酔をかけられた動物を考えてみましょう。</li>
	<li>胸と首の部分をポビドンヨードスクラブできれいにしてから、動物をタオルで覆います。</li>
	<li>外科的切除によって大腿動脈にアクセスし、大腿動脈と静脈を露出させます。大腿動脈に11番の刃で1〜2mmの縦方向に切開し、血管内腔に11Frイントロデューサーシースを使用して動脈をカニューレ挿入します。</li>
	<li>アクセスを取得した後、カテーテルを進めて冠動脈造影を行い、LIMA-LAD移植片の解剖学的開存性を評価します。</li>
</ol>

補助的エクソソーム療法:CABG手術後の心筋回復の促進

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<li>Gallet, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+secreted+by+cardiosphere-derived+cells+reduce+scarring%2C+attenuate+adverse+remodelling%2C+and+improve+function+in+acute+and+chronic+porcine+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Exosomes secreted by cardiosphere-derived cells reduce scarring, attenuate adverse remodelling, and improve function in acute and chronic porcine myocardial infarction.</a> European Heart Journal. 38 (3), 201-211 (2017).</li>
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著者は何も開示していません。

本研究は、慢性虚血性心筋の初めてのブタモデルを提示し、外科的血行再建術中にMSC由来のエクソソームを含むコラーゲンパッチによる治療が、ミトコンドリアの回復を標的とすることにより、異方性刺激時に拡張期および収縮期機能が回復することを示しました。以前、HIBの大型動物モデルでは、心臓MRIで測定された拡張期および収縮期機能は損なわれたままであり、完全に回復することなく血行再建術でわずかに改善するだけであることが実証されました6,19。機能障害は、左心室駆出率が維持されているにもかかわらず発生しました。.これらの所見は、左心室機能が維持された単一血管領域の慢性虚血性心筋患者に見られる臨床経験を正確に模倣しています。
血行再建術中、特に以前の開胸術の設定では、いくつかの重要かつ技術的な課題があります。胸骨への入口での心血管損傷は、心膜がすでに破られており、癒着が存在する可能性があるため、リスクです。胸骨切開術は、胸骨への接近または付着により心臓損傷を引き起こす可能性がありま...

世界的に、重度のCADは1億人以上の患者が罹患しており、死亡率は低下していますが、依然として主要な死因の1つです1,2。CADには、心筋梗塞(MI)から生存率が保たれた虚血まで、幅広い臨床スペクトルがあります。ほとんどの前臨床研究は、小動物モデルと大動物モデルで研究できるため、梗塞組織の存在を特徴とする心筋梗塞に焦点を当てています。ただし、そのモデルは、生存率が維持され、血行再建術に適している患者には対応していません。CABGを受けているほとんどの患者は、収縮予備能と生存率の変動を維持しながら、血液供給が減少し、機能が制限されています3。治療を行わないと、これらの患者は、特に作業負荷の増加時に、進行した心不全や突然死に進行する可能性があります4。これらの患者のうち、冠動脈バイパス術(CABG)は有効な治療法ですが、完全な機能回復には至らない可能性があります5。重要なことに、臨床転帰の悪化のマーカーである拡張期機能障害は、血行再建術後に回復せず、CABG 6,7 中の新しい補助療法の必要性を示唆しています。現在、心筋細胞を完全な機能能力に回復させるためにCABGで使用される臨床的に利用可能な補助介入はありません。これは、適切な血行再建術にもかかわらず、多くの患者が進行性心不全に進行することを考えると、大きな治療上のギャップです8。
臨床CADの経験を模倣するために、CABGに従順な慢性心筋虚血の革新的なブタモデルが作成されました9。ブタは心外膜橋の側副を持たないため、他の大型動物よりも心臓病の優れたモデルとなるため、LADの狭窄だけでは局所虚血を引き起こします10。この研究では、生後16週齢の雌のヨークシャーランドレース豚を使用しました。このモデルでは、左内乳腺動脈(LIMA)移植片を使用して、オフポンプCABGでLADを血行再建しました(補足表1)。経皮的冠動脈インターベンション(PCI)は、収縮器が硬い装置であるため、狭窄を開くことはできません。心臓磁気共鳴画像法(MRI)は、全体的および地域的な機能、冠状動脈の解剖学的構造、および組織の生存率を評価するために使用されます。心臓MRI分析では、ピーク充填率(PFR)を特徴とする拡張期機能が、CABG6にもかかわらず損なわれたままであることが示されました。拡張期機能障害のメカニズムは、CABG11の後も持続するHIBのミトコンドリア生体エネルギーとコラーゲン形成の障害に関連している可能性があります。
間葉系幹細胞(MSC)は、エキソソームを介して治療シグナル伝達を行い、CABG中に適用した場合に心筋の回復を改善します。このブタモデルと並行した in vitro試験では 、CABG中に心外膜MSCビクリルパッチを配置すると、ミトコンドリアのエネルギー代謝の重要な調節因子である主要なミトコンドリアタンパク質、すなわちPGC-1α12が増加し、収縮機能が回復することが示されました13。 in vitro モデルにより、ミトコンドリア機能障害に対する間葉系幹細胞のシグナル伝達メカニズムを調べることができました。エクソソームは、マイクロRNA(miRNA)14を含むタンパク質または核酸を含む分泌安定性のあるマイクロベシクル(50-150 nm)です。最近の in vitro データでは、MSC由来のエクソソームがミトコンドリア呼吸の回復に必要な重要なシグナル伝達機構であることが示唆されています。
幹細胞由来のエクソソームは、容易に入手でき、商業的に生産でき、倫理的な対立がないため、有望な補助治療薬です。臨床翻訳を考慮し、MSC由来のエクソソームを包埋したコラーゲンパッチを作製し、心筋の冬眠領域に外科的に縫合できるようにしました。このパッチを用いてエクソソームの持続的な送達が可能であることが実証され、ミトコンドリアの回復を標的とし、ミトコンドリアの生合成を促進するパラクリンシグナル伝達機構を備えた無細胞再生療法が提供されることが実証された15。この手順は、ミトコンドリア機能を強化し、血行再建術時の炎症を軽減し、慢性虚血への筋細胞の適応を逆転させることによって心機能を改善するためのMSC由来の治療法の影響を研究するための前臨床モデルを提供します。
この研究では、CAD患者の標準治療を模倣した近位LAD狭窄の領域をバイパスするために、LIMAからLADへの吻合を使用してオフポンプCABGの外科的方法が示されています。CABGの併用療法として、MSC由来のエクソソーム包埋コラーゲンパッチを心筋虚血領域に外科的に適用することが実証されました。この手術モデルは、エクソソームパッチの使用で見られるパラクリン効果に対する生理学的反応と、回復の分子メカニズムを研究するために使用できます。

<table><tbody><tr><td>5 Ethibond</td><td>Ethicon</td><td>MG46G</td><td>Suture</td></tr><tr><td># 40 クリッパーブレード</td><td>Oster</td><td>078919-016-701</td><td>手術部位から脱毛</td></tr><tr><td>0 Vicryl</td><td>Ethicon</td><td>J208H</td><td>縫合糸</td></tr><tr><td>1 mL シリンジ</td><td>Medtronic/Covidien</td><td>1188100777</td><td>注射剤の投与</td></tr><tr><td>1 インチ医療用テープ</td><td>Medline</td><td>MMM15271Z</td><td>傷口を固定ドレッシングおよびIVカテーテル</td></tr><tr><td>1000mL 0.9%塩化ナトリウム</td><td>Baxter</td><td>2B1324X</td><td>IV補充液</td></tr><tr><td>12mL シリンジ</td><td>Medtronic/Covidien</td><td>8881512878</td><td>注射剤の投与</td></tr><tr><td>18 ga</td>針 <td>BD</td><td>305185</td><td>注射剤の投与</td></tr><tr><td>20 ga 針</td><td>BD</td><td>305175</td><td>注射剤の投与</td></tr><tr><td>20 mLシリンジ</td><td>Medtronic/Covidien</td><td>8881520657</td><td>注射剤の投与</td></tr><tr><td>2-0 Vicryl</td><td>Ethicon</td><td>J317H</td><td>縫合糸</td></tr><tr><td>250 mL 0.9% 生理食塩水</td><td>Baxter</td><td>&nbsp;UE1322D</td><td>交換用IV液</td></tr><tr><td>3 mL Syinge</td><td>Medtronic/Covidien</td><td>1180300555</td><td>注射剤の投与</td></tr><tr><td>3-0 Vicryl</td><td>Ethicon</td><td>VCP824G</td><td>Suture</td></tr><tr><td>36"圧力監視チューブ</td><td>Smith's Medical</td><td>MX563</td><td>Connectアート。ライン&nbsp;to トランスデューサ</td></tr>ー <tr><td>内径 4.0 mm 内径気管</td>チューブ <td>Medline</td><td>DYND43040</td><td>冬眠のための気道確保</td></tr><tr><td>4-0 Tevdek II Strands</td><td>Deknatel</td><td>7-922</td><td>LAD 48インチの周りにコンストリクターを固定するための縫合</td></tr>糸<tr><td>圧力監視チューブ</td><td>Smith's Medical</td><td>MX564</td><td>Connectアート。ライン&nbsp;トランスデューサ</td></tr>ーへ <tr><td>500mL 0.9% 塩化ナトリウム</td><td>バクスター</td><td>2B1323Q</td><td>薬物送達、ブロワーにミストを提供 ミスター</td></tr><tr><td>6&nbsp; mL シリンジ</td><td>Medtronic/Covidien</td><td>1180600777</td><td>注射剤の投与</td></tr><tr><td>6.0 mm 内径 気管内チューブ</td><td>Mallinckrodt</td><td>86049</td><td>Revasc、MRI、および終了のための気道の確立</td></tr><tr><td>6.5 mm 内径 気管内チューブ</td><td>Medline</td><td>DYND43065</td><td>Revasc、MRI、ターミネーション</td></tr><tr><td>6インチ圧力チューブライン</td>の気道を確保 <td>Smith's Medical</td><td>MX560</td><td>骨髄採取</td></tr><tr><td>60 mL シリンジ</td><td>Medtronic/Covidien</td><td>8881560125</td><td>注射剤の投与</td></tr><tr><td>7.0 mm 内径 気管内チューブ</td><td>Medline</td><td>DYND43070</td><td>Revasc、MRI、および終了のための気道の確立</td></tr><tr><td>7-0 Prolene</td><td>Ethicon</td><td>M8702</td><td>縫合</td></tr>糸 <tr><td>Advanced DMEM (1X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12491023</td><td></td></tr><tr><td>アルコールプレップパッド</td><td>MedSource</td><td>MS-17402</td><td>皮膚消毒剤</td></tr><tr><td>アミコンウルトラ-15 遠心フィルターユニット</td><td>ミリポアシグマ</td><td>UFC910024</td><td></td></tr><tr><td>麻酔器</td><td>ドレーガー</td><td>ファビウス・トリオ</td><td>は全身麻酔を維持します</td></tr><tr><td>麻酔器+人工呼吸器</td><td>DREドレーガー-ファビウス・ティロ</td><td>DRE0603FT</td><td>患者</td></tr><tr>に酸素と吸入剤を届ける<td>麻酔モニター</td><td>Phillips&nbsp;Intellivue</td><td>MP70</td><td>患者の安全のためのマルチパラメータ</td></tr><tr><td>動脈ラインキット</td><td>Arrow</td><td>ASK-04510-HF</td><td>血圧モニタリング用大腿骨カテーテル</td></tr><tr><td>人工涙液</td><td>ラグビー</td><td>0536-1086-91</td><td>角膜の乾燥を防ぐために目を滑らかにする</td></tr><tr><td>ベアハガー</td><td>3M</td><td>モデル505</td><td>患者加温システム</td></tr><tr><td>ベーシックパック</td><td>メドライン</td><td>DYNJP1000</td><td>滅菌ドレープとテーブルカバー</td></tr><tr><td>採血チューブ-グリーントップ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>02-689-7</td><td>マイクロスフィア血液サンプルの収集</td></tr><tr><td>ブロワー ミスターキット</td><td>メドトロニック/コヴィディエン</td><td>22120</td><td>血管吻合のための手術野をクリア</td></tr><tr><td>ボディピーTRセラミド</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>D7540</td><td></td></tr><tr><td>骨髄針-25mm 15 ga IO針</td><td>Vidacare</td><td>9001-VC-005</td><td>骨髄採取</td></tr><tr><td>骨蝋</td><td>メドライン</td><td>ETHW31G</td><td>切断骨の止血</td></tr><tr><td>ボビー焼灼ハンドピース</td><td>コヴィディエン</td><td>E2516</td><td>止血</td></tr><tr><td>ブピビカイン</td><td>ファイザー</td><td>00409-1161-01</td><td>局所麻酔薬</td></tr><tr><td>ブプレノルフィン 0.3 mg/mL</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>B9275</td><td>生存処置のための術前鎮痛薬</td></tr><tr><td>細胞スクレーパー</td><td>コーニング</td><td>353085</td><td></td></tr><tr><td>セファゾリン 1 グラム</td><td>ファイザー</td><td>00409-0805-01</td><td>抗生物質</td></tr><tr><td>胸部チューブ</td><td>Covidien</td><td>8888561043</td><td>胸腔から空気を排出します</td></tr><tr><td>クロロプレップ</td><td>ベクトン ディッケンソン</td><td>260815</td><td>外科用皮膚準備</td></tr><tr><td>CPT チューブ</td><td>BD</td><td>362753</td><td>骨髄からの</td></tr><tr><td>MSC 分離 デルリン コンストリクター</td><td>ミネソタ州立大学</td><td>オーダーメイド</td><td>LAD</td></tr><tr><td>Dermabond</td><td>Ethicon</td><td>DNX12</td><td>皮膚接着剤</td></tr><tr><td>DMEM (1X) ダルベッコの修正イーグルミディアム、HEPES</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>12430062</td><td></td></tr><tr><td>ドブタミン 12.5 mg/mL</td><td>ファイザー</td><td>00409-2344-01</td><td>2 番目のマイクロスフェア採血 ECG パッド中に血圧と心拍数を上昇させます</td></tr><tr><td></td><td>DRE</td><td>1496</td><td>モニター 心臓のリズム</td></tr><tr><td>エクソソーム枯渇 FBS</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>A2720801</td><td></td></tr><tr><td>ファルコン ディスポーザブル ポリスチレン セロジカル ピペット、滅菌、10mL</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>13-675-20</td><td></td></tr><tr><td>大腿骨および頸動脈イントロデューサー</td><td>Cordis- J&J</td><td>504606P</td><td>大腿骨および頸動脈カニューレ胎児</td></tr>ウ<tr><td>シ血清、熱不活性化、Gibco FBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>16140089</td><td></td></tr><tr><td>Flo-thru 1.0</td><td>Baxter</td><td>FT-12100</td><td>吻合に使用 LIMA から L</td></tr><tr><td>Flo-thru 1.25</td><td>Baxter</td><td>FT-12125</td><td>FT-12125</td></tr><tr><td>Flo-thru 1.5</td><td>Baxter</td><td>FT-12150</td><td>FT-12150</td></tr><tr><td>Flo-thru 2.0</td><td>バク</td><td>スターFT-12200</td><td>FT-12200</td></tr><tr><td>GlutaMAXサプリメント</td>サー<td>モフィッシャーサイエンティフィック</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>バリカン</td><td>オスター078566-011-002</td><td></td>手術<td>部位から髪の毛を取り除く</td></tr>ヘ<tr><td>リスタットコラーゲンスポンジ</td><td>マッケソン570973</td><td>1690ZZ</td><td>エキソソームを埋め込むためのスポンジヘ</td></tr><tr><td>パリン</td><td>ファイザー</td><td>&nbsp;0409-2720-03</td><td>抗凝集薬</td></tr><tr><td>組織学の瓶</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>316-154</td><td>組織サンプル用ホルマリン</td></tr><tr><td>HyClone 特徴付け ウシ胎児血清 (FBS)</td> <td>Cytiva</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Hypafix</td><td>BSN Medical</td><td>4210</td><td>安全な創傷被覆材とIVカテーテル</td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CDS019936</td><td>全身麻酔 - 吸入剤</td></tr><tr><td>ブロワー用IVチューブ ミ</td><td>スターCarefusion</td><td>42493E</td>は、<td>ブロワー/ミ</td></tr><tr><td>スターJelco 18 ga IVカテーテル</td>ス<td>ミス医療</td><td>4054</td><td>Revasc、MRIおよび用語</td></tr><tr><td>リドカイン</td>のIVアクセスに適応します 2%<td>ファイ</td><td>ザー00409-4277-01</td><td>局所麻酔薬/抗アレチミック</td></tr><tr><td>靭帯</td><td>エチコン</td><td>MSC20</td><td>LIMAテイクダウン用外科ステープル</td></tr><tr><td>ロングブレード喉頭鏡</td><td>DRE</td><td>12521</td><td>挿管のための気管の視覚化を可能にする</td></tr><tr><td>Meloxicam 5 mg/mL</td><td>Boehringer Ingelheim</td><td>141-219</td><td>術後鎮痛マイクロ</td></tr><tr><td>スフェアポンプ</td><td></td><td></td><td>大腿骨イントロデューサーから血液サンプルを採取</td></tr><tr><td>モノポーラ焼灼</td><td>Covidien</td><td>Valleylab&trade;FT10</td><td>止血</td></tr><tr><td>Nanosight NS 300</td><td>Malvern Panalytical</td><td>MAN0541-03-EN</td><td></td></tr><tr><td>NTA 3.1.54 ソフトウェア</td><td>Malvern Panalytical</td><td>MAN0520-01-EN-00</td><td></td></tr><tr><td>OPVAC Synergy II</td><td>テルモ 心臓血管系</td><td>401-230</td><td>心臓ポジショナーとスタビライザー</td></tr><tr><td>酸素タンク Eシリンダー</td><td>各種</td><td></td><td>麻酔器に補助流量計</td></tr><tr><td>PBS、pH 7.2</td>がない場合、ブロワーミスターに使用されます <td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>20012050</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン-ネオマイシン(PSN) 抗生物質混合物</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15640055</td><td></td></tr><tr><td>ピグテール145カテーテル 6 フレンチ</td><td>ボストンサイエンティフィック</td><td>08641-41</td><td>LV圧力の測定</td></tr><tr><td>圧力トランスデューサ</td><td>ー 様々</td><td>麻酔モニターに適応する必要があります</td><td>直接動脈圧を監視する</td></tr><tr><td>プロポフォール</td><td>ジプリバン</td><td>269-29</td><td>導入剤</td></tr><tr><td>ロンクロニウム</td><td>マイラン</td><td>67457-228-05</td><td>神経筋遮断剤</td></tr><tr><td>SR ブプレノルフィン 10 mg/mL</td><td>アボット ラボ</td><td>NADA 141-434</td><td>術後 鎮痛薬</td></tr><tr><td>滅菌生理食塩水 20 mL</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>20T700220</td><td>IVカテーテル用フラッシュ</td></tr><tr><td>胸骨のこぎり/剖検のこぎり</td><td>サーモフィッシャー</td><td>812822</td><td>胸腔を開くために使用されます</td></tr><tr><td>ストップコック ス</td><td>ミス</td>メディカル<td>MX5311L</td><td>2 豚の尾に接続するために</td></tr><tr><td>サクシニルコリン 20 mg/mL</td><td>ファイザー</td><td>00409-6629-02</td><td>神経筋遮断薬</td></tr><tr><td>吸引&nbsp; チューブ</td><td>メドライン</td><td>DYND50223</td><td></td></tr><tr><td>吸引容器</td><td>メドライン</td><td></td><td></td>DYNDCL03000</tr><tr><td>胸部リトラクター付き手術パック</td><td>各種</td><td>パックリストを見る</td><td>大腿骨のカットダウンと中央胸骨切開</td></tr>術 <tr><td>手術器具</td><td></td><td>各種パックリストを見る</td><td>大腿骨と頸動脈のカットダウンと胸骨切開</td></tr><tr><td>術 サージカルスプリングクリップ</td><td>アプライドメディカル</td><td>A1801</td><td>テイクダウン後のLIMAのクランプエンド</td></tr><tr><td>シリンジポンプ</td><td>ハーバード・</td><td></td><td>デリバリーズ IVドブタミン注入</td></tr><tr><td>SYTO RNASelect 緑色蛍光細胞染色 - DMSO</td><td>ミリポア シグマ</td><td>S32703</td><td></td></tr><tr><td>テラゾール 100 mg/mL</td><td>フォート ドッジ</td><td>01L60030</td><td>術前鎮静剤</td></tr><tr><td>Telpha パッド</td><td>Covidien</td><td>2132</td><td>滅菌創傷被覆</td></tr><tr><td>材 タイマー</td><td></td><td></td><td>血液サンプルの時間収集</td></tr><tr><td>総エキソソーム単離試薬 (細胞培養培地から)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4478359</td><td></td></tr><tr><td>TPP 組織培養フラスコ、T75、フィルターキャップ、0.22uM PTFE</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>TP90076</td><td></td></tr><tr><td>トリプル抗生物質軟膏</td><td>Johnson &ジョンソン</td><td>23734</td><td>局所上の創傷</td></tr><tr><td>Vicryl メッシュ</td><td>Ethicon</td><td>VKML</td><td>心外膜細胞アプリケーション用パッチ</td></tr><tr><td>ボルテックス</td><td></td><td></td><td>ミックス マイクロスフェア</td></tr><tr><td>キシラジン 100 mg/mL</td><td>Vedco</td><td>468RX</td><td>術前鎮静剤/鎮痛剤</td></tr></tbody></table>

エクソソーム含有コラーゲンパッチとオフポンプ冠動脈バイパス移植による慢性心筋虚血の外科的ブタモデル

Surgical Porcine Model of Chronic Myocardial Ischemia Treated by Exosome-laden Collagen Patch and Off-pump Coronary Artery Bypass Graft

進行性冠動脈狭窄症による慢性心筋虚血は、代謝活性を低下させることで酸素利用能の低下に適応する心筋として定義される冬眠心筋(HIB)を引き起こし、それによって不可逆的な心筋細胞の損傷や梗塞を防ぎます。これは心筋梗塞とは異なり、HIBは血行再建術で回復する可能性があります。重篤な冠動脈疾患(CAD)の患者は慢性虚血を経験し、心不全や突然死のリスクにさらされます。重症CADに対する標準的な外科的介入は冠動脈バイパス術(CABG)であるが、これは不完全な治療法であることが示されているが、慢性虚血に適応した筋細胞を回復するための補助療法は存在しない。 このギャップに対処するために、CABGに従順で臨床シナリオを模倣したブタを使用したHIBの外科モデルが使用されました。このモデルには2つの手術が含まれます。最初の手術では、左前下行動脈(LAD)に1.5mmの硬い収縮器を埋め込みます。動物が成長するにつれて、収縮筋は徐々に著しい狭窄を引き起こし、局所収縮機能が低下します。狭窄が80%に達すると、心筋の流れと機能が損なわれ、HIBが発生します。次に、左内乳腺動脈(LIMA)でオフポンプCABGを行い、虚血領域を血行再建します。動物は1ヶ月間回復し、犠牲になる前に最適な心筋の改善を可能にします。これにより、さまざまな治療群の生理学的および組織学的研究が可能になります。この動物モデルは、CABGにもかかわらず心機能が損なわれたままであることを示しており、新しい補助的介入の必要性を示唆しています。本研究では、間葉系幹細胞(MSC)由来のエクソソームを包埋したコラーゲンパッチを開発し、LIMA吻合の遠位にある心外膜表面に外科的に適用しました。この材料は心外膜に適合し、吸収性であり、シグナル伝達因子の持続的な放出のための足場を提供します。この再生療法は、血行再建術だけでは反応しない心筋の回復を促すことができます。このモデルは、HIBの回復に関する生理学的およびメカニズム的調査の手段を提供することにより、臨床分野に変換されます。

血行再建術後、冠動脈造影を実施して、LAD狭窄症(80%以上)とLIMA-LAD移植片の開存性を評価します(図1)。血行再建術とエクソソーム含有コラーゲンパッチの留置から4週間後、心臓MRIを実施して、安静時およびストレス下での心臓の収縮期および拡張期機能を評価します 5μg/kg/minの低用量ドブタミン注入を使用します。収縮期機能は、壁の厚さのパーセンテージ(収縮末期の壁の厚さ-拡張末期の壁の厚さ)を測定することによって分析されます。拡張期機能は、拡張期末期容積(PFR/EDV; 図2)。遅延造影検査を実施して、LAD領域に心筋梗塞がないことを確認しました。LAD領域に梗塞が存在する場合、それは収縮筋によって引き起こされる血栓症に続発する動脈の閉塞が原因である可能性があります。局所的な壁運動異常の欠如は、冬眠表現型の欠如を示しています。
低用量のドブタミン注入では、HIB動物は対照群と比較して、PFR / EDVによって測定された拡張期機能の有意な低下を示しま...

本研究では、進行性冠動脈狭窄症による慢性心筋虚血の外科的ブタモデルを提示し、梗塞を伴わずに心機能障害を呈する。虚血後、動物は、幹細胞由来のエキソソームを含むコラーゲンパッチの心外膜留置を伴うオフポンプ冠動脈バイパス移植を受けます。この補助療法は、心筋機能と回復を改善します。

Chronic myocardial ischemia resulting from progressive coronary artery stenosis leads to hibernating myocardium (HIB), defined as myocardium that adapts ...

この外科的処置の全体的な目標は、冠動脈血行再建術の外科的モデルを作成することです LIMAからLADバイパス、およびエクソソームを含むコラーゲンパッチを補助として使用して、心機能の生理学的改善を実証します。私たちの生体内モデルは、併存疾患を含まない単一血管モデルであり、多血管疾患の治療を受けている患者の典型的な臨床状況を代表するものではありません。しかし、この制限にもかかわらず、私たちのモデルは一貫して信頼できる結果を生み出し、低い死亡率を維持しています。私たちは、CABG中に使用される臨床的に関連する補助療法を開発し、慢性心筋虚血における心筋機能改善を促進する細胞メカニズムの理解を目指しています。虚血性組織の完全な回復は、ミトコンドリア機能の回復と炎症の軽減にかかっているようです。新しい研究分野を表しています。

surgical-porcine-model-chronic-myocardial-ischemia-treated-exosome

Research

JoVE Journal

Medicine

医学

このプロトコルは、地域の異常の結果、梗塞、冬眠の心筋層として知られているが発生しない慢性的な単一容器の虚血の外科大動物モデルを提示します。慢性虚血の確立、次の動物は、ポンプをリマ若者冠動脈バイパス術後虚血組織血行再建の適応と扱われます。...

冠動脈バイパス移植手術によって治療慢性心筋虚血の外科豚モデル

ここでは、新しい心保護戦略を研究するためにしっかりと確立され、利用されている正頭外核移植の前臨床大型動物(ブタ)モデルについて説明する。...

オルソトピック心臓移植の前臨床ブタモデル

このプロトコルでは、新規豚静脈バイパス移植は、心肺バイパスなしで左胸壁の小さな切開を通して行われました。術後病理検査を行い,内膜肥厚を認めた.

ブタ静脈移植病モデルの確立と評価

本プロトコルは、ブタモデルにおいて心活性治療薬を投与する3つの方法を記述する。雌の在来種豚は、(1)開胸術と経心的心内膜注射、(2)カテーテルベースの経心内膜注射、または(3)頸静脈浸透圧ミニポンプ による...

ブタ心筋梗塞モデルにおける心役活性治療薬の送達

外科手術による外傷、炎症反応を誘導する。サイトカイン、内因性リガンドは、虚血再灌流後に心筋梗塞サイズを調節することが知られています。我々は、開胸の影響を最小限に抑えるためにぶら下がって重みを使用してマウスの虚血再灌流の変更されたクローズド·胸のモデルを提示します。...

心筋虚血再灌流障害のマウスクローズド胸モデル

我々は、再現性を高めるために左前下行枝（LAD）に結紮の位置決めにおいてより明確にするために可能にするマウスモデルにおける心筋梗塞（MI）をシミュレートするための実験的虚血/再灌流（I / R）傷害を誘導するための外科的方法を紹介マウスでのMIの実験の。...

左前下の動脈の結紮を通して心筋虚血再灌流傷害のマウスモデル

この論文は、ブタのオフポンプ冠動脈バイパス術(OPCAB)モデルにおける新しい非閉塞性冠動脈吻合コネクターについて説明しています。この使いやすい冠状動脈コネクタは、低侵襲OPCAB手術を容易にする固有の可能性を秘めています。...

ブタオフポンプバイパスモデルで - トリニティクリップ - 小説レーザ支援冠動脈吻合コネクタの評価

心不全は入院の主な原因であり、主要な死亡原因です。マウスにおける左前下行冠動脈の永久結紮のモデルを適用して、心室リモデリングと心筋梗塞後の心機能障害を調査します。マウスにおける侵襲的血行動態測定の技術が提示されます。...

マウスの左前下冠動脈の動脈の常設ライゲーション：心筋梗塞後のリモデリングおよび心不全のモデル

このビデオは、ラットの静脈介在手術後の筋内膜過形成の発症を研究するモデルを示しています。...

静脈介在モデル：バイパスグラフト開存を研究するための適切なモデル

マウスモデルにおける左前下行動脈(LAD)結紮のための信頼性の高い方法を提供します。この方法は、気管内挿管、左側開胸術、胸腔穿刺術など、他の方法に比べて侵襲性が低いです。この方法は、急性心筋梗塞と慢性心筋梗塞(MI)の両方のモデルとして使用できます。...

マウス左前方降順（LAD）冠動脈結紮：心筋梗塞のための改善と簡略化されたモデル

学ぶエクソソーム含有コラーゲンパッチとオフポンプ冠動脈バイパス移植による慢性心筋虚血の外科的ブタモデル。心機能の生理学的改善とミトコンドリア機能回復を評価する方法です。

エクソソーム含有コラーゲンパッチとオフポンプ冠動脈バイパス移植による慢性心筋虚血の外科的ブタモデル

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