ナイーブおよびエフェクターCD8 T細胞のミトコンドリア機能の測定

当研究室では、リンパ球による免疫寛容、免疫サーベイランス、抗原受容体シグナル伝達について研究しています。リゾホスファチジン酸は、エフェクター細胞の代謝柔軟性を低下させることにより、CD8 T細胞の細胞毒性を促進し、末梢耐性を促進することを見出しました。私たちは、CD8 T細胞のミトコンドリア代謝とエネルギー容量を測定する技術を使用しています。

私たちの研究室では、リゾホスファチジン酸がCD8 T細胞の代謝適応度を調節し、T細胞表現型の重要な決定因子である可能性があることを示しました。ここで説明するプロトコルは、T細胞受容体シグナル伝達の機能代謝と生体エネルギーをリアルタイムで評価します。まず、ユーティリティプレートの各ウェルに200マイクロリットルの蒸留水を追加します。

ユーティリティプレートの上にセンサーカートリッジを置き、センサーカートリッジの端が水没して適切な水分補給が可能になるようにします。ユーティリティプレートとセンサーカートリッジを摂氏37度で、非二酸化炭素インキュベーターで最低10時間インキュベートします。次に、50ミリリットルのコニカルチューブに50ミリリットルのキャリブラント溶液を充填し、インキュベートします。

翌日、プレートをフリックして蒸留水を取り除きます。プレートを200マイクロリットルのキャリブラントで再水和します。センサーカートリッジをユーティリティプレートの上部に戻し、ユーティリティプレートを非二酸化炭素インキュベーターに戻します。

次に、マルチチャンネルピペットを使用して、1,000万個のCD8 T細胞を4.5ミリリットルの完全培地に再懸濁します。懸濁液の90マイクロリットルを各ウェルにピペットで固定し、続いて前処理中にウェルあたり指定された媒体の90マイクロリットルをピペットで取り付けます。180マイクロリットルの完全な培地をコーナーウェルにピペットで移し、蒸発を防ぎます。

次に、CD8 T細胞を入れたマイクロプレートを非二酸化炭素インキュベーターに入れます。プレートアダプターをセンサーカートリッジにしっかりと取り付けます。インキュベーション後、プレートアダプターを使用して、オリゴマイシン、FCCP、ロテノン、およびアンチマイシンAをそれぞれのポートにピペットで挿入します。

アッセイ開始の1時間前に、マイクロプレートを非二酸化炭素インキュベーターに入れます。ソフトウェアを開き、マイクロプレートをロードする30分前に装置アナライザーを校正します。ウェルにラベルを付け、ソフトウェアシステムで注入スキームを確認します。

次に、キャリブレーション中にセンサーカートリッジを機器にロードします。ソフトウェアでアッセイを実行します。追加の注入の場合は、注入用の追加のチャンバーを使用して注入スキームを変更します。

アンチCD3とアンチCD28をセンサーカートリッジのポートAにロードします。オリゴマイシンをポートBに、FCCPをポートCに、ロテノンとアンチマイシンAをポートDにロードします。個々の抗CD3および抗CD28刺激については、20マイクロリットルのビオチン化抗CD3を1ミリリットルあたり10マイクログラムでセンサーカートリッジの指定ウェルにピペットで入れます。20マイクロリットルの抗CD28とストレプトアビジンを指定されたウェルにピペットで移します。

抗CD3またはCD28刺激のために、ビオチン化抗CD3、抗CD28、およびストレプトアビジンの20マイクロリットルを結合し、指定されたウェルにピペットで入れます。培地を注入してコントロールウェルを調製します。抗CD3およびCD-28の結合された刺激のために、細胞への1対1のビーズの比率を使用し、反CD3 CD-28磁気ビーズの5マイクロリットルを井戸ごとの200、000の細胞を含んで指定の井戸にピペットで分ける。

注射専用の培地でコントロールウェルを調製します。各ポートの毒物を調整して、注入後の最終的な濃度を達成します。マイクロプレートを装置にロードする前に、注入スキームに更新された時点が反映されていることを確認してください。

急性TCR刺激アッセイを合計140分間実行するようにソフトウェアをプログラムします。オリゴマイシンを注入する前の 10 回の時点測定が含まれるようにスキームを変更します。ビオチン化抗CD3および/または抗CD28とストレプトアビジン、抗CD3および/またはCD-28磁気ビーズ刺激を用いた急性TCR刺激は、培地のみの対照と比較して、酸素消費率および細胞外酸性化率の増加をもたらした。

抗CD3およびCD-28磁気ビーズ刺激は、ビオチン化抗CD3およびCD-28注射に匹敵する代謝反応を示し、酸素消費率と細胞外酸性化速度が同様に増加しました。