Name: 眼球レンズの皮質および核からの束および単線維細胞の調製および免疫蛍光染色 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-09T14:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: 学ぶ 眼球レンズの皮質および核からの線維細胞を調製し、免疫蛍光染色を行う方法。複雑な細胞間相互連結と膜構造を共焦点顕微鏡で可視化し、レンズの生物力学的特性を解明する。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この研究は、米国国立眼科研究所の助成金R01 EY032056(CCへ)の支援を受けました。著者らは、電子顕微鏡画像の支援をしてくれたScripps Research Core Microscopy FacilityのTheresa Fassel博士とKimberly Vanderpool博士に感謝しています。

マウスは、インディアナ大学ブルーミントン校の動物管理・利用委員会が承認した動物プロトコルに基づいて飼育されています。代表的なデータを生成するために使用したマウスは、C57BL6/Jバックグラウンドの対照(野生型)動物、雌、および8〜12週齢でした。この実験には、マウスの性別が実験結果に影響を与える可能性が非常に低いため、雄と雌の両方のマウスを使用できます。
1. レンズの解剖とカプセル化解除
<ol><li>米国国立衛生研究所(NIH)の「実験動物の飼育と使用に関するガイド」および同研究所が承認した動物使用プロトコルに従ってマウスを安楽死させる。 注:本研究では、マウスはCO2 の過剰摂取によって安楽死させられ、その後、承認された動物プロトコル(インディアナ大学)に従って子宮頸部脱臼が続きました。</li>
	<li>湾曲した鉗子を使用してマウスから眼球を摘出し、鉗子の片側で目の周りの組織を押し下げて眼窩から眼球を移動させます。次に、目の下の鉗子を閉じ、持ち上げて眼窩から眼球を取り除きます。解剖トレイ内の新鮮な1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に眼球を移します。</li>
	<li>視神経を極細ハサミで眼球にできるだけ近づけて切ります。先端の細いまっすぐなピンセットを、眼球の後部にある視神経の出口から眼球に慎重に挿入します。</li>
	<li>ステップ1.3のピンセットと同じ場所にハサミを慎重に挿入し、後部から角膜と強膜の接合部に向かって切開を開始します。 注:げっ歯類のレンズは目の~30%を占めています。ピンセットやハサミが目の奥深くまで挿入されすぎると、偶発的な損傷が発生します。</li>
	<li>角膜と強膜の接合部の少なくとも半分が分離するまで、角膜と強膜の接合部に沿って切断を続けます。</li>
	<li>ピンセットを使用して角膜をそっと押し、手順1.4と1.5で行った切開から水晶体が出るようにします。</li>
	<li>先端の細いまっすぐなピンセットを使用して、レンズから大きな組織片を慎重に取り除きます。レンズを点検して、赤道領域を見つけます。</li>
	<li>先端の細いまっすぐなピンセットを使用してレンズを浅く突き刺し、レンズカプセルを取り外します。水晶体線維細胞の塊は無傷のままであり、水晶体上皮単層は水晶体嚢に付着したままである。レンズカプセルを廃棄します。</li>
</ol>2. レンズ単線維細胞染色
<ol><li>レンズファイバー細胞の塊を、新たに調製した1%パラホルムアルデヒド(PFA;1x PBS)溶液500 μLのウェルプレートに移し、サンプルを4°Cで一晩、穏やかなナーションでインキュベートします(図2A)。 注:記載されている溶液の容量は、48 ウェルプレート用に最適化されています。別のサイズのウェルプレートまたはチューブを使用する場合は、それに応じて溶液の量を調整してください。固定、ブロッキング、洗浄(1x PTX、0.1% Triton X-100 in 1x PBS)溶液を、10 x PBS と二重蒸留水(ddH2O)で最終濃度が 1 x PBS になるまで作製しました。</li>
	<li>レンズファイバーセルを1%PFAを含む60mmディッシュに移します。鋭利なメスを使用して、繊維細胞のボールを前後軸に沿って半分に分割します(図2B)。同じ軸に沿って半分に再び半分に切り、四分の一を作ります。 注:前後軸は、組織塊内の線維細胞の方向によって容易に認識されます。</li>
	<li>まっすぐなピンセットを使用して、水晶体ファイバーセルの四分の一から核領域を取り除きます(図2C)。 注:げっ歯類の水晶体では水晶体核領域は硬く、水晶体の中心は柔らかい皮質線維から簡単に分離します。</li>
	<li>水晶体皮質領域の四分の一を200 μLの1% PFAで、室温(RT)で15分間、穏やかに振とう(プレートシェーカーで300rpm)後固定します。</li>
	<li>750 μL の 1x PBS で 5 分間、RT で穏やかに振とうしながら、組織クォーターを 2 回洗浄します。</li>
	<li>200 μL のブロッキング溶液(5% 血清、0.3% Triton X-100、1x PBS)を使用して、穏やかに振とうしながら室温で 1 時間、サンプルをブロッキングします。 注:このプロトコルの代表的なデータでは、サンプルは一次抗体または二次抗体で染色されていません。ブロッキングステップの後、サンプルを小麦胚芽凝集素(WGA;1:100)およびファロイジン(1:100)(材料表参照)と室温で穏やかに振とうし、光から保護しながら3時間インキュベートしました。一次抗体染色は、以前の出版物22,23で実証されています。</li>
	<li>100 μLの一次抗体溶液とともに、穏やかに振とうしながら4°Cで一晩インキュベートします。 注:抗体はブロッキング溶液で希釈されています。組織切片のあるスライドと比較して、このタイプの調製物にはより多くの細胞があります。一次抗体の濃度を上げて、より多くの細胞を染色するための十分な抗体を提供する必要があります。抗体濃度は、組織切片に使用する濃度の2倍にすることが推奨されます。二次抗体も同様です。</li>
	<li>1x PTX(0.1% Triton X-100、1x PBS)で、室温でそれぞれ5分間、穏やかに振とうしながら組織クォーターを3回洗浄します。</li>
	<li>ファイバー細胞を100 μLの二次抗体/色素溶液と室温で穏やかに振とうしながら3時間インキュベートします。このステップとその後のステップでは、サンプルを光から保護してください。 注:WGA、ファロイジン、およびその他の蛍光色素を二次抗体溶液に添加して、一次抗体を標識しながら、細胞膜、細胞骨格、またはその他の細胞小器官を同時に標識することができます。</li>
	<li>ファイバーセルを 1x PTX で 5 分間、室温で穏やかに振とうしながら 4 回洗浄します。</li>
	<li>プラスチャージした顕微鏡スライドに1滴または50 μLの封入剤を加えてから、組織クォーターをスライドに移します。</li>
	<li>ピンセットを使用して繊維セルを互いに穏やかに分離し、セルバンドルの重なりを制限します。</li>
	<li>#1.5のカバーガラスを封入剤のサンプルの上にそっと貼り付けます。封入剤はカバーガラスの端まで広がる必要があります。これが発生しない場合は、カバーガラスの端に封入剤を追加します。カバーガラスの端の周りの余分な封入剤を吸引し、マニキュアを使用してスライド上のカバーガラスの端を密封します。 注:これらの実験には、共焦点顕微鏡用に調製されたあらゆる種類の封入剤を使用できます。</li>
</ol>3. 水晶体核単線維細胞染色
<ol><li>セクション 1 で概説した解剖を完了します。</li>
	<li>水晶体線維細胞のボールから皮質線維を機械的に除去し、水晶体核を残し、線維細胞塊を湿った手袋をはめた指先にそっと移し、組織塊を静かに転がします。 注:マウスレンズでは、手袋をはめた指先の間で水晶体線維細胞のボールを転がすことは、硬水晶体核から皮質線維細胞を除去するための効果的な方法である28,30。この機械的方法が効果的でないレンズについては、慎重な解剖またはボルテックス法29を使用して皮質線維細胞を除去してもよい。</li>
	<li>水晶体核をウェルプレートで作りたての1%PFA溶液に移し、穏やかに振とうしながら4°Cで一晩インキュベートします。</li>
	<li>サンプルを1%PFAを含む60mmディッシュに移し、鋭利なメスを使用して水晶体核を前後軸に沿って分割します。組織サンプルを再び半分にして、核四分の一を生成します。</li>
	<li>ステップ2.4-2.13で概説されているプロセスに従って、免疫染色とサンプルの埋め込みを行います。</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65638/65638fig02v2.jpg"> 図2:水晶体線維細胞の調製と免疫染色を詳述したグラフィカルな要約 。 (A)この 48 ウェルプレートは、記載されたメソッドのサンプルプレートのセットアップを示すためにカラムごとに色分けされており、鉗子を使用した穏やかな取り扱いにより、さまざまな免疫染色ステップ間でサンプルを簡単に移すことができます。このプロトコルの代表的なデータは一次抗体とインキュベートされていませんが、図には一次抗体インキュベーション用のカラムが含まれており、使用済みの洗浄バッファーを吸引して除去した後、洗浄用のウェルを再利用できます。(B)水晶体線維細胞塊を固定した後、細胞の元の構造を保存するために、組織を前後軸(赤い破線)に沿って分割します。組織塊が半分になると、サンプルを回転させ、前後軸に沿って半分を四分の一に分割します(赤い破線)。(C)水晶体核領域(ピンク色)の除去は、ピンセットを使用して皮質線維細胞(青色)から密集した中央組織を掘り出すと簡単にできます。漫画の図は、部分的に BioRender.com を使用して作成され、縮尺どおりに描画されていません。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65638/65638fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>

レンズファイバー細胞における膜インターディジテーションの免疫蛍光染色

<ol><li>Lovicu, F. J., McAvoy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factor+regulation+of+lens+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Growth factor regulation of lens development.</a> Developmental Biology. 280 (1), 1-14 (2005).</li>
<li>Kuszak, J., Alcala, J., Maisel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+surface+morphology+of+embryonic+and+adult+chick+lens-fiber+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">The surface morphology of embryonic and adult chick lens-fiber cells.</a> The American Journal of Anatomy. 159 (4), 395-410 (1980).</li>
<li>Kuszak, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ultrastructure+of+epithelial+and+fiber+cells+in+the+crystalline+lens%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Cytology%22%5BJournal%5D)">The ultrastructure of epithelial and fiber cells in the crystalline lens.</a> International Review of Cytology. 163, 305-350 (1995).</li>
<li>Kuszak, J. R., Macsai, M. S., Rae, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereo+scanning+electron+microscopy+of+the+crystalline+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning+Electron+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Stereo scanning electron microscopy of the crystalline lens.</a> Scanning Electron Microscopy. , 1415-1426 (1983).</li>
<li>Lo, W. K., Harding, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Square+arrays+and+their+role+in+ridge+formation+in+human+lens+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ultrastructure+Research%22%5BJournal%5D)">Square arrays and their role in ridge formation in human lens fibers.</a> Journal of Ultrastructure Research. 86 (3), 228-245 (1984).</li>
<li>Taylor, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+of+the+normal+human+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Morphology of the normal human lens.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 37 (7), 1396-1410 (1996).</li>
<li>Vrensen, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+of+the+human+eye+lens-a+morphological+point+of+view%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology.+Part+A%2C+Physiology%22%5BJournal%5D)">Aging of the human eye lens-a morphological point of view.</a> Comparative Biochemistry and Physiology. Part A, Physiology. 111 (4), 519-532 (1995).</li>
<li>Vrensen, G. F., Duindam, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+fiber+membranes+in+the+human+eye+lens.+Ultrastructural+and+Raman+microspectroscopic+observations%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Research%22%5BJournal%5D)">Maturation of fiber membranes in the human eye lens. Ultrastructural and Raman microspectroscopic observations.</a> Ophthalmic Research. 27, 78-85 (1995).</li>
<li>Willekens, B., Vrensen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+three-dimensional+organization+of+lens+fibers+in+the+rabbit.+A+scanning+electron+microscopic+reinvestigation%5BTitle%5D)+AND+%22Albrecht+von+Graefe%27s+Archive+for+Clinical+and+Experimental+Opthalmology%22%5BJournal%5D)">The three-dimensional organization of lens fibers in the rabbit. A scanning electron microscopic reinvestigation.</a> Albrecht von Graefe's Archive for Clinical and Experimental Opthalmology. 216 (4), 275-289 (1981).</li>
<li>Willekens, B., Vrensen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+three-dimensional+organization+of+lens+fibers+in+the+rhesus+monkey%5BTitle%5D)+AND+%22Graefe%27s+Archive+for+Clinical+and+Experimental+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">The three-dimensional organization of lens fibers in the rhesus monkey.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 219 (3), 112-120 (1982).</li>
<li>Zhou, C. J., Lo, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+clathrin%2C+AP-2+adaptor+and+actin+cytoskeleton+with+developing+interlocking+membrane+domains+of+lens+fibre+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Association of clathrin, AP-2 adaptor and actin cytoskeleton with developing interlocking membrane domains of lens fibre cells.</a> Experimental Eye Research. 77 (4), 423-432 (2003).</li>
<li>Kuwabara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+maturation+of+the+lens+cell%3A+a+morphologic+study%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The maturation of the lens cell: a morphologic study.</a> Experimental Eye Research. 20 (5), 427-443 (1975).</li>
<li>Weeber, H. A., Eckert, G., Pechhold, W., vander Heijde, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stiffness+gradient+in+the+crystalline+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Graefe%27s+Archive+for+Clinical+and+Experimental+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Stiffness gradient in the crystalline lens.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 245 (9), 1357-1366 (2007).</li>
<li>Weeber, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+mechanical+properties+of+human+lenses%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Dynamic mechanical properties of human lenses.</a> Experimental Eye Research. 80 (3), 425-434 (2005).</li>
<li>Weeber, H. A., vander Heijde, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+relationship+between+lens+stiffness+and+accommodative+amplitude%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">On the relationship between lens stiffness and accommodative amplitude.</a> Experimental Eye Research. 85 (5), 602-607 (2007).</li>
<li>Heys, K. R., Cram, S. L., Truscott, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massive+increase+in+the+stiffness+of+the+human+lens+nucleus+with+age%3A+the+basis+for+presbyopia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Massive increase in the stiffness of the human lens nucleus with age: the basis for presbyopia.</a> Molecular Vision. 10, 956-963 (2004).</li>
<li>Heys, K. R., Friedrich, M. G., Truscott, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presbyopia+and+heat%3A+changes+associated+with+aging+of+the+human+lens+suggest+a+functional+role+for+the+small+heat+shock+protein%2C+alpha-crystallin%2C+in+maintaining+lens+flexibility%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Presbyopia and heat: changes associated with aging of the human lens suggest a functional role for the small heat shock protein, alpha-crystallin, in maintaining lens flexibility.</a> Aging Cell. 6 (6), 807-815 (2007).</li>
<li>Glasser, A., Campbell, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biometric%2C+optical+and+physical+changes+in+the+isolated+human+crystalline+lens+with+age+in+relation+to+presbyopia%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Research%22%5BJournal%5D)">Biometric, optical and physical changes in the isolated human crystalline lens with age in relation to presbyopia.</a> Vision Research. 39 (11), 1991-2015 (1999).</li>
<li>Pierscionek, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+response+of+human+lenses+to+stretching+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Age-related response of human lenses to stretching forces.</a> Experimental Eye Research. 60 (3), 325-332 (1995).</li>
<li>Biswas, S. K., Lee, J. E., Brako, L., Jiang, J. X., Lo, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctions+are+selectively+associated+with+interlocking+ball-and-sockets+but+not+protrusions+in+the+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Gap junctions are selectively associated with interlocking ball-and-sockets but not protrusions in the lens.</a> Molecular Vision. 16, 2328-2341 (2010).</li>
<li>Lo, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin-0+targets+interlocking+domains+to+control+the+integrity+and+transparency+of+the+eye+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Aquaporin-0 targets interlocking domains to control the integrity and transparency of the eye lens.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (3), 1202-1212 (2014).</li>
<li>Cheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tropomyosin+3.5+protects+the+F-actin+networks+required+for+tissue+biomechanical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Tropomyosin 3.5 protects the F-actin networks required for tissue biomechanical properties.</a> Journal of Cell Science. 131 (23), (2018).</li>
<li>Cheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tropomodulin+1+regulation+of+actin+is+required+for+the+formation+of+large+paddle+protrusions+between+mature+lens+fiber+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Tropomodulin 1 regulation of actin is required for the formation of large paddle protrusions between mature lens fiber cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (10), 4084-4099 (2016).</li>
<li>Kuszak, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+lens+sutures%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The development of lens sutures.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 14 (2), 567-591 (1995).</li>
<li>Bassnett, S., Costello, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cause+and+consequence+of+fiber+cell+compaction+in+the+vertebrate+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The cause and consequence of fiber cell compaction in the vertebrate lens.</a> Experimental Eye Research. 156, 50-57 (2017).</li>
<li>Biswas, S., Son, A., Yu, Q., Zhou, R., Lo, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breakdown+of+interlocking+domains+may+contribute+to+formation+of+membranous+globules+and+lens+opacity+in+ephrin-A5%28-%2F-%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Breakdown of interlocking domains may contribute to formation of membranous globules and lens opacity in ephrin-A5(-/-) mice.</a> Experimental Eye Research. 145, 130-139 (2016).</li>
<li>Blankenship, T., Bradshaw, L., Shibata, B., Fitzgerald, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+specializations+emerging+late+in+mouse+lens+fiber+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Structural specializations emerging late in mouse lens fiber cell differentiation.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (7), 3269-3276 (2007).</li>
<li>Cheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+changes+in+eye+lens+biomechanics%2C+morphology%2C+refractive+index+and+transparency%5BTitle%5D)+AND+%22Aging%22%5BJournal%5D)">Age-related changes in eye lens biomechanics, morphology, refractive index and transparency.</a> Aging. 11 (24), 12497-12531 (2019).</li>
<li>Cheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EphA2+affects+development+of+the+eye+lens+nucleus+and+the+gradient+of+refractive+index%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">EphA2 affects development of the eye lens nucleus and the gradient of refractive index.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 63 (1), 2(2022).</li>
<li>Cheng, C., Gokhin, D. S., Nowak, R. B., Fowler, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+application+of+glass+coverslips+to+assess+the+compressive+stiffness+of+the+mouse+lens%3A+strain+and+morphometric+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Sequential application of glass coverslips to assess the compressive stiffness of the mouse lens: strain and morphometric analyses.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), e53986(2016).</li>
<li>Forrester, J. V., Dick, A. D., McMenamin, P. G., Roberts, F., Pearlman, E. Anatomy of the eye and orbit. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aForrester%2C+JV+%22The+Eye+%28Fourth+Edition%29%22">The Eye (Fourth Edition)</a>. Saunders, W. B. , 1(2016).</li>
<li>Cheng, C., Nowak, R. B., Fowler, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lens+actin+filament+cytoskeleton%3A+Diverse+structures+for+complex+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The lens actin filament cytoskeleton: Diverse structures for complex functions.</a> Experimental Eye Research. 156, 58-71 (2017).</li>
<li>Goldberg, M. W., Fiserova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogold+labeling+for+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Immunogold labeling for scanning electron microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 1474, 309-325 (2016).</li>
<li>Goldberg, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+scanning+electron+microscopy+and+immuno-gold+labeling+of+the+nuclear+lamina+and+nuclear+pore+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">High-resolution scanning electron microscopy and immuno-gold labeling of the nuclear lamina and nuclear pore complex.</a> Methods in Molecular Biology. 1411, 441-459 (2016).</li>
<li>Hermann, R., Walther, P., Muller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogold+labeling+in+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Immunogold labeling in scanning electron microscopy.</a> Histochemistry and Cell Biology. 106 (1), 31-39 (1996).</li>
<li>Gokhin, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tmod1+and+CP49+synergize+to+control+the+fiber+cell+geometry%2C+transparency%2C+and+mechanical+stiffness+of+the+mouse+lens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Tmod1 and CP49 synergize to control the fiber cell geometry, transparency, and mechanical stiffness of the mouse lens.</a> PLoS One. 7 (11), e48734(2012).</li>
</ol>

著者は何も開示していません。

このプロトコルは忠実に水晶体のさまざまな深さからの束か単一のレンズ繊維の細胞の3D膜の形態を維持する固定、保存およびimmunostaining方法を実証した。染色されたレンズファイバーは、レンズファイバー細胞の形態を研究するために長い間使用されてきたSEM調製物と比較されます。結果は、両方の調製物間で同等の膜構造を示しています。EMは依然として細胞形態を研究するためのゴールドスタンダードですが、タンパク質33、34、35を局在化するためのSEMサンプルでの免疫標識はより困難であり、イメージングには電子顕微鏡が必要です。この免疫染色法の利点は、一度に複数のターゲットを標識でき、共焦点顕微鏡で画像を収集できることです。
この方法では複雑な細胞形態が維持されますが、遺伝子変異、老化、薬物治療などにより、対照レンズ線維と変化したレンズ線維のインターディジテーションを比較するためにSEMが必要です。免疫染...

水晶体は、眼の前房にある透明な卵形組織で、上皮細胞と線維細胞1の2種類の細胞で構成されています(図1)。水晶体の前半球を覆う上皮細胞の単層があります。線維細胞は上皮細胞から分化し、水晶体の大部分を占めています。高度に特殊化された線維細胞は、伸長、分化、および成熟プログラミングを受け、水晶体周辺部から水晶体中心までの細胞膜形態の明瞭な変化を特徴とする2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 は、水晶体核とも呼ばれます。さまざまな距離から網膜に来る光を細かく焦点を合わせるレンズの機能は、剛性や弾力性などの生体力学的特性に依存します13、14、15、16、17、18、19。レンズファイバーの複雑なインターディジテーションは仮説が立てられており20,21、最近ではレンズの剛性22,23に重要であることが示されています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65638/65638fig01.jpg"> 図1:レンズの解剖図と、レンズファイバーからの代表的な走査型電子顕微鏡(SEM)画像。この漫画は、上皮細胞の前部単層(水色で網掛け)と水晶体線維細胞のバルクマス(白)の縦方向(上から下への前方から後方)の図を示しています。水晶体の中心(ピンク色)は核と呼ばれ、高度に圧縮されたファイバーセルで構成されています。右の断面図は、ハニカム状に詰め込まれたレンズファイバーの細長い六角形のセル形状を示しています。ファイバーセルには、2つの広い辺と4つの短辺があります。下部の代表的なSEM画像は、レンズの異なる深さにあるレンズファイバーセル間の複雑な膜インターディジテーションを示しています。右から、レンズ周辺部に新たに形成されたレンズファイバーは、短辺に沿って小さな突起があり、幅広側に沿ってボールとソケットがあります(赤枠)。成熟の過程で、レンズ繊維は短辺に沿った小さな突起(青いボックス)によって装飾された大きなパドルドメインを発達させます。成熟したファイバーセルは、小さな突起で示される大きなパドルドメインを持っています。これらの連動ドメインは、レンズの生体力学的特性にとって重要です。水晶体核の線維細胞は、短辺に沿った小さな突起が少なく、複雑な舌状溝の指間(紫色のボックス)を持っています。細胞の広い側面は球状膜の形態を示します。漫画は22,32から変更され、縮尺に合わせて描かれませんでした。スケールバー = 3 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65638/65638fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
水晶体は、前世代の繊維の上に新しい線維細胞の殻を重ねることによって成長する24,25。ファイバーセルは、2つの広い辺と4つの短辺を持つ細長い六角形の断面形状をしています。これらの細胞は水晶体の前極から後極まで伸びており、種によっては水晶体線維の長さが数ミリメートルになることがあります。これらの細長い細胞の構造をサポートするために、広辺と短辺に沿った特殊なインターディジテーションがインターロッキング構造を作成し、レンズの形状と生体力学的特性を維持します。線維細胞の分化および成熟中の細胞膜形状の変化は、電子顕微鏡(EM)研究によって広く記録されています2,3,4,5,6,7,8,9,10,20,26,27,28,29 .新しく形成されたファイバーセルは、その広い側面に沿ってボールとソケットを持ち、短辺に沿って非常に小さな突起を持っていますが、成熟したファイバーは短辺に沿って連動する突起とパドルを持っています。核線維は、舌状および溝状の歯状および球状膜形態を示す。これらの複雑なインターロッキングメンブレンに必要なタンパク質についてはほとんど知られていません。線維細胞におけるタンパク質の局在に関するこれまでの研究は、複雑な細胞構造を明確に可視化することができない水晶体組織切片に依存していました。
この研究は、複雑な形態を維持し、細胞膜および細胞質内のタンパク質の免疫染色を可能にするために、レンズ線維細胞の単一および束を固定する新しい方法を作成し、完成させました。この方法は、EM研究のデータに匹敵する細胞膜構造を忠実に保持し、特定のタンパク質の一次抗体で染色することができます。我々は以前、分化と成熟を経る皮質水晶体線維を免疫染色したことがある22,23。このプロトコルでは、水晶体核から繊維細胞を汚す新しい方法もあります。このプロトコルは繊維のセル成熟および水晶体の核の圧縮の間に膜のinterdigitationsの形成そして変更のためのメカニズムを理解することへの扉を開ける。

<table><tbody><tr><td>100% Triton X-100</td><td>FisherScientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>60mm plate</td><td>FisherScientific</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>16% paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>10X phosphate buffered saline</td><td>ThermoFisher</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>1X phosphate buffered saline</td><td>ThermoFisher</td><td>14190136</td><td></td></tr><tr><td>48-well plate</td><td>CytoOne</td><td>CC7672-7548</td><td></td></tr><tr><td>Cover slips (22 x 40 mm)</td><td>FisherScientific</td><td>12-553-467</td><td></td></tr><tr><td>Curved tweezers</td><td>World Precision Instruments</td><td>501981</td><td></td></tr><tr><td>Dissection microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stereo Discovery V8</td><td></td></tr><tr><td>Fine tip straight tweezers</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72707-01</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td><td>FisherScientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>LSM 800 confocal microscope with Airyscan (63X) and Zen 3.5 Software</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nail polish</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Normal donkey serum</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin (rhodamine)</td><td>ThermoFisher</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>Primary antibody</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scalpel Feather Disposable, steril, No. 11</td><td>VWR</td><td>76241-186</td><td></td></tr><tr><td>Secondary antibody</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Straight forceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>11252-40</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&nbsp;Nunc MicroWell MiniTrays (dissection tray)</td><td>FisherScientific</td><td>12-565-154</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-fine scissors</td><td>World Precision Instruments</td><td>501778</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Wheat germ agglutinin (fluorescein)</td><td>Vector Laboratories</td><td>FL-1021-5</td><td></td></tr></tbody></table>

眼球レンズの皮質および核からの束および単線維細胞の調製および免疫蛍光染色

Preparation and Immunofluorescence Staining of Bundles and Single Fiber Cells from the Cortex and Nucleus of the Eye Lens

水晶体は、眼の前房にある透明な楕円形の器官で、形を変えて網膜に光を細かく集束させ、鮮明な画像を形成します。この組織の大部分は、六角形の断面を持ち、水晶体の前極から後極まで伸びる特殊な分化した線維細胞で構成されています。これらの細長い細胞は、隣接する細胞と緊密に対向しており、細胞の長さに沿って複雑な指間があります。特殊なインターロッキング構造は、レンズの通常の生体力学的特性に必要であり、電子顕微鏡技術を用いて広範囲に説明されています。このプロトコルはこれらの複雑に定形づけられたセル内の蛋白質の詳しいローカリゼーションを可能にするためにマウス レンズ繊維のセルの単一、また束を維持し、immunostainする最初の方法を示す。代表的なデータは、水晶体のすべての領域にわたる末梢細胞、分化細胞、成熟細胞、および核線維細胞の染色を示しています。この方法は、他の種のレンズから単離されたファイバーセルに使用できる可能性があります。

水晶体線維細胞は、水晶体皮質(分化線維と成熟線維)と核から調製され、F-アクチンはファロイジン、細胞膜はWGAで染色されます。細胞の束または単一のレンズファイバーの混合物(図3)が観察され、画像化されます。水晶体皮質からは、2種類の細胞が見られます(図3A)。水晶体周辺の分化線維細胞はまっすぐで、短辺に沿って非常に小さな突起があります。細胞が分化するにつれて、繊維細胞は波状になり、小さな連動した突起が生じます。さらに、成熟プロセスに沿って、繊維細胞は小さなインターロッキング突起で飾られた大きなパドルを発達させます。マウスの水晶体では水晶体核は非常にコンパクトで剛性が高く、核水晶体線維の固定と染色の前に、柔らかい水晶体皮質を機械的に除去 することによって 単離されます。水晶体核からは、低倍率画像では容易に見ることのできない、直径が小さく、微細な膜構造を持つレンズ繊維の束が見つかります。
水晶体の異なる領域からの水晶体線維細胞の高倍率3D再構成(<s...

このプロトコルは複雑なセルにセルinterdigitationsおよび膜の構造を調査するためにimmunofluorescenceのために末梢、成熟した、および核目のレンズ繊維のセルを準備する方法を記述する。

The lens is a transparent and ellipsoid organ in the anterior chamber of the eye that changes shape to finely focus light onto the retina to form a clear ...

水晶体は眼の前房にある透明な楕円体器官で、網膜に光を細かく合わせて鮮明な画像を作り出す役割を担っています。レンズの機能は、その生体力学的特性に依存しており、レンズファイバーセル間の複雑なインターディジテーションが、レンズの剛性にとって重要であることが最近示されています。水晶体線維細胞の特殊な形態は、これまで電子顕微鏡法によって説明されてきましたが、これらのインターロッキングメンブレンに必要なタンパク質についてはほとんどわかっていません。これまでの研究は、複雑な細胞構造を明確に可視化することができない水晶体組織切片に依存していました。私たちは、特定のタンパク質の染色および共焦点顕微鏡イメージングのために、水晶体線維細胞間の複雑な膜間指を忠実に保存するための新しい技術を開発し、完成させました。このプロトコルでは、水晶体核としても知られる水晶体の中心から繊維細胞を染色する新しい方法もあります。この方法は、膜間指の形成と変化のメカニズムを研究することにより、線維細胞の分化と成熟を理解するための扉を開きます。

preparation-immunofluorescence-staining-bundles-single-fiber-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

彼らはネイティブの微小環境での進化として、多くの生物学的および臨床的状況では、細胞プロセスを研究するのが有利である。ここでは、細胞培養、動物実験、および患者の臨床試験ではリアルタイムイメージングを提供できる低コストの光ファイバ顕微鏡の組み立てと使用方法を説明します。...

高分解能光ファイバMicroendoscopy用その場で細胞イメージング

網膜刺激内の個々の電極に直接隣接する網膜細胞構築を可視化するための技術。...

ローカライズされた病理組織学的分析のための人工網膜を移植処理アイズのための技術

ここで説明するプロトコルは、全量網膜製剤の構造評価のためのものです。これには、組織解剖、親水性ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)メンブレンインサートへのマウント、蛍光マーカーによるボーラスローディング、細胞およびシナプス成分の免疫組織化学的分析のためのカルボジイミドおよびパラホルムアルデヒドによる固定の比較の説明が含まれます。...

イメージングと免疫組織化学のための網膜ホールマウントの準備のために最適化されたプロトコル

ラット網膜血管ペリサイト、すなわち、低温セクション、全体-マウント、および血管ネットワークの低張性分離の免疫組織化学的可視化のための 3...

網膜の低温電子顕微鏡セクション全体-マウント、および微小血管の免疫組織化学的可視化の低張性分離血管準備

これらのプロトコルは、皮質レンズの形態を分析するために開発された、固定および生きているレンズにおけるゼブラフィッシュレンズ縫合の構造的完全性、および前後部軸に沿ったゼブラフィッシュレンズ核の位置を測定する。...

ゼブラフィッシュレンズ核局在化と Sutural 整合性の評価

現在のプロトコルはイメージの定量化のための方法の眼球レンズの末梢構造の視覚化のための新しい全台紙のイメージ投射を記述する。これらのプロトコルは、レンズのマイクロスケール構造とレンズの発達/機能との関係をよりよく理解するための研究に使用できます。...

末梢レンズの構造、細胞形態、組織を可視化・定量化するためのホールマウントイメージング

このプロトコルは、ウサギの眼全体の高品質な凍結切片を得るための信頼性の高い方法を説明しています。ウサギの眼の解剖、固定、埋め込み、および切片化の手順を詳しく説明しており、より大きな眼の免疫組織化学を利用するあらゆる研究での使用に容易に適応できます。...

ウサギの眼全体の高品質な凍結切片の取得 

この方法は、共焦点反射顕微鏡を使用して硝子体内のコラーゲン線維の本来の構造を視覚化します。...

硝子体コラーゲン線維ネットワークを視覚化するための共焦点反射顕微鏡用のブタの目の準備

幹細胞由来の網膜色素上皮(RPE)細胞は、網膜変性のための細胞ベースの治療、疾患モデリング、薬物研究など、複数の用途に使用することができます。ここでは、幹細胞からRPEを再現性よく導出するための簡単なプロトコールを紹介します。...

幹細胞から網膜色素上皮細胞の効率的な導出

このプロトコルは、ゼブラフィッシュの胚から単一細胞を分離する方法、目的の細胞を濃縮する方法、マイクロ流体ベースの単一細胞マルチプレックスシステムでゼブラフィッシュ細胞を捕捉する方法、および単一細胞からの遺伝子発現を評価する方法を説明しています。...

ゼブラフィッシュ胚からの単一細胞の単離とキャラクタリゼーション

学ぶ 眼球レンズの皮質および核からの線維細胞を調製し、免疫蛍光染色を行う方法。複雑な細胞間相互連結と膜構造を共焦点顕微鏡で可視化し、レンズの生物力学的特性を解明する。

眼球レンズの皮質および核からの束および単線維細胞の調製および免疫蛍光染色

さらに動画を探す