Name: 意識のあるマウスにおける高血糖クランプと低血糖クランプ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-26T13:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: 学ぶ高血糖クランプと低血糖クランプを用いたマウスにおける脳による血糖調節メカニズムの解明。神経回路とネuropeptideの役割を探索し、インスリン感受性と分泌の評価方法を習得する。

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本研究は、文部科学省の卓越若手研究者先導的研究機構の支援を受けて行われました。a 科学研究費補助金基盤研究(B)(課題番号JP21H02352)国立研究開発法人日本医療研究開発機構(AMED-RPIME、グラント番号JP21gm6510009h0001、JP22gm6510009h9901);公益財団法人上原記念財団アステラス代謝障害研究財団;公益財団法人スズケン記念財団、公益財団法人秋山生命科学財団、公益財団法人成重神経科学研究財団また、この原稿の草稿を編集してくれたNur Farehan Asgar博士にも感謝します。

すべての手続きは、熊本大学の動物実験委員会(IACUC)によって承認されました。
注:痛みを和らげるために、イブプロフェンを飲料水(0.11 mg / mL)で48時間投与し、ブプレノルフィン(0.05〜0.1 mg / kg i.p.)を手術の30分前に投与しました。無菌条件には、手袋、マスク、および動物間でエチレンオキシドで滅菌されたオートクレーブ処理された器具が含まれます。手術は、37°Cに設定された加熱パッドで行われ、各動物用の新しい実験用マットで覆われました。手術前に、手術部位はベタジン溶液とアルコールで洗浄されました。すべての手術器具はオートクレーブで滅菌されました(2回以内の手術の場合)。切開を行う前に、マウスが完全に麻酔されていることを確認するためにマウスをチェックしました。各マウスの麻酔深度は、手術前および手術中につま先をつまんで評価しました。順応期間は毎回5分以内であった。各機関のIACUCの指示に従ってください。
1. 頸静脈と頸動脈のチューブの作製
<ol><li>すべてのチューブ、ポリプロピレン供給品(ピペットチップなど)、および縫合糸をオートクレーブまたはエチレンオキシドで滅菌します。頸静脈の場合は、接着剤を使用して8 cmのチューブ1( 材料を参照)と3 cmのチューブ2を接続します(図2A)。チューブ2(ポリエチレン)は硬すぎて血管を損傷する恐れがあるため、上部に2mmのチューブ1を置きます(チューブ1.1)。</li>
	<li>ブドウ糖とインスリンを注入するための頸静脈用延長チューブ(チューブ1.2)<ol><li>30cmチューブを2本、チューブ付きの10cmチューブを1本用意します2(図2A)。20 μLのピペットチップ(またはチューブ1.1に接続するために外径<0.5mmの細い先端を持つもの)の鋭い端を切り取り、3本のチューブ2(30 cm、30 cm、10 cm)を一緒に入れます。接着剤で密封します。</li>
		<li>チューブ1のもう一方の端に5cmのチューブ2を置きます。</li>
	</ol></li>
	<li>頸動脈(チューブ1.3)の場合:チューブ2を伸ばして細くします。接着剤を使用して、8 cmのチューブ1と3 cmのストレッチしたチューブ2を接続します(図2A)。先端から9mmのところに目印をつけます。</li>
	<li>チューブをシリンジに接続する先端が鋭くない針:針の鋭い端(23 G)の近くに金属ヤスリで引っかき傷を付け、ペンチで数回ゆっくりと前後に曲げて壊します。針の真ん中で同じカットを行い、金属コネクタを作成します(図2A)。</li>
	<li>動脈が採血するための延長チューブ(チューブセット1.4):10cmのチューブ1を金属コネクタと手順1.4で作成した鋭利でない針で接続します。 注:すべてのチューブと縫合糸は、オートクレーブまたはエチレンオキシドで滅菌されています</li>
</ol>2.手術
<ol><li>イソフルラン(1.5-2.0%)またはケタミン/キシラジン(ケタミン10 mg / mL、キシラジン1 mg / mLの0.9%滅菌生理食塩水、腹腔内[ip]注射による0.1 mL / 10 gの体重(BW))でマウスを麻酔します。マウスをウォームパッド(37°C)に置いたままにして、身体的ストレスを軽減します。深い麻酔を5〜10分間待ちます。足の反射、呼吸、心拍数で麻酔の深さを確認し、つま先をつまむことで刺激に対する反応を確認します。手術中は、麻酔を連続的に吸入するために、サージカルテープを使用してノーズキャップを手術台に固定する必要があります。麻酔中の乾燥を防ぐために、眼に軟膏を塗ります。</li>
	<li>ヘパリン化生理食塩水(100 U/mL)をチューブ1.1および1.3に充填し、鋭利でない針付きの1 mLシリンジで接続します(図2B)。チューブ1.1とチューブ1.3のキャップとして使用するはんだごてで溶かして、チューブ3( 材料表を参照)の端を閉じます。</li>
	<li>1回目(背中の肩甲間)と2回目(前部の首)の切開部を10%ベタジンの3サイクルで剃り、拭き取り、続いて滅菌70%アルコールで術前調製を行います。胸骨まで頭側に5mmの小さな垂直正中線切開を行い、組織を鈍く解剖し、動脈を露出させます。迷走神経を動脈から分離します。これにより、迷走神経を除去することによるグルコース代謝への悪影響が軽減されます。 注:腹側切開からカテーテルを静脈に挿入し、絹の縫合糸で固定するステップまでのステップは、顕微鏡下で行われます。</li>
	<li>動脈の下に2本の絹の縫合糸を置きます。片方の縫合糸を頭蓋側でしっかりと結び(図2C-1)、もう1本の縫合糸を尾側でゆるく結び(図2C-2)、血流を止めるには十分ですが、後で再び開くには十分です。動脈の下にもう1本の縫合糸を置きます(図2C-3)。</li>
	<li>図2C-1付近の動脈をスプリングハサミで切断し、チューブ1.3を動脈に挿入します。動脈とチューブの両方に緩い結び付けをします(図2C-3、しっかりと結ばないでください。チューブは動脈の奥深くに挿入されます)。尾側の結び目を開き(図2C-2)、9mmのマークが中央の結び目に達するまでチューブを挿入します(図2C-3)。すべての結紮糸をしっかりと結び、ヘパリン処理滅菌生理食塩水で洗い流します。</li>
	<li>頸動脈カテーテルの右頸動脈と同じ切開部から右頸静脈を露出させます。頭蓋端を分離し、絹糸縫合糸で結紮します(図2D-1、材料表)。露出した静脈の尾端に別の縫合糸を配置します(図2D-2)。図2D-1のマーク付近の静脈をスプリングハサミで切ります。</li>
	<li>カテーテルを挿入し(血管が貫通しないように深すぎない)、結び、採血していることを目視で確認します。ヘパリン処理滅菌生理食塩水(0.2mL)で洗い流し、カテーテル内に血液が残っていないことを目視で確認する。</li>
	<li>マウスを新しい滅菌手術用ドレープの上に置き、最初の創傷からの感染を防ぎます。マウスを裏返し、3サイクルのベタジンで拭き、続いて滅菌アルコールで術前準備を行い、肩甲骨の間に小さな切開を行います。</li>
	<li>背中の切開部から腹側に向かって皮膚の下にニードルホルダーを通します。ニードルホルダーでカテーテルを固定し、皮膚の下に通し、元に戻します。切開部位を洗浄し、合成縫合糸(直径0.15〜0.2 mm)で腹側切開部を閉じます。静脈カテーテルを肩甲骨の間の切開部位にマイクロセレファインで固定します。</li>
	<li>カテーテルをクランプの1cm上に切断し、ヘパリン化生理食塩水で洗い流し、キャップで閉じます(ステップ2.4)。動脈カテーテルについても同じ手順に従います。背側切開部を合成縫合糸(直径0.15〜0.2 mm)で閉じます。</li>
	<li>マウスを温かく清潔なケージに入れます(図2E)。術後のケアを毎日行う。</li>
</ol>3. 回復
<ol><li>別のマウスがグループハウジング内のカテーテルを噛む可能性があるため、マウスをシングルハウスにします。<ol><li>社会的孤立によるストレスを軽減するには、環境を豊かにしたマウス(シェルターなど)を飼育します。術後のケアを毎日行う。痛み、苦痛、不快感を和らげるために、鎮痛剤(飲料水中のイブプロフェン(0.11 mg / mL))などの術後ケアを提供します。</li>
		<li>切開部位の化膿、嗜眠、痛みなどの感染の兆候がないかマウスを観察します。ほとんどの健康なマウスは、手術後約2時間で歩行と摂食を開始します。猫背の姿勢、フリルの毛皮、食物摂取量の減少は、痛みを示している可能性があります。これらの兆候が観察された場合は、直ちに深い麻酔または二酸化炭素窒息下でマウスの首を切り落として安楽死させます。</li>
	</ol></li>
	<li>血液は動脈のカテーテルに入り、血栓を形成します。カテーテルラインを維持するには、手順3〜6に従って毎日血栓を取り除きます。</li>
	<li>1 mL のシリンジと 23 G の針 (先端が尖っていない方) にヘパリン処理生理食塩水 (100 U/mL) を充填します。誘導チャンバーを使用して、イソフルラン(1.0%〜1.5%)でマウスを軽く麻酔します。次に、マウスをチャンバーから取り出し、ノーズキャップによるイソフルラン麻酔下で血栓除去を行う。</li>
	<li>マウスの背面にある動脈用チューブをマイクロセレファインでクランプし、キャップを外して血液と血栓を抽出します。23 Gの針(先端が鋭くない)を備えた別の1 mLシリンジを使用して、ヘパリン化生理食塩水でカテーテルを洗い流し、再度キャップをします。重度の凝固の場合には、動脈ラインのように静脈ラインをきれいにします。</li>
	<li>同じ手順で、1日1回3〜5日間カテーテルを清掃します。</li>
	<li>マウスの体重を確認してください。手術当日から体重が10%以上減少した場合は、支持療法を施して正常な体調スコアの改善を試み、マウスを別の実験に使用してください。 注:この研究の実験では、動物の体重減少は10%未満でした。体重減少は全身のグルコース代謝に強く影響します。したがって、体重の回復を待つか、クランプ実験から外すことをお勧めします。</li>
</ol>4.ポンプシステムを設定します(血糖降下クランプ用)
<ol><li>0.1%BSA生理食塩水で1 U/mLのインスリン、生理食塩水中で30%グルコース、およびヘパリン処理生理食塩水を調製します。</li>
	<li>マウスの体重を測定します。インスリンを注入するために、1 U/mL のインスリンの容量を計算します (10 mU/kg/min)。クランプ実験で1.7μL/minのインスリン溶液をマウスに注入します。300 μL のインスリン注入液を作る場合、1 U/mL のインスリン (μL) に必要な容量は 2.647 (μL/g) x 体重 (g) です。300 μLのインスリン注入液は、1匹のマウスでクランプ実験を終了するのに十分です。 表1 に、インスリン注入をさせる例を示す。</li>
	<li>各ハミルトンシリンジにインスリン注入液と30%グルコースを充填し、チューブ1.2で接続し、シリンジをシリンジポンプにセットします(図3A)。各溶液をチューブ 1.2 に充填します。生理食塩水を1 mLのシリンジとチューブセット1.4に充填します(図2A)。</li>
	<li>マウスにイソフルラン(1.0%-1.5%)を麻酔し、チューブ1.2を静脈カテーテルに接続し、チューブセット1.4を動脈カテーテルに接続します(図3A)。セロハンテープを使用してチューブを固定します。</li>
	<li>マウスを空の500 mLビーカーに入れます。 注:高血糖クランプには、1 U / mLインスリンの代わりに生理食塩水を使用してください。.</li>
</ol>5.血糖降下クランプ
<ol><li>図3Bに示すように、5〜10分ごとに血糖値を測定し、-15分、10分、20分、40分、60分、80分、100分、および120分でホルモン測定用の血液サンプルを採取します。ステップ5.2に従って血糖値を測定します。 注意: 常に血糖値を測定する必要はありませんが、少なくとも10分ごとに測定することをお勧めします。血糖値とブドウ糖注入速度が安定していないときは、5分ごとに血糖値を測定します。</li>
	<li>チューブセット1.4の上端をクランプし、新しいシリンジを接続し、50 μLの血液を抽出し、洗浄のために1.5 mLのチューブに入れます。血糖値を測定します。 注:これは、前回のサンプリング後のカテーテル洗浄のために、チューブ内の生理食塩水によって希釈された血液です。50μLの容量は、希釈した血液を純血に置き換えるのに十分です。</li>
	<li>希釈した血液(赤血球)を保管します。溜まった血液(~500μL)を生理食塩水で洗浄し(ステップ5.11-5.12を参照)、低酸素症を防ぐために体に戻します。</li>
	<li>高血圧の動脈にカテーテルが繋がっているので、クランプを緩めると血液が流れ出し、手軽な血糖値計で血糖値を測ります。50μLの生理食塩水を注入して、十分な量の血液を保管します。</li>
	<li>採血の場合は、さらに50 μLの血液を抽出し、氷上の1.5 mLチューブに入れます。生理食塩水100μL(置換50μL+サンプリング50μL)を注入する。</li>
	<li>0分間の血糖測定後、インスリンシリンジポンプを始動します。まず、30 mU/kg/minをボーラスに2分間(5.1 μL /min)注入し、次に10 mU/kg/min(1.7 μL /min)の注入を残りの期間行います。</li>
	<li>血糖値を測定し、5〜10分ごとに120分間ブドウ糖注入速度を変更します。</li>
	<li>ブドウ糖注入速度が変化せず、血糖値が50mg/dLの定常状態を作ります。</li>
	<li>t = 120 分で血液サンプルを採取した後、頸静脈に安楽死剤を注入し、RNA またはタンパク質分析のために組織を採取します。</li>
	<li>血液を1000 x g で5分間遠心分離し、メーカーのプロトコルに従ってELISAキットを使用してインスリンやc-ペプチドなどのホルモン濃度を測定します。</li>
	<li>血液を洗浄するには、血液を1000 x g で3分間遠心分離します。上清を取り除き、ヘパリン化生理食塩水500μLを加え、ピペッティングを行います。</li>
	<li>洗浄を再度繰り返し、洗浄した赤血球を動脈用の1mLシリンジに入れます。ステップ5.2および5.3で50または100μLの生理食塩水が注入されると、血球が自動的に再注入されます。低酸素症を防ぐためにヘマトクリットを注意深く監視します。. 注:血糖値測定には、市販のハンディグルコースメーターを使用しました。</li>
</ol>6.高血糖クランプ
<ol><li>血糖降下クランプ法として手順に従いますが、インスリン注入は行わず、血糖値を250〜300 mg / dLに調整します。 図3Bに示すように、5〜10分ごとに血糖値を測定し、-15分、10分、20分、40分、60分、80分、100分、および120分でホルモン測定用の血液サンプルを採取します。</li>
	<li>新しいシリンジをチューブセット1.4に接続し、50 μLの血液を抽出し、洗浄のために1.5 mLのチューブに入れます。</li>
	<li>採血の場合は、さらに50 μLの血液を抽出し、氷上の1.5 mLチューブに入れます。生理食塩水100μL(置換50μL+サンプリング50μL)を注入する。</li>
	<li>0分間の血糖測定後、グルコースシリンジポンプを始動します。まず、30 g/kg/minをボーラスに2分間(5.1 μL /min)注入し、次に残りの期間10 g/kg/min(1.7 μL /min)を注入します。</li>
	<li>血糖値を測定し、5〜10分ごとに120分間ブドウ糖注入速度を変更します。グルコース注入速度が変化せず、血糖値が250〜300 mg / dLの定常状態、クランプされた高血糖状態を作成します。</li>
</ol>

マウスにおける高血糖および低血糖クランプの外科的設置

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著者らは、競合する利害関係がないことを宣言します。

ここで説明する方法は、ピペットチップやシリンジなど、通常の実験室にあるものを使ってできる簡単な方法です。研究者は追加のチューブやポンプを購入する必要があるかもしれませんが、高価な機器は必要ありません。したがって、カテーテル法とクランプのこのプロトコルは、以前のレポートと比較して開始が容易です12,13,14。
クランプ技術は1970年頃に開発され、マウスやヒトで使用されてきました15。グルコース代謝を正確に測定するのに有用な方法であり、ゴールドスタンダードと言われています。しかし、これは多くの研究者が使用する一般的な手法ではありません。高インスリン血糖-高血糖クランプ法は、マウス13 とラット14で報告されているが、ここでのカテーテル法は異なっており、読者は実験のためにより簡単なものを選ぶことができる。本論文は、実験開始のハードルを下げることを目的の一つとしています。そこで、ハンドメイドカテーテルの材質や手術手技、実験時間経過の一例などを詳しく紹介しました。これらは、初めてクランプを実行しようとする研究者にとって有益です。
肥満と糖尿病のインスリン分泌は病期依存性です。多くの報告によると、肥満ではインスリン分泌が増加し、インスリン抵抗性状態では血糖値が低下することが示唆されています16が、2型DMではβ細胞機能が損なわれます17,18。実際、膵島およびインスリン分泌の数と面積は、高脂肪食を与えられたマウス19やレプチン欠乏マウス20などの肥満マウスモデルで増加することが報告されている。明らかな表現型を有するこれらのマウスモデルでは、GTTでのグルコース投与の15〜30分後に血中インスリンレベルを調べることによって違いを決定できます。しかし、場合によっては、インスリン分泌の違いを判断することは容易ではありません。例えば、トランスジェニック(Tg)マウスの血糖値が500mg/dLで、WTマウスの血糖値が300mg/dLで、両マウスの血中インスリン濃度が同じ場合、Tgのインスリン分泌が減少すると言えるでしょうか?この場合、ここで紹介した方法では血糖値が同じでないとインスリン分泌能力を比較することができません。これが、肥満から糖尿病への移行期にβ細胞の機能が低下し始める時期について確立された理論がない理由の1つです。また、膵臓の初代培養21またはex vivo22によるインスリン分泌の測定も可能である。しかし、迷走神経の神経支配が取り除かれるため、中枢神経系がインスリン放出に及ぼす影響が損なわれます。吸収後のインスリン分泌はよく知られているが、脳や自律神経系もインスリンの分泌を調節している23。後者を分析するための実験は、麻酔なし、拘束なし、痛みのない採血で実施する必要があります。これは、ステップ2.3で迷走神経を頸動脈から分離しなければならない理由でもあります。
糖尿病は、インスリン抵抗性およびグルカゴン24 および他の調節ホルモン25の分泌増加により、高血糖を引き起こすことが報告されている。さらに、インスリン投与量の失敗やその他の原因による糖尿病患者における低血糖の繰り返しのエピソードは、患者が低血糖になりやすい再発性低血糖症と呼ばれる状態につながる可能性があります26。低血糖クランプにおける血糖値の低下率は、低血糖の末梢または中枢の検出に影響を与えることが示唆されている27。ゆっくりと発症する低血糖は、門脈間膜静脈におけるグルコースセンサーの役割を研究するのに適しているかもしれないが、血糖値の非常に急速な減少は、脳グルコースセンサーの研究に適しているかもしれない27。1 U/mLのインスリンは、痩せたC57BLマウスに使用されています。しかし、肥満マウスはインスリン抵抗性があり、血糖値を下げるには1 U/mLでは不十分であるため、より高いインスリン濃度が必要になります。
血糖プールの1区画モデル(図1A)では、吸収されたグルコースの量がグルコース入力速度に影響を与える可能性がある14。したがって、高インスリン血症-高血糖クランプを測定する主な目的の1つであるグルコース産生速度は、絶食期間の影響を受ける可能性があります。ただし、絶食時間が長いと、調節ホルモンの分泌が増加する可能性があります。したがって、研究者は分析目的に応じて絶食時間を設定します。別のクランプ法には、尾部からの採血が含まれるが、これは静脈内カニューレを挿入するだけでよいため、単純である14。しかし、血液は拘束状態で採取されるため、適度な拘束ストレスと血漿カテコールアミンやその他のストレスホルモンの増加を引き起こします14。また、四肢の血液中よりも体の中心部の血流中のホルモン濃度を測定することが好ましい。したがって、自由に動くマウスの動脈からの採血は、グルコース代謝を生理学的に測定するのに最適です。マウスは動き回らず、実験環境に慣れれば旋回も必要ありません。ただし、注入ラインやサンプリングラインの絡み合いを防ぐために、スイベルを使用することをお勧めします。Tubing1.2とTubing Set1.4(図3A)は、スイベルの使用には適していません。研究者がスイベルを使用する必要がある場合は、システムを改善する必要があります。血球の再注入は、血糖値とインスリンの確立された定常状態に影響を与えません。本方法は、同位体を用いたメタボロミクス研究にも適用することができる。例えば、 13C-グルコースが静脈に連続的に注入される場合、全身代謝回転率および細胞内中間代謝産物を測定することができる28。したがって、これはグルコース代謝を分析するための有用な方法です。

ブドウ糖は細胞にとって重要なエネルギー源であり、ブドウ糖が不足するとさまざまな症状や合併症を引き起こす可能性があります。低血糖(低血糖、空腹時血糖値が70 mg / dL未満であるが、単一の値1で決定すべきではない)の場合、最も一般的な症状には、脱力感、錯乱、発汗、頭痛などがあります。また、脳機能を混乱させ、心血管イベントや死亡のリスクを高める可能性があります2。逆に、高血糖は血漿グルコース濃度が正常レベル(空腹時血糖値126で一般的に>3mg/dL)を超える病状です。これは、インスリンの産生または利用が不足している糖尿病患者に発生する可能性があります。高血糖は糖尿病性ケトアシドーシスを引き起こす可能性があり、これは体がブドウ糖をエネルギーとして使用できず、代わりに脂肪酸を燃料として分解するときに発生します。高血糖性高浸透圧状態も死亡率を増加させます4。長期的な高血糖は、血管、神経、臓器に損傷を与え、心血管疾患、網膜症、腎臓病などのいくつかの慢性合併症の発症につながる可能性があります。したがって、血糖値は100 mg / dLから120 mg / dLの間の狭い範囲に維持する必要があります。
血糖値は、1コンパートメントモデルにおけるグルコースのインプットとアウトプットのバランスによって調節されます(図1A)。グルコースインプットには、食物から吸収されたグルコースと、肝臓、腎臓、小腸からのグルコース産生が含まれます。グルコース産生は、組織へのグルコースの取り込みと腎臓からのグルコース処理で構成されます。ブドウ糖のインプット量とアウトプット量の両方が内分泌ホルモンによって調節されています。例えば、グルカゴン、コルチコステロン、カテコールアミンなどは、血糖値が下がると分泌されます5。それらは、主に肝臓からのグリコーゲンの分解およびグルコースの合成を刺激する。これらのプロセスは、それぞれグリコーゲン分解および糖新生として知られています。高血糖は、膵臓β細胞からのインスリン放出を増加させ、筋肉、脂肪組織、心臓へのグルコース取り込みを刺激します6,7,8,9。運動はインスリン非依存性グルコースの取り込みを増加させる10.交感神経系は、筋肉や褐色脂肪組織におけるグルコースの取り込みを増加させる6,11。末梢組織におけるグルコース代謝を調節する能力を測定するために、研究者は通常、ブドウ糖負荷試験(GTT)とインスリン負荷試験(ITT)を使用します(図1B、C)。GTTでは、インスリン放出とインスリン感受性の2つの要因を考慮する必要があります(図1B)。ただし、120分間の試験中のグルコース濃度曲線はマウスごとに異なり、ホルモン放出の量に影響を与える可能性があります。ITTでは、血糖値はインスリン感受性と調節ホルモンの放出の両方によって調節されます。したがって、血糖値が一定でない状況で、GTTおよびITTにおけるグルコース代謝、インスリン放出、およびインスリン感受性の正確な意味を決定することは困難です。
これらの問題を克服するためには、血糖値を一定レベルに保つこと(または「クランプ」)が望ましい。高血糖クランプでは、ブドウ糖を血流に注入して血糖値を特定のレベルまで上昇させ、その後、そのレベルに一定期間維持します。注入されたグルコースの量は、定常状態を維持するために、5〜10分ごとの血糖値の測定に基づいて調整されます。この手法は、クランプされたグルコースレベルでのインスリン分泌のパラメータを理解するのに特に有用です。血糖降下クランプは、インスリンを注入することで低血糖値を維持する方法です。グルコースは、特定の血糖値を維持するために可変速度で注入されます。マウスが低血糖から回復できない場合は、より多くのブドウ糖を注入する必要があります。.
高血糖および低血糖クランプを行うことには多くの利点がありますが、外科的および実験的手順は技術的に困難であると考えられています。そのため、それを実現できた研究グループはほとんどありません。私たちは、財政的および労働力的な制約のある研究者が、より低予算でこれらの実験を開始できるように、これらの方法を説明することを目指しました。

<table><tbody><tr><td>接着剤</td><td>Henkel AG & Co. KGaA</td><td>LOCTITE 454</td><td></td></tr><tr><td>ELISA kit (C-peptide)</td><td>森永生物学研究所</td><td>M1304</td><td>Mouse C-peptide ELISA</td></tr><tr><td>Kit ELISA kit (insulin)</td><td>富士フイルム和光純薬</td><td>633-03411</td><td>LBIS Mouse Insulin ELISA Kit (U-type)</td></tr><tr><td>ハンディグルコースメーター</td><td>ニプロ</td><td>11-777</td><td>フリースタイル フリーダムライト</td></tr><tr><td>インスリン (100U/ml)</td><td>イーライリリー</td><td>428021014</td><td>フムリンR (100U/ml)</td></tr><tr><td>マウス</td><td>ジャパン SLC</td><td>C57BL/6NCrSlc</td><td>C57BL</td></tr><tr><td>縫合</td>糸 <td>夏目製作所</td><td>C-23S-560 No.2</td><td>滅菌</td></tr><tr><td>シリンジポンプ</td><td>システム株式会社</td><td>NE-1000</td><td></td></tr><tr><td>合成縫合糸</td><td>V&Ouml;MEL</td><td>HR-17</td><td></td></tr><tr><td>チューブ1</td><td>AS ONE Corporation</td><td>9-869-01</td><td>LABORAN(R) Silicone Tube</td></tr><tr><td>Tubing2</td><td>Fisher Scientific</td><td>427400</td><td>BD Intramedic PE Tubing</td></tr><tr><td>Tubing3</td><td>五十嵐伊香工業株式会社</td><td>size5</td><td>ポリエチレンチューブ size5</td></tr></tbody></table>

意識のあるマウスにおける高血糖クランプと低血糖クランプ

Hyperglycemic Clamp and Hypoglycemic Clamp in Conscious Mice

糖尿病(DM)は、膵臓β細胞からのインスリン放出不足(1型DM)と、筋肉、肝臓、脂肪組織におけるインスリン感受性(2型DM)によって引き起こされます。インスリン注射はDM患者を治療しますが、副作用として低血糖を引き起こします。コルチゾールとカテコールアミンが放出され、肝臓からのグルコース産生を活性化して、反調節反応(CRR)と呼ばれる低血糖を回復させます。げっ歯類モデルを用いたDM研究では、ブドウ糖負荷試験と2-デオキシグルコース注射を用いて、それぞれインスリン放出とCRRを測定します。しかし、血糖値は実験中に持続的に変化するため、正味のインスリン放出とCRRの評価が困難になります。本稿では、意識のあるマウスの血糖値を250mg/dLまたは50mg/dLに保ち、インスリンホルモンとCRRホルモンの放出をそれぞれ比較する方法について述べる。
マウスの頸動脈と頸静脈にポリエチレンチューブを埋め込み、マウスが手術から回復するのを待ちます。頸静脈チューブは、シリンジポンプでハミルトンシリンジに接続され、インスリンまたはグルコースを一定かつ可変の速度で注入することができます。頸動脈チューブは採血用です。高血糖クランプでは、30%のブドウ糖を静脈に注入し、5分または10分ごとに動脈血から血糖値を測定します。血糖値が250mg/dLになるまで、30%グルコースの注入速度を上げます。血液を採取してインスリン濃度を測定します。血糖降下クランプの場合、10 mU/kg/min のインスリンと 30% グルコースを注入し、その注入速度は 50 mg/dL の血糖値を維持します。血液は、ブドウ糖注入と血糖の両方が定常状態に達したときに、調節ホルモンを測定するために収集されます。高血糖クランプと低血糖クランプはどちらも、同じ外科的処置と実験設定を持っています。したがって、この方法は全身性グルコース代謝の研究者にとって有用である。

低血糖クランプ試験は、実験開始時に3時間絶食した雄のC57BL / 6Nマウス(8週齢、BW25g以上)で実施されました(図4A、B)。初期血糖値は136mg/dL(t=-15分)であった。90mg/dL未満の場合は、手術がうまくいかなかったか、動脈カテーテルの挿入が深すぎたか、血流に血栓が入っている可能性があります。手術後のマウスの状態は、マウスのエネルギー代謝に影響を与えます。生理的グルコース代謝は、健康状態が悪いと測定できません。C57BLは手術後に凝固しやすいです。FVBマウスやICRマウスなど、体重が多いマウスは、手術後の血栓洗浄により体重が減りにくい。したがって、初心者はクランプ手順の練習にFVBマウスを使用することをお勧めします。C57BLマウスは、より集中的な治療が必要です。動脈への9mmのカテーテル挿入は、FVBマウスやICRマウスでも採血に問題はありませんでした。インスリンはt = 0分で開始され、血糖値は低下しました(図4A)。GIR は t = 0 分から t = 70 分の間で安定していなかった。その後、80分後に定常状態となった。
高血糖クランプ試験は、実験開始時に3時間絶食した雄のC57BL/6Nマウス(8週齢、BW25g以上)でも実施されました(図4C、D)。t=-15およびt=-5分で血糖値を測定し、血液サンプルを採取した後、t=0分からグルコースを注入した。血糖値はt=40分で250mg/dLとなった。定常状態は t = 30 分から最後まで続いた。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65581/65581fig01.jpg"> 図1:血糖値の調節。 (A)体内の血糖値の調節を示す概念図。(B、C)(B)ブドウ糖負荷試験(GTT)および(C)インスリン負荷試験(ITT)における糖代謝の調節。いくつかの要因が血糖値を調節します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65581/65581fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65581/65581fig02v2.jpg"> 図2:チューブの準備と手術の手順。 (A)頸動脈と頸静脈のチューブの画像。チューブ番号はプロトコルのステップ番号と一致します。(B)手術用チューブの準備方法。(C、 D)絹糸を結紮してカテーテルを(C)動脈と(D)静脈に挿入する番号付き位置。絹糸は、頭蓋側(C-(1))と動脈の尾側(C-(2))の位置と、その真ん中(C-(3))にもう1本配置します(手順2-4)。絹糸は、頭蓋側(D-(1))と静脈の尾側(D-(2))の位置と、その中間(D-(3))にもう1本配置します(手順2-6)。(E)背中から出る動脈カニューレと静脈カニューレの図 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65581/65581fig02largev2.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65581/65581fig03.jpg"> 図3:クランプのセッティング。 (A)チューブ、ポンプ、シリンジ、マウスのセットアップを示す図。(B)血糖値とブドウ糖注入速度を記録するシート。50μLの血液をt = -15分、10分、20分、40分、60分、80分、100分、および120分で採取します。インスリン注入速度は、t = 0 から 2 分までは 5.1 μL/分であり、t = 2 分で 1.7 に変化しました。血糖値は10分ごとに測定した。血糖値は、そのレベルが安定していないときに5分ごとに測定されました。グルコース注入速度は、血糖値を測定するたびに変化させました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65581/65581fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65581/65581fig04.jpg"> 図4:血糖降下クランプと高血糖クランプの代表的な結果。 (A)血糖値と(B)血糖値低下クランプのグルコース注入率。(C)血糖値と(D)高血糖クランプのグルコース注入率。データはSEM±平均値を表します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65581/65581fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>解決</td>
			<td>計算</td>
			<td>20gマウス用</td>
		</tr><tr><td>1 U/mL インスリン</td>
			<td>(2.647×体重)μL</td>
			<td>52.9 μL</td>
		</tr><tr><td>0.1%BSA生理食塩水</td>
			<td>300 μL - インスリンの量 (μL)</td>
			<td>247.1μL</td>
		</tr></tbody></table>表1:インスリン注入液を調製するための計算例。

高血糖クランプは、より高い血糖濃度を維持してインスリン放出を測定するために使用されます。血糖降下クランプは、逆調節反応によって誘発されるグルコース産生を測定するためのものです。どちらの方法も同じ外科的処置を使用します。ここでは、全身のグルコース代謝を評価するためのクランプ技術を紹介します。

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意識のあるマウスにおける高血糖クランプと低血糖クランプ

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