Name: 線維芽細胞の活性化を研究するための3Dバイオプリンティング用フォトチューナブルハイドロゲル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-30T12:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: 学ぶ 3Dバイオプリンティング技術を用いて、光応答性ハイドロゲルで肺組織モデルを構築し、細胞外基質の硬化が線維芽細胞の活性化に与える影響を解析する方法です。慢性肺疾患の病態理解と治療開発に貢献します。

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著者らは、Adam Feinberg博士(カーネギーメロン大学)と3Dバイオプリンティングオープンソースワークショップを主催した人々に感謝の意を表したいと思います。これらの人々は、FRESHバイオプリンティングの技術を学び、これらの研究に使用される3Dバイオプリンターを構築することを可能にしました。さらに、著者らは、この原稿の図を作成するために使用された Biorender.com に感謝したいと思います。この研究は、ローズコミュニティ財団(DDHおよびCMM)、コロラド肺血管疾患研究賞(DDHおよびCMM)、全米科学財団賞1941401(CMM)、陸軍省賞W81XWH-20-1-0037(CMM)、米国国立がん研究所(NIH賞R21 CA252172(CMM)など、複数のグループまたは資金源によって支援されました。 コロラド大学アンシュッツメディカルキャンパスのルードマンファミリーセンター(DDHおよびCMM)、国立衛生研究所の国立心臓、肺、血液研究所(R01 HL080396(CMM)、R01 HL153096(CMM)、F31 HL151122(DDH)、およびT32 HL072738(DDHおよびAT)の賞。

ECM硬化に対する細胞応答をプローブするためのフォトチューナブルバイオプリントハイドロゲル

<ol><li>Ahrens, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programming+cellular+alignment+in+engineered+cardiac+tissue+via+bioprinting+anisotropic+organ+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Programming cellular alignment in engineered cardiac tissue via bioprinting anisotropic organ building blocks.</a> Advanced Materials. 34 (26), e2200217(2022).</li>
<li>Lin, N. Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+reabsorption+in+3D+vascularized+proximal+tubule+models%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Renal reabsorption in 3D vascularized proximal tubule models.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (12), 5399-5404 (2019).</li>
<li>Grigoryan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivascular+networks+and+functional+intravascular+topologies+within+biocompatible+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multivascular networks and functional intravascular topologies within biocompatible hydrogels.</a> Science. 364 (6439), 458-464 (2019).</li>
<li>Kang, Y., Datta, P., Shanmughapriya, S., Ozbolat, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+bioprinting+of+tumor+models+for+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Biomaterials%22%5BJournal%5D)">3D bioprinting of tumor models for cancer research.</a> ACS Applied Biomaterials. 3 (9), 5552-5573 (2020).</li>
<li>Davis-Hall, D., Thomas, E., Pena, B., Magin, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D-bioprinted%2C+phototunable+hydrogel+models+for+studying+adventitial+fibroblast+activation+in+pulmonary+arterial+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">3D-bioprinted, phototunable hydrogel models for studying adventitial fibroblast activation in pulmonary arterial hypertension.</a> Biofabrication. 15 (1), (2022).</li>
<li>Mirdamadi, E., Tashman, J. W., Shiwarski, D. J., Palchesko, R. N., Feinberg, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRESH+3D+bioprinting+of+a+full-size+model+of+the+human+heart%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">FRESH 3D bioprinting of a full-size model of the human heart.</a> ACS Biomaterials Science & Engineering. 6 (11), 6453-6459 (2020).</li>
<li>Shiwarski, D. J., Hudson, A. R., Tashman, J. W., Feinberg, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+FRESH+3D+printing+as+a+platform+for+advanced+tissue+biofabrication%5BTitle%5D)+AND+%22APL+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Emergence of FRESH 3D printing as a platform for advanced tissue biofabrication.</a> APL Bioengineering. 5 (1), 010904(2021).</li>
<li>Petrou, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clickable+decellularized+extracellular+matrix+as+a+new+tool+for+building+hybrid+hydrogels+to+model+chronic+fibrotic+diseases+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Clickable decellularized extracellular matrix as a new tool for building hybrid hydrogels to model chronic fibrotic diseases in vitro.</a> Journal of Materials Chemistry B. 8 (31), 6814-6826 (2020).</li>
<li>Hewawasam, R. S., Blomberg, R., Serbedzija, P., Magin, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+modification+of+human+decellularized+extracellular+matrix+for+incorporation+into+phototunable+hybrid+hydrogel+models+of+tissue+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Chemical modification of human decellularized extracellular matrix for incorporation into phototunable hybrid hydrogel models of tissue fibrosis.</a> ACS Applied Materials & Interfaces. 15 (12), 15071-15083 (2023).</li>
<li>Saleh, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+hybrid+hydrogels+comprised+healthy+or+diseased+decellularized+extracellular+matrix+to+study+pulmonary+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Engineering hybrid hydrogels comprised healthy or diseased decellularized extracellular matrix to study pulmonary fibrosis.</a> Cellular and Molecular Bioengineering. 15 (5), 505-519 (2022).</li>
<li>Guvendiren, M., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stiffening+hydrogels+to+probe+short-+and+long-term+cellular+responses+to+dynamic+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Stiffening hydrogels to probe short- and long-term cellular responses to dynamic mechanics.</a> Nature Communications. 3, 792(2012).</li>
<li>Rosales, A. M., Vega, S. L., DelRio, F. W., Burdick, J. A., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+with+reversible+mechanics+to+probe+dynamic+cell+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition+English%22%5BJournal%5D)">Hydrogels with reversible mechanics to probe dynamic cell microenvironments.</a> Angewandte Chemie International Edition English. 56 (40), 12132-12136 (2017).</li>
<li>Wynn, T. A., Ramalingam, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+fibrosis%3A+therapeutic+translation+for+fibrotic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of fibrosis: therapeutic translation for fibrotic disease.</a> Nature Medicine. 18 (7), 1028-1040 (2012).</li>
<li>Huertas, A., Tu, L., Humbert, M., Guignabert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+inflammation+within+the+vascular+wall+in+pulmonary+arterial+hypertension%3A+more+than+a+spectator%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Chronic inflammation within the vascular wall in pulmonary arterial hypertension: more than a spectator.</a> Cardiovascular Research. 116 (5), 885-893 (2020).</li>
<li>Kendall, R. T., Feghali-Bostwick, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+in+fibrosis%3A+novel+roles+and+mediators%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts in fibrosis: novel roles and mediators.</a> Frontiers in Pharmacology. 5, 123(2014).</li>
<li>Parker, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrotic+extracellular+matrix+activates+a+profibrotic+positive+feedback+loop%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Fibrotic extracellular matrix activates a profibrotic positive feedback loop.</a> The Journal of Clinical Investigation. 124 (4), 1622-1635 (2014).</li>
<li>Habiel, D. M., Hogaboam, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+fibroblast+proliferation+and+survival+in+idiopathic+pulmonary+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in fibroblast proliferation and survival in idiopathic pulmonary fibrosis.</a> Frontiers in Pharmacology. 5, 2(2014).</li>
<li>Hu, C. J., Zhang, H., Laux, A., Pullamsetti, S. S., Stenmark, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+contributing+to+persistently+activated+cell+phenotypes+in+pulmonary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms contributing to persistently activated cell phenotypes in pulmonary hypertension.</a> The Journal of Physiology. 597 (4), 1103-1119 (2019).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+fibroblasts+with+a+proinflammatory+epigenetically+altered+phenotype+in+severe+hypoxic+pulmonary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Emergence of fibroblasts with a proinflammatory epigenetically altered phenotype in severe hypoxic pulmonary hypertension.</a> The Journal of Immunology. 187 (5), 2711-2722 (2011).</li>
<li>Hinton, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+printing+of+complex+biological+structures+by+freeform-reversible+embedding+of+suspended+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform-reversible embedding of suspended hydrogels.</a> Science Advances. 1 (9), e1500758(2015).</li>
<li>Brown, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+photocrosslinking+of+click+hydrogels+to+probe+myoblast+mechanotransduction+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Secondary photocrosslinking of click hydrogels to probe myoblast mechanotransduction in three dimensions.</a> Journal of the American Chemical Society. 140 (37), 11585-11588 (2018).</li>
<li>Ondeck, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamically+stiffened+matrix+promotes+malignant+transformation+of+mammary+epithelial+cells+via+collective+mechanical+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dynamically stiffened matrix promotes malignant transformation of mammary epithelial cells via collective mechanical signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3502-3507 (2019).</li>
<li>Caliari, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stiffening+hydrogels+for+investigating+the+dynamics+of+hepatic+stellate+cell+mechanotransduction+during+myofibroblast+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Stiffening hydrogels for investigating the dynamics of hepatic stellate cell mechanotransduction during myofibroblast activation.</a> Scientific Reports. 6, 21387(2016).</li>
<li>Liu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feedback+amplification+of+fibrosis+through+matrix+stiffening+and+COX-2+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Feedback amplification of fibrosis through matrix stiffening and COX-2 suppression.</a> Journal of Cell Biology. 190 (4), 693-706 (2010).</li>
<li>Tschumperlin, D. J., Ligresti, G., Hilscher, M. B., Shah, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensing+and+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Mechanosensing and fibrosis.</a> The Journal of Clinical Investigation. 128 (1), 74-84 (2018).</li>
<li>Chelladurai, P., Seeger, W., Pullamsetti, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinases+and+their+inhibitors+in+pulmonary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinases and their inhibitors in pulmonary hypertension.</a> European Respiratory Journal. 40 (3), 766-782 (2012).</li>
<li>Caracena, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+epithelial+cells+and+microenvironmental+stiffness+synergistically+drive+fibroblast+activation+in+three-dimensional+hydrogel+lung+models%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials+Science%22%5BJournal%5D)">Alveolar epithelial cells and microenvironmental stiffness synergistically drive fibroblast activation in three-dimensional hydrogel lung models.</a> Biomaterials Science. 10 (24), 7133-7148 (2022).</li>
<li>Ruskowitz, E. R., DeForest, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome-wide+analysis+of+cellular+response+to+ultraviolet+light+for+biomaterial+synthesis+and+modification%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">Proteome-wide analysis of cellular response to ultraviolet light for biomaterial synthesis and modification.</a> ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (5), 2111-2116 (2019).</li>
<li>Kruse, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+pH+on+cell+viability%2C+cell+migration%2C+cell+proliferation%2C+wound+closure%2C+and+wound+reepithelialization%3A+In+vitro+and+in+vivo+study%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">The effect of pH on cell viability, cell migration, cell proliferation, wound closure, and wound reepithelialization: In vitro and in vivo study.</a> Wound Repair and Regeneration. 25 (2), 260-269 (2017).</li>
<li>Filippi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusable+biohybrid+designs+for+bioprinted+skeletal+muscle+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Perfusable biohybrid designs for bioprinted skeletal muscle tissue.</a> Advanced Healthcare Materials. , e1500758(2023).</li>
<li>Matthiesen, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+3D+culture+and+bioprinting+using+peptide-functionalized+hyaluronan+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Science+and+Technology+of+Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Astrocyte 3D culture and bioprinting using peptide-functionalized hyaluronan hydrogels.</a> Science and Technology of Advanced Materials. 24 (1), 2165871(2023).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioprinting+a+skin+patch+with+dual-crosslinked+gelatin+%28GelMA%29+and+silk+fibroin+%28SilMA%29%3A+An+approach+to+accelerating+cutaneous+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Today+Bio%22%5BJournal%5D)">Bioprinting a skin patch with dual-crosslinked gelatin (GelMA) and silk fibroin (SilMA): An approach to accelerating cutaneous wound healing.</a> Materials Today Bio. 18, 100550(2023).</li>
<li>Bliley, J. M., Shiwarski, D. J., Feinberg, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D-bioprinted+human+tissue+and+the+path+toward+clinical+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">3D-bioprinted human tissue and the path toward clinical translation.</a> Science Translational Medicine. 14 (666), eabo7047(2022).</li>
</ol>

制御された光照射に応答する二段重合反応は、空間的および時間的制御によって生体材料を硬化させることができます。いくつかの研究では、この手法を利用して、さまざまなプラットフォーム5、8、9、10、11、21、22、23での細胞とマトリックスの相互作用を評価しています。より具体的には、フォトマスクまたは2光子励起法を使用して、3Dバイオプリントされたコンストラクトの個別のセクションを硬化させ、以前の出版物5,8...

3Dバイオプリンティングは、研究者が細胞や生体材料を3Dボリューム内に正確に堆積させ、生体組織の複雑な階層構造を再現することを可能にする革新的な技術です。過去10年間で、3Dバイオプリンティングの進歩により、鼓動するヒト心臓組織1、腎臓組織の機能モデル2、肺内のガス交換モデル3、がん研究用の腫瘍モデル4が作成されました。懸濁ハイドロゲルのフリーフォーム可逆埋め込み(FRESH)バイオプリンティングなどの組み込み3Dバイオプリンティング技術の発明により、肺血管5 やヒトの心臓6 などの複雑な軟部組織構造を3Dで再現することが可能になりました。 FRESH 3Dバイオプリンティングは、せん断希釈サポートバスへの押し出しにより、軟質および低粘度のバイオインクの層ごとの印刷を容易にします。サポートバスは、ビンガムプラスチックとして機能し、印刷後にバイオインクの意図した形状と構造を維持する、密集したゼラチン微粒子などの材料で構成されています。プリントされた構造物が固まったら、温度を37°Cに上げることでサポートバスを溶解することができます7。
最近の総説では、FRESH技術を使用してさまざまな出版物で3Dバイオプリントされた材料がまとめられています。これらの天然由来の物質は、I型コラーゲンからメタクリル化ヒアルロン酸まで多岐にわたり、いくつかの異なるゲル化メカニズムを表しています7。この3Dバイオプリンティング技術を使用して行われるほとんどの調査研究は、外部刺激に反応して変化しない静的な生体材料を使用しています。動的光可変ハイドロゲル生体材料は、さまざまな線維性疾患をモデル化するために、私たちの研究室や他の研究室で使用されています8,9,10,11,12。静的な生体材料とは異なり、光可変バイオインクでは、弾性率の低い軟化モデルを作成し、後で硬化させて、微小環境硬化の増加に対する細胞応答を調べることができます。
線維性疾患は、瘢痕化や硬化を引き起こす可能性のある細胞外マトリックス産生の増加を特徴としています13。組織の硬化は、影響を受けた組織のさらなる損傷と破壊を引き起こし、永久的な臓器損傷や死に至ることさえあります。線維化疾患は、世界の死亡率の3分の1を占めています。線維芽細胞は、この疾患状態で過剰で異常な細胞外マトリックスを産生します14,15。線維芽細胞の増殖の増加および細胞外マトリックスの沈着は、組織をさらに硬化させ、原線維化促進性の正のフィードバックループを活性化する16,17,18,19。線維芽細胞の活性化を研究することは、線維性疾患を理解するために不可欠です。ここでは、ヒト肺動脈性肺高血圧症(PAH)を線維化疾患の例として紹介し、3Dバイオプリンティングを使用して血管の3D形状を模倣し、光波長可変ハイドロゲルの動的硬化能力を紹介します。PAHは、主肺動脈の圧力が正常レベルを超え、心臓に負担がかかり、ヒト肺動脈外膜線維芽細胞(HPAAF)の活性化を増加させ、血管組織を硬化させる状態です16,17,18,19。光可変ポリ(エチレングリコール)-αメタクリレート(PEGαMA)バイオインク製剤は、コンストラクトの経時的な硬化を可能にし、健康な組織と疾患の進行の両方をモデル化するのに役立ちます5,8,9,10。このユニークな特徴を利用することで、微小環境硬化に応答したHPAAFの活性化と増殖を3Dで定量化することができ、この疾患に関与する細胞メカニズムに関する貴重な洞察が得られる可能性があります。ここで説明するプロトコルにより、研究者は、疾患の進行または組織修復中の細胞外微小環境の変化を再現する3Dモデルを作成し、線維芽細胞の活性化を研究することができます。

<table><tbody><tr><td>AccuMax 放射計/光度計キット</td><td>Spectronics Corporation</td><td>XPR-3000</td><td>光強度の測定、光硬化</td></tr>酢<tr><td>酸に使用&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP2401-500</td><td>PEGaMA合成時に使用</td></tr><tr><td>アセトン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A184</td><td>クライオ切片と一緒に使用</td></tr><tr><td>ActinGreen 488 ReadyProbes</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>R37110</td><td></td></tr><tr><td>アルミホイル</td>の染色に使用 <td>レイノルズ</td><td>F28028</td><td></td></tr><tr><td>無水テトラヒドロフラン(THF)</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>401757-1L</td><td>使用PEGaMA合成中</td></tr><tr><td>アルゴン圧縮ガス</td><td>エアガス</td><td>AR R300</td><td>PEGaMA合成中使用</td></tr><tr><td>8 アーム ポリ(エチレングリコール)-ヒドロキシル (PEG-OH)</td><td>JenKem テクノロジー</td><td>8ARM-PEG-10K</td><td>PEGaMA合成中</td></tr>使用 <tr><td>365 nm バンドパスフィルター</td><td>エドモンド・オプティクス</td><td>65-191</td> ウシ血清アルブミン(BSA)の<td>光硬化に使用</td></tr>フィ<tr><td></td><td>ッシャー・サイエンティフィック</td><td>BP9700-100</td><td>染色プロセスで使用</td></tr><tr><td>ブフナーファンネル</td><td>クォークガラス</td><td>QFN-8-14</td><td>PEGaMA合成で使用</td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>Invitrogen</td><td>65-0853-39</td><td>染色プロセスで使用</td></tr><tr><td>Celite 545 (ろ過助剤)</td> <td>EMD Millipore</td><td>CX0574-1</td><td>PEGaMA合成で使用</td></tr><tr><td>チャージ顕微鏡スライド</td><td>Globe Scientific</td><td>1358W</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム-d</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>151823-10X0.75ML</td><td>PEGaMA</td></tr><tr><td>Click-iT Plus EdU 細胞増殖キット</td>の特性評価に使用 <td>Invitrogen</td><td>C10637</td><td></td></tr><tr><td>50 mL コニカルチューブの</td>染色に使用 <td>CELLTREAT</td><td>667050B</td><td></td></tr><tr><td>極低温安全キット</td><td>コールパーマー</td><td>EW-25000-85</td><td></td></tr><tr><td>クライオスタット</td><td>ライカ</td><td>CM 1850-3-1</td><td></td></tr><tr><td>透析チューブ</td><td>Repligen</td><td>132105</td><td></td></tr><tr><td>4',6-ジアミジノ-2-フィリンドール (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-1MG</td><td></td></tr><tr><td>ジエチルエーテル</td>の染色に使用 <td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>E1384</td><td>PEGaMA合成中に使用</td></tr><tr><td>1,4-ジチオスレイトール(DTT)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10197777001</td><td>Bioinkコンポーネント</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Cytiva</td><td>SH30271.</td><td></td>FS</tr><tr><td>濾紙</td><td>Whatman</td><td>1001-090</td><td>PEGaMA合成中に使用</td></tr><tr><td>Freezone 2.5L 凍結乾燥システム</td><td>Labconco</td><td>LA-2.5LR</td><td>凍結乾燥機</td></tr><tr><td>Fusion 360</td><td>Autodesk</td><td>N/A</td><td>ソフトウェアダウンロード</td></tr><tr><td>2.5 mL ガスタイトシリンジ</td><td>ハミルトン</td><td>81420</td><td>バイオプリンティングに使用</td></tr><tr><td>15ゲージ 1.5インチ ITシリーズ ヒント</td><td>Jensen Global</td><td>JG15-1.5X</td><td>バイオプリンティングに使用</td></tr><tr><td>30ゲージ 0.5インチ HPシリーズ チップ</td><td>ジェンセングローバル</td><td>JG30-0.5HPX</td><td>バイオプリンティングに使用</td></tr><tr><td>ヤギ アンチマウス アレクサ フルーオ 555 抗体</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>A21422</td><td>染色に使用</td></tr><tr><td>グリシン</td><td>・フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>・サイエンティフィック C2H5NO2</td><td>染色プロセス中に使用</td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>1461</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Thermo Scientific</td><td>62249</td><td>染色プロセス中に使用</td></tr><tr><td>ヒト肺動脈外膜線維芽細胞 (HPAAF)</td><td>AcceGen</td><td>ABC-TC3773&nbsp;</td><td>2歳の男性患者様から</td></tr><tr><td>塩酸 (HCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-500</td><td>溶液のpH調整に使用</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health (NIH)</td><td>N/A</td><td>フリーソフトのダウンロード</td></tr><tr><td>ImmEdge&reg;ペン</td><td>ベクトル研究所</td><td>H-4000</td><td>染色プロセス中に使用されます</td></tr><tr><td>インキュベーター</td><td>VWR</td><td>VWR51014991</td><td></td></tr><tr><td>LifeSupport ゼラチン 微粒子スラリー (ゼラチン スラリー)</td><td>高度なバイオマトリックス</td><td>5244-10GM</td><td>バイオプリンティングに使用されます</td></tr><tr><td>光学顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>CKX53</td><td>倒立光学顕微鏡</td></tr><tr><td>リチウム フェニル-2,4,6-トリメチルベンゾイルホスフィン酸 (LAP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>900889-5G</td><td>光硬化剤</td></tr><tr><td>液体窒素</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>LulzBot Mini 2&nbsp;</td><td>LulzBot</td><td>N/A</td><td>Bioprinter adapted</td></tr><tr><td>Methacryloxyethyl Thiocarbamoyl Rhodamine B&nbsp;</td><td>株式会社ポリサイエンス</td><td>669775-30-8</td><td></td></tr><tr><td>2-メチルブタン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M32631-4L</td><td></td></tr><tr><td>Microman キャピラリー ピストン CP1000</td><td>VWR</td><td>76178-166</td><td>容積式ピペットチップ</td></tr><tr><td>MMP2 分解性架橋剤 (KCGGPQGIWGQGCK)</td> <td>GL Biochem</td><td>N/A</td><td>Bioink コンポーネント</td></tr><tr><td>マウス アンチヒト &SMA モノクローナル抗体</td><td>Fisher Scientific</td><td>MA5-11547</td><td>染色に使用</td></tr><tr><td>OmniCureシリーズ2000</td><td>&nbsp;パラ</td>ホルムアルデヒド(PFA)の<td>フォトスティフニングに使用されるLumen</td>Dynamics <td>S2000-XLA</td> UV光源</tr><tr><td>&nbsp;</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>15710</td><td>サンプルの固定に使用</td></tr><tr><td>pHメーター</td><td>メトラー・トレド&nbsp;</td><td>FP20&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>pHストリップ</td><td>Cytiva</td><td>10362010</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Hyclone Laboratories, Inc.</td><td>Cytiva SH30256.</td><td></td>FS</tr><tr><td>ピペットセット</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-388-100</td><td></td></tr><tr><td>10 &micro;Lピペットのヒント</td><td>USAサイエンティフィック</td><td>1120-3710</td><td></td></tr><tr><td>20 &micro;Lピペットチップ</td><td>USAサイエンティフィック</td><td>1183-1510</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro;Lピペットチップ</td><td>USAサイエンティフィック</td><td>1111-0700</td><td></td></tr><tr><td>1000 &micro;L ピペットチップ</td><td>USA Scientific</td><td>1111-2721</td><td></td></tr><tr><td>ポリ(エチレングリコール) - アルファメタクリレート( PEG&alpha ;MA)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>合成ステップの原稿を参照してください</td></tr><tr><td>ポリ(エチレンオキシド) (PEO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>372773-250G</td><td>バイオインク成分</td></tr><tr><td>容積式ピペット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td>FD10004G 100-1000 & マイクロ;L</td></tr><tr><td>水酸化カリウム (KOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221473-500G</td><td>pH調整液</td></tr><tr><td>ProLong Gold 退色防止剤</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td> 染色<td>プロセスで使用</td></tr><tr><td>Pronterface</td><td>All3DP</td><td>N/A</td><td>ソフトウェア ダウンロード</td></tr><tr><td>ヨウ化プロピジウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4864-10ML</td><td></td></tr><tr><td>RGDペプチド(CGRGDS)</td>の染色に使用<td>GL Biochem</td><td>N/A</td><td>Bioinkコンポーネント</td></tr><tr><td></td><td>ロッカーVWR</td><td>10127-876</td><td></td></tr><tr><td>ロータリーエバポレーター&nbsp;</td><td>Thomas Scientific</td><td>11100V2022</td><td>PEGaMA合成中に使用</td></tr><tr><td>ラバーバンド</td><td>ステープル</td><td>808659</td><td></td></tr><tr><td>Schlenk Flask&nbsp;</td><td>Kemtechアメリカ</td><td>F902450</td><td>PEGaMA合成中に使用</td></tr><tr><td>Slic3r</td><td>Slic3r</td><td>N/A</td><td>ソフトウェアのダウンロード</td></tr><tr><td>平滑筋細胞増殖培地-2 (SmGM-2) BulletKit</td><td>ロンザ</td><td>CC-3182</td><td>キットにはCC-3181およびCC-4149コンポーネントが含まれています</td></tr><tr><td>水素化ナトリウム&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223441-50G</td><td>PEGaMA合成中に使用</td></tr><tr><td>Sorvall ST 40R 遠心分離機</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>75-004-525</td><td></td></tr><tr><td>攪拌子</td><td>VWR</td><td>58948-091</td><td></td></tr><tr><td>シリンジフィルター</td><td>VWR</td><td>28145-483</td><td>フィルター溶液の滅菌に使用</td></tr><tr><td>T-75 組織培養処理フラスコ</td><td>VWR</td><td>82050-856</td><td>細胞培養作業</td></tr><tr>に使用<td>Tissue-Tek Cyromold</td><td>Sakura</td><td>4557</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T化合物 (OCT)</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Tris(2-Carboxyethyl) Phosphine (TCEP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4706-2G</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>C34H622O11</td><td>染色プロセスに使用</td></tr><tr><td>トリパンブルー</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154-20ML</td><td>細胞培養に使用作業</td></tr><tr><td>0.05% トリプシン-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25-300-062</td><td>細胞培養作業に使用</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>C58H114O26</td><td>染色プロセス中に使用</td></tr><tr><td>正立顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>BX63F</td><td>蛍光顕微鏡機能</td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>PolyScience</td><td>WBE20A11B</td><td></td></tr><tr><td>24ウェル 組織培養プレート</td><td>コーニング</td><td>3527</td><td></td></tr></tbody></table>名

線維芽細胞の活性化を研究するための3dバイオプリンティング用フォトチューナブルハイドロゲル

3D Bioprinting Phototunable Hydrogels to Study Fibroblast Activation

フォトチューナブルハイドロゲルは、光曝露に応答して空間的および時間的に変化します。これらのタイプの生体材料を細胞培養プラットフォームに組み込み、微小環境の剛性を高めるなどの変化を動的に引き起こすことで、研究者は線維性疾患の進行中に発生する細胞外マトリックス(ECM)の変化をモデル化することができます。本明細書では、ゼラチン支持体浴内で2つの連続重合反応が可能な光可変ヒドロゲル生体材料を3Dバイオプリンティングする方法を提示する。懸濁ハイドロゲルのフリーフォーム可逆的包埋(FRESH)バイオプリンティングの手法は、マイケル付加反応を促進するためにサポートバスのpHを調整することによって適応されました。まず、ポリ(エチレングリコール)-αメタクリレート(PEGαMA)を含むバイオインクを非化学量論的に細胞分解性架橋剤と反応させ、ソフトハイドロゲルを形成しました。これらの軟質ハイドロゲルは、後に光開始剤と光に曝露され、未反応基のホモ重合を誘導し、ヒドロゲルを硬くしました。このプロトコルは、ハイドロゲル合成、3Dバイオプリンティング、光硬化、および3D構造内の線維芽細胞の活性化を評価するためのエンドポイントの特性評価をカバーしています。今回紹介する手法により、研究者はpH触媒による重合反応を起こすさまざまな材料を3Dバイオプリントすることができ、組織の恒常性、疾患、修復のさまざまなモデルを設計するために実装することができます。

このプロトコルは、サポートバス内の光可変ヒドロゲルを3Dバイオプリントして、人間の組織を模倣する形状の線維芽細胞の活性化を研究するための動的および一時的な硬化が可能な構造物を作成する方法について説明します。まず、このプロトコルでは、この光可変ポリマー系のバックボーンであるPEGαMAを合成する方法が説明されました。核磁気共鳴(NMR)分光法測定では、96.5%でPEGαMAの官能基化に成功しました(図1)。この手順では、90% 以上の機能化値が許容されます。次に、肺血管系を模倣した中空円柱の3D CADモデルの作成方法について詳しく説明します。ダウンロード可能な3D CADモデルは補足 ファイル1で提供され 、この設計に関連するGコードは 補足ファイル2で入手できます。このCADモデルでは、高さ4mm、内径4mm、肉厚300μmの寸法の構造物を作成しました。
バイオプリンターのセットアップ手順を示します(図2</s...

本稿では、フォトチューナブルハイドロゲルを3Dバイオプリントして、細胞外マトリックスの硬化と線維芽細胞の活性化を研究する方法について説明します。

線維芽細胞の活性化を研究するための3Dバイオプリンティング用フォトチューナブルハイドロゲル

Phototunable hydrogels can transform spatially and temporally in response to light exposure. Incorporating these types of biomaterials in cell-culture ...

私たちは、肺組織の3Dモデルを設計し、世界が呼吸を楽にできるようにしました。私たちの使命は、3D生体材料と3Dプリンティングなどの技術を使用して、慢性肺疾患の原因とこれらの状態をより適切に治療する方法を理解するのに役立つプラットフォームを構築することです。私たちの研究における実験上の課題の1つは、柔らかい材料を複雑な形状に3Dプリントすることの難しさです。バイオインクと組織薄化サポートバスを印刷することで、細胞を正確に堆積させ、印刷プロセス中に細胞の形状を維持するのに役立ちます。当社の生体材料は、実験の全過程を通じてサンプルの機械的特性を制御します。この製剤により、研究者は健康な肺組織と病気の肺組織の両方の硬さに一致するハイドロゲルで細胞を成長させることができます。ユーザーは、サンプルを硬くするタイミングを決定し、細胞応答を測定できます。このプロトコルで使用される光チューナブル生体材料は、軟化モデルの作成を可能にし、後で硬化させて微小環境硬化に対する細胞応答を調べることができます。フォトチューナブルな生体材料の代わりに静的な生体材料を使用する同様の手法では、プリント後に硬化できないモデルが得られます。私たちの研究室の他の研究の結果は、性別と年齢が肺疾患の進行に重要な役割を果たしていることを示唆しています。将来のモデルでは、これらの変数を研究し、細胞固有の層を追加するなど、より複雑なものが含まれる予定です。これらの取り組みを組み合わせることで、よりリアルなバイオプリントが得られ、線維性疾患の新しい治療法が生まれます。

3d-bioprinting-phototunable-hydrogels-to-study-fibroblast-activation

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

bioprinter、犠牲型に基づいてパターン化されたハイドロゲルを作成するために使用された。ポロキサマー型は第二のヒドロゲルで埋め戻した後、溶出し、第三のハイドロゲルを充填した空隙を残していた。この方法では、生体高分子から複雑なアーキテクチャを生成する高速溶出及びポロキサマーの良い印刷適性を使用しています。...

模様の作成3D細胞培養のための2つの成分​​のために温度応答性ハイドロゲルリバース金型の印刷

我々は、一緒に機能し、生存可能な3次元組織構築物はインビトロスクリーニング用途に使用するためbioprinted可能な組織を模倣ヒドロゲルbioinkを提供するプロトコルのセットを記述する。...

Bioprinting細胞化は、組織特異的ヒドロゲルBioinkを使用して構築します

蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）画像化は、リアルタイム細胞生物学研究のための強力なツールです。ここで、従来の落射蛍光顕微鏡を用いて生理学的3次元（3D）ヒドロゲル微小環境におけるFRETイメージング細胞のための方法が提示されます。活性範囲にわたって線形比率をもたらすレシオメトリックFRETプローブの分析が記載されています。...

三次元ハイドロゲルでイメージングをFRET

軟骨や皮膚類似したナノセルロース アルギン酸ベース bioink を使用して bioprinted。Bioinks は、シングル ステップのパッシブ混合ユニットを介して印刷する前に cellularized いた。構成要素は、均一に cellularized...

軟骨と皮膚組織類縁ミキシング ユニット Bioink Precellularization の小説のパッシブ バイオプリンティング

Bioprintable アルギン酸/ゼラチン bioink...

Bioprintable アルギン酸/ゼラチン ゲル 3 Dの in Vitroモデル システム細胞スフェロイドの形成を誘導します。

ここで提示するゼラチンメタクリロイルの3Dバイオプリンティングのための方法である。...

ゼラチンメタクリロイルヒドロゲルベースバイオインクの3Dバイオプリンティングのプロトコル

ここでは、封入細胞の沈沈を防ぐために、液体状バイオインク(低粘度のゼラチンメタクリロイル)に対する新しい多層改変戦略を開発しました。...

均質な細胞分布のための三次元バイオプリンティングにおける多層ヒドロゲルバイオインクの使用

提示された方法は、ライブ共焦点顕微鏡を可能にしながら、シリコーンゴムに埋め込まれた3Dソフトヒドロゲルの単軸ストレッチを含む。繊維のアライメントと同様に、外部および内部ヒドロゲル株の特性評価が実証されている。開発された装置およびプロトコルはさまざまなひずみのレジームに対する細胞の応答を査定できる。...

ライブ顕微鏡イメージング下での3Dヒドロゲルの制御株

ヒドロゲル形成中のせん断処理は、剪断薄いが剪断力の除去後に急速に再構築するミクロゲル懸濁液の生成をもたらす。このような材料は、バイオプリンティング複合体、細胞を含んだ構造のための支持マトリックスとして使用されてきた。ここでは、支持床および適合バイオインクを製造するために使用される方法が説明される。...

懸濁3Dバイオプリンティングのためのゲル化中のせん断処理によって形成されたアガロース流体ゲル

κ-カラギーナンサブマイクロゲル培地を用いた組織様構造の埋め込みバイオプリンティング

学ぶ 3Dバイオプリンティング技術を用いて、光応答性ハイドロゲルで肺組織モデルを構築し、細胞外基質の硬化が線維芽細胞の活性化に与える影響を解析する方法です。慢性肺疾患の病態理解と治療開発に貢献します。

線維芽細胞の活性化を研究するための3Dバイオプリンティング用フォトチューナブルハイドロゲル

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