Name: 密度勾配遠心分離法を用いたヒト糞便からの細菌細胞外小胞の単離と精製(英語) (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: 学ぶ 密度勾配遠心分離法を用いたヒト糞便からの細菌細胞外小胞の単離と精製法。遠心時間を短縮し、リポタンパク質などの汚染物質からの分離効率を向上させる標準的なプロトコルを確立します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この研究は 、中国国家自然科学基金(82230080)の主要プロジェクトであるNational Science Fund for Distinguished Young Scholars(82025024)の支援を受けました。中国の国家重点研究開発プログラム(2021YFA1300604);中国国家自然科学基金会(81871735、82272438、82002245)広東省著名な若手学者のための広東省自然科学基金(2023B1515020058); 広東省自然科学財団(2021A1515011639); 中国山東省自然科学基金会の主要国家基礎研究開発プログラム(ZR2020ZD11) ポスドク科学財団(2022M720059);南方医科大学南方病院の優れた青少年育成スキーム(2022J001)。

微生物叢マルチオミクスのための細菌細胞外小胞の単離の強化

<ol><li>Costello, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+community+variation+in+human+body+habitats+across+space+and+time%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial community variation in human body habitats across space and time.</a> Science. 326 (5960), 1694-1697 (2009).</li>
<li>Greenhalgh, K., Meyer, K. M., Aagaard, K. M., Wilmes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+gut+microbiome+in+health%3A+establishment+and+resilience+of+microbiota+over+a+lifetime%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The human gut microbiome in health: establishment and resilience of microbiota over a lifetime.</a> Environmental Microbiology. 18 (7), 2103-2116 (2016).</li>
<li>de Vos, W. M., Tilg, H., Van Hul, M., Cani, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microbiome+and+health%3A+mechanistic+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Gut microbiome and health: mechanistic insights.</a> Gut. 71 (5), 1020-1032 (2022).</li>
<li>Zhou, P., Yang, D., Sun, D., Zhou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microbiome%3A+New+biomarkers+in+early+screening+of+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Laboratory+Analysis%22%5BJournal%5D)">Gut microbiome: New biomarkers in early screening of colorectal cancer.</a> Journal of Clinical Laboratory Analysis. 36 (5), 24359(2022).</li>
<li>Paik, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+gut+bacteria+produce+%CE%A4%28%CE%97%2917-modulating+bile+acid+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human gut bacteria produce Τ(Η)17-modulating bile acid metabolites.</a> Nature. 603 (7903), 907-912 (2022).</li>
<li>Parada Venegas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+chain+fatty+acids+%28SCFAs%29-mediated+gut+epithelial+and+immune+regulation+and+its+relevance+for+inflammatory+bowel+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Short chain fatty acids (SCFAs)-mediated gut epithelial and immune regulation and its relevance for inflammatory bowel diseases.</a> Frontiers in Immunology. 10, 277(2019).</li>
<li>Jiang, C., Li, G., Huang, P., Liu, Z., Zhao, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Gut+microbiota+and+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Alzheimer%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">The Gut microbiota and Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 58 (1), 1-15 (2017).</li>
<li>Morais, L. H., Schreiber, H. L. t, Mazmanian, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gut+microbiota-brain+axis+in+behaviour+and+brain+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The gut microbiota-brain axis in behaviour and brain disorders.</a> Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 241-255 (2021).</li>
<li>Kim, J. H., Lee, J., Park, J., Gho, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gram-negative+and+Gram-positive+bacterial+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Gram-negative and Gram-positive bacterial extracellular vesicles.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 40, 97-104 (2015).</li>
<li>Toyofuku, M., Nomura, N., Eberl, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Types+and+origins+of+bacterial+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Types and origins of bacterial membrane vesicles.</a> Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 13-24 (2019).</li>
<li>Xie, J., Li, Q., Haesebrouck, F., Van Hoecke, L., Vandenbroucke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tremendous+biomedical+potential+of+bacterial+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The tremendous biomedical potential of bacterial extracellular vesicles.</a> Trends in Biotechnology. 40 (10), 1173-1194 (2022).</li>
<li>Coumans, F. A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+guidelines+to+study+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Methodological guidelines to study extracellular vesicles.</a> Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).</li>
<li>Northrop-Albrecht, E. J., Taylor, W. R., Huang, B. Q., Kisiel, J. B., Lucien, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+extracellular+vesicle+isolation+methods+from+human+stool+supernatant%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Assessment of extracellular vesicle isolation methods from human stool supernatant.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 11 (4), 12208(2022).</li>
<li>Park, Y. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+changes+in+stool%2C+saliva%2C+serum%2C+and+urine+before+and+after+anti-TNF-%CE%B1+therapy+in+patients+with+inflammatory+bowel+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Microbial changes in stool, saliva, serum, and urine before and after anti-TNF-α therapy in patients with inflammatory bowel diseases.</a> Scientific Reports. 12 (1), 6359(2022).</li>
<li>Tulkens, J., De Wever, O., Hendrix, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+bacterial+extracellular+vesicles+in+human+body+fluids+by+orthogonal+biophysical+separation+and+biochemical+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Analyzing bacterial extracellular vesicles in human body fluids by orthogonal biophysical separation and biochemical characterization.</a> Nature Protocols. 15 (1), 40-67 (2020).</li>
<li>Tulkens, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+levels+of+systemic+LPS-positive+bacterial+extracellular+vesicles+in+patients+with+intestinal+barrier+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Increased levels of systemic LPS-positive bacterial extracellular vesicles in patients with intestinal barrier dysfunction.</a> Gut. 69 (1), 191-193 (2020).</li>
<li>Kang, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+derived+from+gut+microbiota%2C+especially+Akkermansia+muciniphila%2C+protect+the+progression+of+dextran+sulfate+sodium-induced+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles derived from gut microbiota, especially Akkermansia muciniphila, protect the progression of dextran sulfate sodium-induced colitis.</a> PloS one. 8 (10), 76520(2013).</li>
<li>Simonsen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+are+we+looking+at%3F+Extracellular+vesicles%2C+lipoproteins%2C+or+both%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">What are we looking at? Extracellular vesicles, lipoproteins, or both.</a> Circulation Research. 121 (8), 920-922 (2017).</li>
<li>Correll, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+small+extracellular+vesicle+isolation+from+expressed+prostatic+secretions+in+urine+for+in-depth+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Optimization of small extracellular vesicle isolation from expressed prostatic secretions in urine for in-depth proteomic analysis.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12184(2022).</li>
<li>Liang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+bacterial+extracellular+vesicles%3A+important+players+in+regulating+intestinal+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Microbes%22%5BJournal%5D)">Gut bacterial extracellular vesicles: important players in regulating intestinal microenvironment.</a> Gut Microbes. 14 (1), 2134689(2022).</li>
<li>Alberti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+derived+from+gut+microbiota+in+inflammatory+bowel+disease+and+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+papers+of+the+Medical+Faculty+of+the+University+Palacky%2C+Olomouc%2C+Czech+Republic%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles derived from gut microbiota in inflammatory bowel disease and colorectal cancer.</a> Biomedical papers of the Medical Faculty of the University Palacky, Olomouc, Czech Republic. 165 (3), 233-240 (2021).</li>
<li>Díez-Sainz, E., Milagro, F. I., Riezu-Boj, J. I., Lorente-Cebrián, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+gut+microbiota-derived+extracellular+vesicles+on+obesity+and+diabetes+and+their+potential+modulation+through+diet%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Effects of gut microbiota-derived extracellular vesicles on obesity and diabetes and their potential modulation through diet.</a> Journal of Physiology and Biochemistry. 78 (2), 485-499 (2022).</li>
<li>Lajqi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microbiota-derived+small+extracellular+vesicles+endorse+memory-like+inflammatory+responses+in+murine+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Gut microbiota-derived small extracellular vesicles endorse memory-like inflammatory responses in murine neutrophils.</a> Biomedicines. 10 (2), 442(2022).</li>
<li>Lee, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+vesicle+of+gut+microbial+Paenalcaligenes+hominis+is+a+risk+factor+for+vagus+nerve-mediated+cognitive+impairment%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">The extracellular vesicle of gut microbial Paenalcaligenes hominis is a risk factor for vagus nerve-mediated cognitive impairment.</a> Microbiome. 8 (1), 107(2020).</li>
<li>Villard, A., Boursier, J., Andriantsitohaina, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+and+eukaryotic+extracellular+vesicles+and+nonalcoholic+fatty+liver+disease%3A+new+players+in+the+gut-liver+axis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial and eukaryotic extracellular vesicles and nonalcoholic fatty liver disease: new players in the gut-liver axis.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 320 (4), G485-G495 (2021).</li>
<li>Wei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+membrane+vesicles+enhance+tau+phosphorylation+and+contribute+to+cognitive+impairment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Outer membrane vesicles enhance tau phosphorylation and contribute to cognitive impairment.</a> Journal of Cellular Physiology. 235 (5), 4843-4855 (2020).</li>
<li>Bitto, N. J., Kaparakis-Liaskos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+bacterial+membrane+vesicle+production%2C+purification%2C+quantification%2C+and+examination+of+their+immunogenic+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Methods of bacterial membrane vesicle production, purification, quantification, and examination of their immunogenic functions.</a> Methods in Molecular Biology. 2523, 43-61 (2022).</li>
<li>Stentz, R., Miquel-Clopés, A., Carding, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production%2C+isolation%2C+and+characterization+of+bioengineered+bacterial+extracellular+membrane+vesicles+derived+from+Bacteroides+thetaiotaomicron+and+their+use+in+vaccine+development%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Production, isolation, and characterization of bioengineered bacterial extracellular membrane vesicles derived from Bacteroides thetaiotaomicron and their use in vaccine development.</a> Methods in Molecular Biology. 2414, 171-190 (2022).</li>
<li>Zhang, Q., Jeppesen, D. K., Higginbotham, J. N., Franklin, J. L., Coffey, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+isolation+of+extracellular+vesicles+and+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Comprehensive isolation of extracellular vesicles and nanoparticles.</a> Nature Protocols. 18 (5), 1462-1487 (2023).</li>
<li>Iwai, K., Minamisawa, T., Suga, K., Yajima, Y., Shiba, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+salivary+extracellular+vesicles+by+iodixanol+density+gradient+ultracentrifugation+and+their+characterizations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Isolation of human salivary extracellular vesicles by iodixanol density gradient ultracentrifugation and their characterizations.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5, 30829(2016).</li>
<li>Vandeputte, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stool+consistency+is+strongly+associated+with+gut+microbiota+richness+and+composition%2C+enterotypes+and+bacterial+growth+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Stool consistency is strongly associated with gut microbiota richness and composition, enterotypes and bacterial growth rates.</a> Gut. 65 (1), 57-62 (2016).</li>
<li>Wen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+extracellular+vesicles%3A+A+position+paper+by+the+Microbial+Vesicles+Task+Force+of+the+Chinese+Society+of+Extracellular+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Interdisciplinary+Medicine%22%5BJournal%5D)">Bacterial extracellular vesicles: A position paper by the Microbial Vesicles Task Force of the Chinese Society of Extracellular Vesicles.</a> Interdisciplinary Medicine. 1, 12046(2023).</li>
</ol>

著者は、相反する利害関係がないことを宣言します。

細菌の細胞外小胞(BEV)は、細菌から分泌される脂質二重層ナノ粒子であり、タンパク質、脂質、核酸、その他の生理活性分子を豊富に含み、細菌の機能的効果の媒介に寄与する20。腸に由来するBEVは、炎症性腸疾患、クローン病、大腸がんなどの疾患の発症に関与し、一般的な代謝に影響を与え、認知機能障害を媒介することが確認されています4,16,17,20,21,22,23,24,25,26 </s...

腸は、人体で最も豊富な微生物群集を持つ器官として広く認識されており、細菌の90%以上がコロニー形成と増殖に関与しています1,2。腸内細菌叢は腸内微小環境を調節し、同時に主に腸管関門の障害を介して遠隔臓器の機能障害と相互作用することが広範な証拠によって実証されています3,4。腸内細菌叢の不均衡と炎症性腸疾患(IBD)の進行5,6、および腸脳軸を介した認知障害との相関関係を示す証拠が増えています5,6,7,8。細菌によって産生される細菌の細胞外小胞(BEV)は、これらの病理学的プロセスにおいて重要な役割を果たします。
BEVは、直径20〜400nmの細菌誘導体をカプセル化するナノスケールの粒子です。それらは、バクテリアとその宿主生物との間の相互作用を促進することが実証されています9,10。これらの粒子は目に見えないにもかかわらず、診断バイオマーカー、治療標的、薬物送達媒体として幅広い用途が期待されているため、研究者からの注目が高まっています11。主に腸内細菌を原料とするヒトの糞便は、BEV研究の生体試料としてよく使用され、水、細菌、脂質、タンパク質、未消化の食物残渣、剥離した上皮細胞などが複雑に混ざり合っています。複雑な糞便組成は、BEVの分離と純度に課題をもたらし、BEVの包括的、客観的、かつ現実的な分析を妨げています。したがって、汚染されたコンポーネントからの干渉を最小限に抑え、BEVの歩留まりを向上させるための効果的な戦略が、早急な対応を必要とする重要な問題として浮上しています。
既存の単離戦略は、超高速遠心分離(UC)、密度勾配遠心分離(DGC)、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)などの技術に大きく依存しています12,13,14,15,16,17。現在、DGCはBEV分離の分野で最も広く適用されている方法の1つであり、サンプルの初期ローディング位置によって決定される「トップダウン」と「ボトムアップ」の2つの沈降フローティングモードを包含しています。これらの方法論は、サイズと密度の格差に基づいて細胞外小胞(EV)を他の成分と区別し、さまざまな純度と回収率を生み出します。これまでの研究では、血液中のリポタンパク質18や尿中のTamm-Horsfallタンパク質19など、体液サンプル中の可溶性タンパク質からEVを適切に分離するには、シングルアプローチ戦略では不十分であることが示されています。さらに、真核生物の細胞外小胞(EEV)のサイズ分布はBEVのサイズ分布と重複することが多いため、BEVの収量を最適化するには、さらなる方法論的強化が必要です。したがって、BEVの研究を進めるには、効果的な分離および精製方法の開発にかかっています。特に、Tulkens et al 15 は、糞便 BEV を EEV から分離するために直交生物物理学的戦略を採用しており、ボトムアップ DGC モードの遠心分離時間は最大18 時間でした。対照的に、この試験では 7 時間に短縮され、グラジエント超遠心分離時間が大幅に短縮され、プロセスが簡素化されました。
本研究では、低速から超高速まで、さまざまな異なる遠心分離速度でBEVを濃縮した後、最適化された緩衝条件下で、2つのDGCモードを用いて糞便BEVを分離および精製しました。形態、粒子径、および濃度に基づく評価は、この強化された分析法による称賛に値する性能を示しました。この研究は、将来の研究の基盤となり、その応用範囲をより広い領域に拡大し、人体におけるBEVの不均一性に関する洞察を提供する可能性があります。また、BEVの分離・分析技術の標準化にも貢献します。

<table><tbody><tr><td>1 % (w/v) グルタルアルデヒド (脱イオン水中の 2.5 % ストック溶液から調製)</td><td>ACMEC</td><td>AP1126</td><td>ステップ 8.3.3 で TEM を使用した BEV の形態学的観察</td></tr><tr><td>1 % (w/v) メチルセルロース (脱イオン水中の元の粉末から調製)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7027</td><td>ステップ 8.3.6 で TEM を使用した BEV の形態学的観察</td></tr><tr><td>1.5 % (w/v) 酢酸ウラニル (脱イオン水中の元の粉末から調製)</td><td>Polysciences</td><td>21447-25</td><td>TEMを用いたBEVの形態学的観察 at Step 8.3.5</td></tr><tr><td>1000 &mu;L、200 &mu;L、10 &mu;L ピペット</td><td>KIRGEN</td><td>KG1313、KG1212、KG1011</td><td>溶液</td></tr><tr><td>5% (w/v) ウシ血清アルブミン溶液 (TBST バッファーの元の粉末から調製)</td> <td>Fdbio 科学</td><td>FD0030</td><td>ステップ8.5.6</td></tr><tr><td>5 &times; ローディングバッファー</td><td>Fdbio 科学</td><td>FD006</td> ステップ8.5.1 75 % (v/v) アルコール<td>でウェスタンブロッティングと Coomassie ブリリアントブルーステインで使用</td></tr><tr><td></td><td>LIRCON</td><td>LIRCON-500 mL</td><td>表面消毒</td></tr><tr><td>96ウェルプレート</td><td>Rar</td><td>A8096</td><td>吸光度値の測定&nbsp;</td></tr><tr><td>抗カルネキシン抗体</td><td>Abcam</td><td>ab92573</td><td>ウェスタンブロッティング (一次抗体)</td></tr><tr><td>抗CD63抗体</td><td>アブカム</td><td>ab134045</td><td>ウェスタンブロッティング (一次抗体)</td></tr><tr><td>抗CD9抗体</td><td>アブカム</td><td>ab236630</td><td>ウェスタンブロッティング (一次抗体)</td></tr><tr><td>抗フラジェリン抗体</td><td>Sino Biological</td><td>40067-MM06</td><td>ウェスタンブロッティング (一次抗体)</td></tr><tr><td>抗インテグリンβ 1抗体</td><td>アブカム</td><td>ab30394</td><td>ウェスタンブロッティング (一次抗体)</td></tr><tr><td>抗LPS抗体</td><td>サーモフィッシャー</td><td>MA1-83152</td><td>ウェスタンブロッティング (一次抗体)</td></tr><tr><td>抗LTA抗体</td><td>サーモフィッシャー&nbsp;</td><td>MA1-7402</td><td>ウェスタンブロッティング (一次抗体)</td></tr><tr><td>抗オンパ抗体</td><td>CUSABIO</td><td>CSB-PA359226ZA01EOD, https://www.cusabio.com/</td> <td>ウエスタンブロッティング (一次抗体)</td></tr><tr><td>抗シンテニン抗体</td><td></td><td>アブカム ab133267</td><td>ウェスタンブロッティング (一次抗体)</td></tr><tr><td>抗TSG101抗体</td><td>アブカム</td><td>ab125011</td><td>ウェスタンブロッティング (一次抗体)</td></tr><tr><td>オートクレーブ</td><td>ZEALWAY</td><td>GR110DP</td><td>実験で使用した消耗品および培地の滅菌</td></tr><tr><td>バランス</td><td>メトラー・トレド</td><td>AL104</td> PBSビシンコニン酸アッセイ<td>を充填したチューブサンプルのバランス&</td></tr><tr><td>nbsp;</td><td>Fdbio</td>科学<td>FD2001</td><td>ステップ8.2でBEVのタンパク質含有量を測定する</td></tr><tr><td>BioRender</td><td>BioRender</td><td>https://app.biorender.com</td><td>図1に示されているBEVの分離と精製の概略的なワークフローを作成します</td></tr><tr><td>バイオセーフティキャビネット</td><td>ハイアール</td><td>HR1200-II B2</td><td>糞便サンプルの取り扱いに関する手順を実行します</td></tr><tr><td>遠心分離機5810 R;ローター F-34-6-38</td><td>Eppendorf</td><td>5805000092; 5804727002, アダプター: 5804774000</td><td>BEVの前処理 (ステップ 3)</td></tr><tr><td>化学発光装置</td><td>BIO-OI</td><td>OI600SE-MF</td><td>ステップ8.5.12でのシグナル検出にウェスタンブロッティングに使用</td></tr><tr><td>Cytation 5</td><td>BioTek</td><td>F01</td><td>吸光度(ステップ8.1)と蛍光(図6)の値を測定するためのマイクロプレート検出器&nbsp;</td></tr><tr><td>Dil-labeled Low density lipoprotein</td><td>ACMEC</td><td>AC12038</td><td>干渉成分の分布の定義&nbsp;</td></tr><tr><td>電気泳動装置</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1658033</td><td>ステップ8.5.2、8.5.3、8.5.5でタンパク質の分離と転写のためのウェスタンブロッティングに使用されます</td></tr> 強化<tr><td>化学発光キットHRP&nbsp;</td><td>Fdbio science</td><td>FD8020</td><td>ステップ8.5.12</td></tr><tr><td>Escherichia coli&nbsp;</td><td>American Type Culture Collection</td><td>ATCC8739</td><td>ポジティブコントロールとしてBEVを分離します。プロトコル:LB粉末25gを1Lの脱イオン水とオートクレーブに溶解します。800 &mu; を転送します。培地に保存された大腸菌のL。37°Cで耕作します。インキュベーターシェーカーのC。次に、3, 000 &timesで遠心分離します。g 4 ° で 20 分間。C、12、000 &times;g 4 °C で 30 分間。C、上清を0.22&muでフィルタリングします。mの膜、および160、000 &timesで超高速遠心分離を行います。大腸菌由来の粗BEVと定義されるペレットを1.2mLのPBSに懸濁した(ステップ3、4)。&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>FALCON tubes 50 mL</td><td>KIRGEN</td><td>KG2811</td><td>Preprocess for BEVs (Step 3)</td></tr><tr><td>Feto Protein Staining Buffer</td><td>Absci</td><td>ab.001.50</td><td>Coomassie brilliant blue staining at Step 8.5.4</td></tr> Filter <tr><td>paper</td><td>Biosharp</td><td>BS-TFP-070B</td><td>Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3 (Blotting the solution)</td></tr><tr><td>Formvar/Carbon supported copper grids&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TEM-FCF200CU50</td><td>Step 8.3 HEPES</td></tr><tr><td>powder</td><td>Meilunbio</td><td>MB6078</td><td>密度勾配遠心分離のための異なる濃度のヨジオキサノール緩衝液の調製</td></tr><tr><td>HRP AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Fdbio science</td><td>FDM007</td><td>Western blotting (Secondary Antibody)</td></tr><tr><td>HRP AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Fdbioscience</td><td>FDR007</td><td>ウェスタンブロッティング(二次抗体)</td></tr><tr><td>インキュベータ</td>ーシェーカー <td>Qiangwen</td><td>DHZ-L</td><td>Cultivate Escherichia coli&nbsp;</td></tr><tr><td>キムワイプ&トレード;デリケートなタスクワイプ</td><td>Kimtech Science</td><td>34155</td><td>ステップ4.15で超遠心チューブの内壁を拭</td></tr>く <tr><td>LBブロス</td><td>Hopebio</td><td>HB0128</td> 大<td>腸菌を栽培する&nbsp;</td></tr><tr><td>低温冷凍庫(-80°C;C)</td><td>ハイアール</td><td>DW-86L338J</td>サンプル<td>を保管</td></tr>します <tr><td>メタノール</td><td>アラルディン</td><td>M116118</td><td>ステップ8.5.5でPVDF膜を活性化するためのウェスタンブロッティングで使用されます</td></tr><tr><td>マイクロチューブ 1.5 mL</td><td>KIRGEN</td><td>KG2211</td><td>密度勾配遠心分離後に画分を回復</td></tr><tr><td>マイクロチューブ 2 mL</td><td>KIRGEN</td><td>KG2911</td><td>密度勾配遠心分離後に画分を回復</td></tr> マイクロ<tr><td>チューブ 5 mL</td><td>BBI</td><td>F610888-0001</td><td>密度勾配遠心分離後のフラクション回収</td></tr><tr><td>マイクロプレートリーダー&nbsp;</td><td>サーモフィッシャー&nbsp;</td><td>Multiskan MK3</td><td>ステップ8.2</td></tr><tr><td>Milliporeフィルター0.22 &mu;m</td><td>メルクミリポア</td><td>SLGP033RB</td><td>ろ過滅菌;材料:ポリエーテルスルホン、PES</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>GHTECH</td><td>1.01307.040</td>密度<td>勾配遠心分離液</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>GHTECH</td><td>1.01394.068</td><td>密度勾配遠心分離液(pH調整)</td></tr><tr><td>Optima&trade;XPN-100</td><td>ベックマン・コールター</td><td>A94469</td> ステップ4、7 OptiPrep&trade<td>でのBEV分離用超遠心分離</td></tr><tr><td>;</td><td>Serumwerk Bernburg AG</td><td>1893</td><td>密度勾配遠心分離原液</td></tr><tr><td>オービタルシェーカー</td><td>Youning</td><td>CS-100</td><td>ステップ2で糞便を溶解</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>プロセル</td><td>PB180327</td><td>ステップ2で糞便を溶解</td></tr><tr><td>ピペッター</td> エ<td>ッペンドルフ</td><td>3120000267、3120000259</td><td>溶液を移送</td></tr><tr><td>プラスチックパスツールピペット</td><td>ABCbio</td><td>ABC217003-4</td>ステップ<td>3.4で前処理で上清を除去し</td></tr>ます <tr><td>ポリフッ化ビニリデン(PVDF)膜</td><td>ミリポア</td><td>ISEQ00010、IPVH00010</td><td>ステップ8.5.5でタンパク質転写のためのウェスタンブロッティングに使用されます</td></tr><tr><td>プレハブポリアクリルアミドゲル、4&ndash;20% 15ウェル</td><td>ACE</td><td>F15420ゲル</td><td>ステップ8.5.2、8.5.3でのタンパク質分離のためのウェスタンブロッティングに使用</td></tr><tr><td>一次抗体希釈液</td><td>Fdbio science</td><td>FD0040</td><td>ステップ8.5.8でウェスタンブロッティングに使用</td></tr><tr><td>タンパク質ラダー</td><td>Fdbio science</td><td>FD0672</td><td>ステップ8.5でウェスタンブロッティングとクーマシーブリリアントブルー染色に使用</td></tr><tr><td>ラピッドプロテインブロッティング溶液</td><td>UBIO</td><td>UW0500</td><td>ステップ8.5.5でのタンパク質転写のためのウェスタンブロッティングに使用</td></tr><tr><td>Rotor SW 32 Ti Swinging-Bucket Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>369650</td><td>ステップ4でのBEV単離のための超遠心分離、7</td></tr><tr><td>シリンジ 20 mL、50 mL&nbsp;</td><td>Jetway</td><td>ZSQ-20ML、YCXWJZSQ-50 mL</td><td>TBS粉末の前処理で上清を除去する転写バッファー</td></tr><tr><td></td><td>Fdbio science</td><td>FD1021</td><td>ステップ8.5でウェスタンブロッティングに使用</td></tr><tr><td>透過型電子顕微鏡(TEM)</td><td>日立製作所&nbsp;</td><td>H-7650</td><td>ステップ8.3でのBEVの形態学的観察</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fdbio science</td><td>FD0020</td><td>ステップ8.5でのウェスタンブロッティングに使用</td></tr><tr><td>超遠心チューブ</td><td>ベックマン</td><td>326823、ステップ</td><td>4、7でのBEVの分離のための355642超遠心分離</td></tr><tr><td>ウルトラクリーンベンチ</td><td>エアテック</td><td>SW-CJ-2FD</td><td>液体の取り扱いに関する手順を実行する</td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>ブルーパード</td><td>CU600</td><td>ステップ 8.2.5</td></tr><tr><td>ZetaView</td><td>Particle Metrix</td><td>S/N 21-734、ソフトウェア ZetaView (バージョン 8.05.14 SP7)</td> <td>で BEV の粒子サイズと濃度を測定するための BEV のタンパク質</td></tr>含有量の測定に使用 ステップ 8.4</tbody></table>

密度勾配遠心分離法を用いたヒト糞便からの細菌細胞外小胞の単離と精製(英語)

Isolation and Purification of Bacterial Extracellular Vesicles from Human Feces Using Density Gradient Centrifugation

細菌細胞外小胞(BEV)は、細菌由来のナノ小胞で、細菌間および細菌と宿主のコミュニケーションにおいて積極的な役割を果たし、親細菌から受け継いだタンパク質、脂質、核酸などの生理活性分子を輸送します。腸内細菌叢に由来するBEVは、消化管内で作用し、遠隔地の臓器に到達する可能性があるため、生理学や病理学に大きな影響を与えます。ヒトの糞便に由来するBEVの種類、量、役割を探る理論的研究は、腸内細菌叢からのBEVの分泌と機能を理解する上で非常に重要です。これらの調査では、BEVの分離と精製に関する現在の戦略の改善も必要になります。
この研究では、トップダウンとボトムアップの2つの密度勾配遠心分離(DGC)モードを確立することにより、BEVの分離および精製プロセスを最適化しました。BEVの濃縮分布は、フラクション6〜8(F6-F8)で決定されました。このアプローチの有効性は、粒子の形態、サイズ、濃度、およびタンパク質含有量に基づいて評価されました。粒子およびタンパク質の回収率を計算し、特定のマーカーの存在を分析して、2 つの DGC モードの回収率と純度を比較しました。その結果、トップダウン遠心分離モードの方が汚染レベルが低く、ボトムアップモードと同等の回収率と純度を達成していることが示されました。7時間の遠心分離時間は、糞便BEV濃度108/mgを達成するのに十分でした。
糞便とは別に、この方法は、成分と粘度の違いに応じて適切に変更することで、他の体液タイプに適用できます。結論として、この詳細で信頼性の高いプロトコルは、BEVの標準化された分離と精製を容易にし、その後のマルチオミクス分析と機能実験の基礎を築きます。

BEV富化画分の分布の決定 細菌の細胞外小胞(BEV)濃縮画分の分布を決定するために、外径 340 nm での吸光度値を測定するためのブランクコントロールを確立し、測定値とヨウジキサノールガイドラインに基づいて各画分の密度を計算しました(ステップ 8.1)。 表2 は密度の結果を示しており、フラクションF4〜F9が細胞外小胞に典型的に関連する範囲内の密度を示したことを示している。この発見は、BEVの大部分がこれらのフラクションで分離されていることを示唆しており、F4-F9をBEVの大まかな範囲として定義することにつながりました。透過型電子顕微鏡(TEM)を用いて、 図1 に示すようにフラクションF4-F9で単離された糞便BEVの形態学的特徴を特徴付けました。TEM画像(図2)からは、BEVの特徴である古典的なカップ状の構造が見られました。ナノ粒子追跡分析(NTA)とビシンコニン酸アッセイ(BCA)を実施して、それぞれ粒子数とタンパク質濃度を決定し...

本研究では、密度勾配遠心分離(DGC) により ヒトの糞便から濃縮した細菌の細胞外小胞(BEV)を単離・精製する方法を説明し、形態、粒子径、濃度からBEVの物理的特性を特定し、臨床研究および科学研究におけるDGCアプローチの潜在的な応用について議論します。

Bacterial extracellular vesicles (BEVs) are nanovesicles derived from bacteria that play an active role in bacteria-bacteria and bacteria-host ...

私たちの研究では、密度勾配遠心分離を使用して、物理学者から細菌の細胞外小胞を分離、精製、および特性評価します。私たちは、BEVと汚染物質の分離に取り組み、研究者に信頼できる方法を提供することを目指しています。当社のプロトコルにより、遠心分離時間が18時間から7時間に短縮されます。トップダウンモードは、BEVの分離を改善し、肝臓タンパク質からの汚染を低減します。私たちの方法は、BEVの分離を簡素化し、将来の研究の基準を設定します。これは、適切な修正を行うことで他の体液にも適用でき、人体に固有の不均一性を明らかにするBEVの理解を深め、研究を促進します。

isolation-purification-bacterial-extracellular-vesicles-from-human

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

出典: ワトソン、DC、 et.al。大腸菌と他の細菌からの細胞外小胞のスケーラブルな単離と精製 J. Vis. 経験。 (2021年)このビデオは、遺伝子組み換え細菌の外膜に由来する細胞外小胞(EV)の単離と濃縮を示しています。このプロセスには、細菌を培養して EV...

細菌からの外膜由来細胞外小胞の単離と濃縮

出典: ワトソン、DC 他。大腸菌と他の細菌からの細胞外小胞のスケーラブルな単離と精製 J. Vis. 経験。...

サイズ排除クロマトグラフィーを用いた細菌の細胞外小胞の単離 

このビデオは、特性評価研究に適した細胞外小胞の亜集団を分離するための密度勾配超遠心分離ベースの精製方法を示しています。...

細胞外小胞の亜集団の精製:密度勾配超遠心分離法を用いた細胞外小胞の亜集団の精製技術

このプロトコルは、EVの降水量、密度勾配超遠心分離、粒子捕捉を組み込むことにより、高効率で歩留まりのあるビリオンから離れた細胞外小胞(EV)を分離し、合理化されたワークフローと開始の削減を可能にします。すべてのEV研究で使用するための再現可能な準備をもたらす容積の条件。...

ウイルスから離れた高収率細胞外小胞製剤の精製

細菌は、生理活性のある生体分子を運ぶナノメートルサイズの細胞外小胞(EV)を分泌します。EVの研究は、それらの生合成、微生物-微生物および宿主-微生物の相互作用および疾患における役割、ならびにそれらの潜在的な治療用途を理解することに焦点を当てています。EV研究の標準化を促進するために、さまざまな細菌からEVをスケーラブルに分離するためのワークフローが提示されます。...

大腸菌およびその他の細菌からの細胞外小胞のスケーラブルな単離および精製(英語)

本プロトコールは、シアノバクテリア培養物からの細胞外小胞の単離、濃縮、および特性評価に関する詳細な説明を提供する。異なるスケールの培養物から小胞を精製するためのアプローチ、方法論間のトレードオフ、およびフィールドサンプルを扱うための考慮事項についても議論する。...

シアノバクテリア細胞外小胞の単離と特性評価

ここでのプロトコルは、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、細胞外小胞を馴化細胞培養培地から適切に分離できることを示しています。...

馴化細胞培養培地から細胞外小胞を分離するためのサイズ排除クロマトグラフィー(英語)

ヒト膵島の高品質と適切な量を達成することが成功した膵島移植のための著名な前提条件の一つです。修正された自動化された方法を使用して：このビデオでは、我々は人間の膵島の分離（ヒト膵島の精製と​​文化部II）の手順をステップバイステップで説明します。...

人間の膵島単離：パートII：ヒト膵島の精製と​​文化

我々は、精製のための塩化セシウム密度勾配遠心分離に続いて0.22μmのSterivexフィルタ、集中プランクトンのバイオマスからの高分子量のゲノムDNAの抽出のための方法を説明します。...

0.22μmのSterivexフィルタおよび塩化セシウム密度勾配遠心分離からのDNA抽出

これからアクティブ全長キネシンを分離するためのプロトコルです。...

キネシンの単離及び精製からショウジョウバエ胚

学ぶ 密度勾配遠心分離法を用いたヒト糞便からの細菌細胞外小胞の単離と精製法。遠心時間を短縮し、リポタンパク質などの汚染物質からの分離効率を向上させる標準的なプロトコルを確立します。

密度勾配遠心分離法を用いたヒト糞便からの細菌細胞外小胞の単離と精製(英語)

さらに動画を探す